Análisis del contenido proteico, gelatina, en papel como soporte de los documentos del Monasterio de Guadalupe
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- María Carmen Flores Álvarez
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1 Análisis del contenido proteico, gelatina, en papel como soporte de los documentos del Monasterio de Guadalupe MARÍA PAZ FERNÁNDEZ Centro de Investigaciones Biológicas. CSIC CARMEN MARTÍN DE HIJAS IPHE NIEVES VALENTÍN IPHE JESÚS DEL MAZO Centro de Investigaciones Biológicas. CSIC Introducción Las proteínas integran un grupo importante de las llamadas sustancias filmógenas que abarca productos de amplio uso en obras de arte. Los más comunes son los aglutinantes, adhesivos, barnices y gelatinas. Las proteínas también se encuentran mayoritariamente en la composición de un variado grupo de soportes históricos como pergaminos, cueros, textiles en seda, fotografías, colecciones de historia natural. Cada proteína tiene una composición fija en número y secuencia de aminoácidos. De acuerdo a su composición, podemos considerar la presencia de proteínas simples y proteínas compuestas. Las primeras están formadas por aminoácidos exclusivamente, es el caso de las albúminas, como la ovoalbúmina de la clara de huevo, las escleroproteínas que incluyen la fibroína de la seda, la elastina, o el colágeno de los tejidos conjuntivos, óseos y cartilaginosos. El calentamiento suave del colágeno en agua origina una dispersión coloidal llamada cola, la cual una vez purificada y seca da lugar a la gelatina. Las proteínas compuestas están formadas por aminoácidos y grupos prostéticos. Un ejemplo es la caseína de la leche. Se ha descrito (Barrett y col., 1995) que la gelatina comenzó a aplicarse al papel para evitar el «sangrado» o pérdida de las tintas. Este tratamiento comienza a utilizarse en 1400 y se hace extensivo hasta el año La gelatina mejora las propiedades físicas del papel, especialmente la resistencia a la abrasión. También se ha demostrado que la gelatina puede actuar como barrera de elementos oxidantes del ambiente, oxígeno, ozono y partículas sólidas de polución. Adicionalmente, la gelatina minimiza el efecto negativo de las oscilaciones de humedad. Por consiguiente, puede considerarse que es un buen «amortiguador» para proteger a la celulosa del impacto de la humedad relativa del aire y de la acidez ambiental. No obstante, debe tenerse en cuenta que cuando el contenido de agua del papel supera el 7%, puede convertirse en un nutriente excelente para el desarrollo de microorganismos fúngicos y bacterianos. En este caso, debe estimarse, además, que un material ce- 103
2 ANÁLISIS DEL CONTENIDO PROTEICO, GELATINA, EN PAPEL COMO SOPORTE DE LOS DOCUMENTOS DEL MONASTERIO DE GUADALUPE 104 lulósico o proteico degradado, posee una estructura química formada por polímeros cuyas cadenas se han fragmentado, lo que convierte al soporte en un sustrato más susceptible de ser colonizado por microorganismos que metabolizarán fácilmente cadenas proteicas de bajo peso molecular. Actualmente, se utilizan diferentes técnicas para identificar los materiales que conforman una obra histórica, ello nos permite diagnosticar las alteraciones que pueden comprometer su integridad a lo largo del tiempo. La cromatografía de gases asociada a espectroscopia de masas (CG-SM) es una técnica de separación que se utiliza habitualmente para identificar sustancias proteicas que aparecen como integrantes de los aglutinantes que forman parte de muchos bienes culturales. Para el análisis metodológico de estas muestras se requiere que sean tratadas mediante hidrólisis en medio ácido con el fin de romper los enlaces peptídicos de las cadenas proteicas y de este modo poder liberar los aminoácidos que lo integran, los cuales son identificados y cuantificados. Así, la gelatina puede ser detectada en un soporte y analizada utilizando esta técnica. No obstante, se trata de un procedimiento largo y laborioso. En este trabajo se ha puesto en marcha una técnica alternativa para detectar la presencia de gelatina en papel mediante el uso de SDS-PAGE (Sodio Dodecil Sulfato- Electroforesis con Geles de Poliacrilamida). Esta técnica permite detectar y cuantificar proteínas, utilizando micromuestras, con resultados rápidos y precisos. En trabajos anteriores, diferentes soportes proteicos como pergaminos del siglo XVI y piel de momias fueron analizados mediante esta técnica con resultados satisfactorios (Valentín, 1996). Las proteínas como componentes de soportes de materiales históricos tales como: pergaminos, sedas, momias, colecciones de historia natural, materiales fotográficos, han sido generalmente analizadas para determinar el grado de deterioro de dicho soporte. Asimismo, el análisis de la composición de aglutinantes y recubrimientos fabricados con componentes proteicos, con objeto de establecer los procedimientos más adecuados para un tratamiento de conservación-restauración. En el campo de los documentos gráficos con soporte de papel, son muy escasas las investigaciones realizadas para mostrar la correlación que podría existir entre la presencia de proteínas, gelatinas, y la estabilidad de un papel a lo largo del tiempo. Objetivos De acuerdo a lo expuesto, el objetivo principal de este trabajo ha sido la aplicación de una metodología que permitiera evidenciar la presencia de gelatina en soportes celulósicos correspondientes a diferentes documentos históricos relacionados con el reinado de Isabel la Católica En segundo lugar, se ha tratado de ofrecer una metodología alternativa al uso de la CG/SM, extrapolable al análisis cuantitativo y cualitativo de otros componentes proteicos, que forman parte tanto del soporte, como de los elementos sustentados, de numerosos bienes culturales. Análisis de la posible presencia de gelatina en documentos Uno de los principales problemas que se presenta al analizar gelatinas en materiales celulósicos, es la escasa concentración de proteína por unidad de superficie que suele
3 encontrarse. Ello puede deberse al propio proceso de degradación natural de la sustancia filmógena, a lo largo del tiempo y/o a las condiciones y avatares particulares a las que haya podido estar expuesto el soporte. Ello puede enmascarar los datos obtenidos en los análisis y contribuir a una falsa interpretación de los resultados. Material En todos los casos se han aprovechado pequeños fragmentos de papel que se habían desprendido de los documentos. A partir de ellos, se prepararon micromuestras para análisis. El material correspondía a: Cuadernillo copia del testamento de Isabel la Católica, año 1506, muestra 116. Cuadernillo copia del codicilo de Isabel la Católica, año 1506, muestra 117. Documento cuadernillo n.º 64, 26 de junio de Como papel control se empleó papel Whatman n.º 1. Método La bibliografía indica que el contenido medio de gelatina encontrado en diferentes tipos de papel se encuentra en un rango de 2,6-5,8% (Barrett y col., 1994; Barrett y col., 1995; Kejser y col., 1999). De acuerdo con estos datos se aplicaron dos protocolos de análisis y se procedió según se describe a continuación: a) Primer protocolo de análisis Se cortaron 3 muestras de papel Whatman de 5 x 3 mm cuyo peso fue 3 mg. Se preparó una solución stock (10 mg/ml) de Gelatina (Merck). Se saturaron los diferentes fragmentos de Whatman con distintas concentraciones de Gelatina pura y de BSA (albúmina de suero bovina) (control) y se dejaron secar al aire: 1. 20% gelatina (20% de 3 mg que pesa cada muestra de papel Whatman corresponde a 600 µg) % gelatina (300 µg). 3. 5% gelatina (150 µg). 4. 2,5% gelatina (75 µg). 5. 1% gelatina (30 µg). 6. 0,5% gelatina (15 µg). 7. 5% BSA (150 µg). 8. 2,5% BSA (75 µg). 9. 1% BSA (30 µg). Se prepararon los extractos proteicos a partir de los fragmentos de papel Whatman de peso inferior a 3 mg cada uno. A cada muestra de papel Whatman con los distintos tratamientos proteicos y al control sin tratamiento se le añadieron 30 µl de Sample Buffer Laemmli 2X (con inhibidores de actividad proteolítica, Roche). La mezcla se homogeneizó con varilla de vidrio y se incubó durante una hora sobre hielo. Las muestras se hirvieron a 100 C, durante 5 minutos. A continuación se incubaron 5 minutos en hielo. Se centrifugaron a rpm, 10 C, 45 minutos. El sobrenadante obtenido se cargó directamente en un gel de poliacrilamida al 12% y se separó mediante SDS-PAGE. Paralelamente se preparó un fragmento de muestra problema (n.º 64) del mismo tamaño que los Whatman y se procedió del mismo modo que con los controles. El gel obtenido se tiñó con Azul de Coomassie (sensibilidad de detección 0,1-0,5 µg de proteína por banda). 105
4 ANÁLISIS DEL CONTENIDO PROTEICO, GELATINA, EN PAPEL COMO SOPORTE DE LOS DOCUMENTOS DEL MONASTERIO DE GUADALUPE 106 Figura 1. SDS-PAGE 12% PAAG, tinción con Coomassie Blue. Resultado Como se puede ver en la figura 1B, las bandas de aproximadamente 55 kda que aparecen en el extracto de la muestra, se observan en todos los carriles incluido el del control de papel de Whatman sin tratar. Por lo tanto, parece probable que se trate de contaminantes externos en la manipulación del papel (queratinas procedentes de descamación natural de células epidérmicas de las manos). b) Segundo protocolo de análisis Se procedió de igual modo que el descrito en el apartado anterior. Sin embargo, en este caso, se cargaron en el gel muestras de menor contenido en gelatina y las muestras problema. Se utilizó también como control film fotográfico por su conocido contenido en gelatina. El gel se tiñó con plata (sensibilidad de detección, 1-10 ng de proteína por banda). Resultado Las observaciones de la figura 2 indican que las bandas que se detectan en las muestras, también se pueden observar en la muestra control de papel Whatman sin tratar. En la muestra 117 se aprecia una banda de peso molecular un poco mayor, que no se detecta en las otras, pero sí se puede observar en el control. Esta banda ha sido aislada del gel y procesada para su análisis por espectrometría de masas (MALDI-TOF). No obstante, el resultado ha sido negativo, no habiendo sido posible identificar proteínas específicas. La aplicación de la técnica que emplea electroforesis con geles de poliacrilamida SDS- PAGE, fue utilizada anteriormente, para mostrar la degradación del colágeno en pergamino del siglo XVI (Valentín, 1996), en ese caso, se evaluó el grado de despolimerización del colágeno, lo que nos indicó el estado de conservación del material. Idéntico procedimiento se utilizó comparativamente con pergamino de reciente manufactura. El resultado mostró que las bandas con bajo peso molecular indicaban la presencia de pequeños fragmentos de colágeno (soporte deteriorado). Sin embargo, el pergamino reciente presentó bandas de alto peso molecular (soporte con buen estado de conservación). Por consi-
5 Figura 2. SDS-PAGE 12% PAAG, tinción con plata. guiente, el grado de deterioro pudo correlacionarse con el patrón de electroforesis obtenido, tanto por el número de bandas, su peso molecular (migración a distintas alturas del gel) como por la intensidad de las bandas (concentración relativa de cada polipéptido). La técnica de SDS-PAGE ha sido también útil para evaluar comparativamente el deterioro de colágeno de epitelio de momias egipcias, guanches y latinoamericanas. Los datos indicaron que las bandas de menor peso molecular correspondían a colágeno degradado altamente dependiente del tipo de tratamientos recibido por el proceso de momificación. Conclusiones El patrón electroforético de las muestras procedentes de los documentos históricos analizados no es compatible con el de muestras similares recubiertas de mezclas proteicas (gelatinas) o proteínas definidas (BSA), incluso en las concentraciones más bajas. Consecuentemente, a la vista de los datos obtenidos, considerando la alta sensibilidad y precisión de las técnicas utilizadas (capaces de detectar residuos proteicos procedentes de descamación celular en procesos de manipulación), no parece probable que los documentos históricos analizados, contengan un recubrimiento de gelatina o colas de procedencia animal con composición proteica, tal como se podía hipotetizar por las características de preparación de los soportes en la época en la que estos fueron generados. Estos datos abren vías al estudio y valoración tanto histórica, en la manufactura de estos documentos, como en los métodos más oportunos para su conservación y restauración. 107
6 Bibliografia ANÁLISIS DEL CONTENIDO PROTEICO, GELATINA, EN PAPEL COMO SOPORTE DE LOS DOCUMENTOS DEL MONASTERIO DE GUADALUPE BARRETT, T.; MOSIER, C.: «The role of gelatin in paper permanency II», The Book and Paper Book, ANNUAL, American Institute for Conservation, vol. 13, BARRETT, T.; MOSIER, C.: «The role of gelatin in paper permanency», Journal of the American Institute for Conservation, vol. 34, n. 3, 1995, págs KEJSER, U.; KOCH, M.: «Characterization of photographic gelatin by 2D-electrophoresis», Preprint from the International Congress of IADA, Copenhagen, de agosto de VALENTÍN, N.: «Assessment of biodeterioration processes in organic materials. Control methods», International Conference on Conservation and Restoration of Archive and Library Materials, Erice, Italy, de abril de 1996, págs Agradecimientos Agradecemos la valiosa y eficaz colaboración de Ismael Gónzalez y David Juanes (IPHE) en la elaboración de este trabajo. 108
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