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1 INSTRUCCIONES DE USO MEDIOS EN PLACA LISTOS PARA USAR PA Rev.: April 2013 BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (150 mm) BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep blood, Square USO PREVISTO BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood, disponible en varios formatos de placa, se utiliza para las pruebas de sensibilidad de difusión en disco de cepas aisladas a partir de muestras clínicas, de Streptococcus pneumoniae y otros estreptococos, conforme a las normas del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 1. PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO Método microbiológico. El procedimiento Bauer-Kirby se basa en la difusión en un gel de agar de sustancias antimicrobianas que se impregnan sobre discos de papel 2.En el procedimiento de prueba, una suspensión normalizada del organismo se extiende mediante una torunda sobre toda la superficie del medio. A continuación, se colocan sobre la superficie del medio discos de papel impregnados con cantidades específicas de antibiótico u otro agente microbiano, se incuba la placa y se mide la zona de inhibición en torno a cada disco. El CLSI ha redactado una norma de rendimiento para el procedimiento Bauer-Kirby, documento que debe consultarse para obtener más detalles 1. Se han desarrollado otras normas nacionales para las pruebas de sensibilidad antimicrobianas según el procedimiento Bauer-Kirby. En dichas normas, las densidades de inóculo, el método de inoculación, los tamaños de las zonas resultantes y el modo de interpretación pueden ser diferentes de la norma de CLSI. Mientras no existan normas comunes europeas para las pruebas de sensibilidad, se deben consultar las normas locales nacionales si no son aplicables las directrices de CLSI. El agar Mueller Hinton sin suplemento, aunque es adecuado para las pruebas de sensibilidad de patógenos aerobios de rápido crecimiento, no es adecuado para organismos más exigentes tales como Streptococcus pneumoniae. En el documento M2 del CLSI se recomienda el agar Mueller Hinton suplementado con sangre desfibrinada de carnero al 5% y se detallan tanto los procedimientos de calidad como los criterios de interpretación para su uso con S. pneumoniae y otros estreptococos 1. REACTIVOS BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood Fórmula* por litro de agua purificada Extracto de carne bovina 2,0 g Hidrolizado ácido de caseína 17,5 Almidón 1,5 Agar 17,0 g Sangre de carnero desfibrinada 5% ph 7,3 ± 0,2 * Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. PRECAUCIONES Para uso diagnóstico in vitro. Solamente para uso profesional. No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación, agrietamiento o cualquier otro signo de deterioro. La reducción excesiva de este medio debido a la deshidratación puede causar resultados de sensibilidad falsos. PA

2 Consultar los procedimientos de manipulación aséptica, riesgos biólogicos y desecho del producto usado en el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO. ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una temperatura entre 2 y 8 C, envueltas en su envase original, hasta justo antes de usarlas. Evitar la congelación y el calentamiento excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su fecha de caducidad (ver la etiqueta en el paquete) e incubarse durante los períodos de incubación recomendados. Las placas de grupos de 10 placas ya abiertos pueden usarse durante una semana siempre que se almacenen en un lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8 C. CONTROL DE CALIDAD DEL USUARIO Para el control de calidad del usuario, se deben consultar las normas correspondientes de CLSI 1 o, si procede, las normas nacionales. Sobre todo deben seguirse los procedimientos descritos a continuación en Procedimiento de Análisis, incluida la cepa de control S. pneumoniae ATCC 49619, y los discos de agentes antimicrobianos normalmente utilizados por el laboratorio deben analizarse al menos dos veces a la semana para determinar el rendimiento correcto. Los diámetros de zona correctos se encuentran en la Tabla 3A del documento M100 del CLSI, que se incluye con el documento M2 del CLSI 1. Apariencia del medio sin inocular: rojo (color sangre), opaco. PROCEDIMIENTO Materiales suministrados BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (suministrado en varios formatos diferentes de placa; véase Envase/Disponibilidad). Controladas microbiológicamente. Materiales no suministrados 1. Caldo de inóculo en cantidades de 5 ml, tales como Mueller Hinton II Broth (BBL de cat , tubo de 16 x 102 mm) o 0,9% de solución salina, para preparación del inóculo estándar. 2. Patrón de comparación de sulfato de bario (0,5 ml de 0,048 M BaCl 2 [1,175% w/v BaCl 2 2H 2 O] a 99,5 ml de 0,18 M [0,36 N] H 2 SO 4 [1% v/v]). 3. Un dispositivo fotométrico para ajustar la turbidez en la suspensión de inóculo para que sea equivalente al patrón 0,5 de McFarland. 4. Como alternativa a los materiales anteriores (1 3), se puede utilizar el BD Prompt Inoculation System (dispositivo de preparación de inóculo volumétrico) 1,3. 5. Cultivo de Control: Streptococcus pneumoniae ATCC Discos de papel impregnados con cantidades específicas de agentes microbianos, tales como los discos de prueba de sensibilidad BD Sensi-Disc. 7. Dispositivo dispensador de discos, como el dispensador de autoapisonamiento de 6, 8 o 12 posiciones BD Sensi-Disc. 8. Dispositivo para medir o interpretar diámetros de zona, tales como calibrador o una regla. 9. Un incubador capaz de producir una atmósfera de CO 2 al 5% o cualquier dispositivo que produzca una atmósfera enriquecida de CO 2 similar. 10. Medios de cultivo auxiliar, reactivos y equipo de laboratorio que se requiera. Tipos de muestras Este producto se utiliza para las pruebas de sensibilidad de cultivos puros que se han aislado a partir de muestras clínicas (véase también CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO). Procedimiento de análisis Se debe utilizar el método de suspensión de colonias al realizar la prueba de S. pneumoniae 1. Emplear técnicas asépticas. 1. Asegurarse de que se encuentre disponible un cultivo puro reciente (del día anterior) de medio de agar sangre no selectivo. PA

3 2. Suspender el crecimiento en un caldo tal como el Mueller Hinton II o solución salina estéril al 0,9%. Ajustar la turbidez para que sea equivalente al patrón de sulfato de bario (patrón 0,5 de McFarland). La turbidez del patrón y del inóculo de prueba deben compararse sosteniendo ambos tubos delante de un fondo blanco con líneas negras claramente marcadas, o se puede utilizar un dispositivo fotométrico. 3. Se han considerado aceptables para fines de análisis sistemáticos métodos alternativos de la preparación del inóculo en los que se utilizan dispositivos que permiten la normalización directa de los inóculos sin un ajuste de la turbidez, tal como BD Prompt Inoculation System 1,3. 4. Dentro de los 15 min de ajustar la turbidez del inóculo, sumergir una torunda estéril en el inóculo correctamente diluido y hacerla rodar firmemente varias veces contra la pared interna superior del tubo para exprimir el líquido en exceso. 5. Inocular el BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood extendiendo la muestra por toda la superficie de agar de la placa tres veces, girándola 60 grados cada vez para obtener una inoculación uniforme. 6. Volver a colocar la tapa de la placa y mantener la placa a temperatura ambiente durante al menos 3 min, pero no más de 15 min, para permitir que la humedad de la superficie se absorba antes de aplicar los discos impregnados de fármaco. No utilizar más de nueve discos por placa de 150 mm o cuatro discos para la placa de 90 y 100 mm. Para las pruebas de penicilina de S. pneumoniae, utilizar un disco de oxacilina de 1 µg Incubar durante h a 35 C en una atmósfera de CO 2 al 5%. Resultados Después de la incubación, debe estar visible un crecimiento confluente. Si sólo crecen colonias aisladas, el inóculo está muy diluido y se debe repetir la prueba. Medir el diámetro de las zonas de inhibición completa (observadas a simple vista), incluido el diámetro del disco, al milímetro más cercano, mediante calibradores deslizantes o una regla, desde la parte superior de la placa sin la tapa 5. El criterio de valoración debe considerarse como la superficie que no muestra crecimiento visible evidente que pueda detectarse a simple vista. Desestimar el crecimiento débil de colonias diminutas que pueda detectarse con dificultad cerca del borde de la zona de inhibición evidente. Con BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood, debe medirse la zona de inhibición de crecimiento, no la zona de inhibición de hemólisis. Recuento e interpretación de los resultados Los diámetros de zona deben compararse con los que aparecen en la tabla 2G para S. pneumoniae y 2H para otros estreptococos en el documento M100 (M2) del CLSI, que proporcionan criterios de interpretación 1. Los resultados obtenidos, luego se pueden describir como resistentes, intermedios o sensibles. Observar los criterios de interpretación especiales para los aislados de S. pneumoniae con diámetros de zona de oxacilina de 19 mm mencionados en esta norma (véase también CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO). Nota: Se publican periódicamente tablas complementarias al documento M2 del CLSI, o sus versiones revisadas, con tablas actualizadas de discos antimicrobianos y normas de interpretación. Consultar en las tablas más recientes las recomendaciones vigentes. La norma completa y los suplementos informativos se pueden solicitar al Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA EE.UU. Teléfono: CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La prueba de sensibilidad de difusión en disco está diseñada para uso con cultivos puros solamente. Se recomienda realizar una tinción de Gram y una identificación presuntiva del aislado antes de preparar la prueba de sensibilidad 1. Este medio se utiliza para la prueba de sensibilidad de S. pneumoniae y otros estreptococos contra agentes antimicrobianos seleccionados 1,2,5. Tener en cuenta que para amoxilina, ampicilina, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona, cefuroxima, imipenem y meropenem no existen criterios de pruebas de difusión en disco fiables para S. pneumoniae. La actividad in vitro de estos agentes antimicrobianos se determina mejor utilizando el método de CMI. PA

4 Para la determinación de la sensibilidad a la penicilina de S. pneumoniae, se debe utilizar un disco de oxacilina. Los aislados de S. pneumoniae con diámetros de zona de oxacilina 20 mm son sensibles (CMI 0,06 mg/ml) a la penicilina. Dado que ocurren zonas 19 mm con discos de determinación de oxacilina con determinadas cepas resistentes, intermedias y sensibles a la penicilina, se debe determinar una CMI de penicilina, meropenem y cefotaxima o ceftriaxona en todos los aislados de S. pneumoniae con zonas de oxacillina 19 mm 1. Para los estreptococos diferentes de S. pneumoniae, no se recomienda la prueba de oxacilina para determinación de sensibilidad de penicilina. Para los estreptococos beta-hemolíticos, utilizar un disco de penicilina o ampicilina. Para los estreptococos del grupo viridans, la prueba de difusión en disco de penicilina y oxacilina no es fiable; se debe determinar su sensibilidad mediante pruebas de CMI 1. Las pruebas de sensibilidad y difusión de disco antimicrobiano con Streptococcus pneumoniae ATCC se han realizado internamente con cefaclor, cefprozilo, cloranfenicol, eritromicina, ofloxacina, tetraciclina, trimetoprima/sulfametoxazol y vancomicina. Posteriormente a los procedimientos de prueba descritos en M2-A5, se realizaron veinte pruebas con la cepa de control de calidad y ocho discos antimicrobianos en un período de 10 días de prueba. Para los ocho antimicrobianos, el 100% (160/160) de los tamaños de zona se incluyeron dentro de los intervalos de tamaños de zona esperados publicados en M2-A5 y la Tabla 3C del documento M100-S6 del NCCLS 6,7. La desviación estándar de tetraciclina fue menor de 1 mm y, para todos los demás antimicrobianos, menor de 2mm 8. Los estudios de reproducibilidad (3 veces al día durante 3 días) se realizaron en dos establecimientos con los agentes antimicrobianos enumerados anteriormente contra S. pneumoniae ATCC y nueve cepas adicionales bien caracterizadas de S. pneumoniae. Para cada agente antimicrobiano se siguieron las normas de interpretación de diámetro de zona de la Tabla 2C del documento M2-A5 y suplemento M100-S6 del NCCLS 6,7. Las pruebas con cloranfenicol, eritromicina, ofloxacina, tetraciclina y vancomicina dieron como resultado más del 95% de concordancia de categorías con el método de referencia de NCCLS. Las pruebas con trimetoprima/sulfametoxazol dieron un 90% de concordancia de categorías con el método de referencia de NCCLS. No se pudo determinar reproducibilidad para cefaclor y cefprozilo debido a la ausencia de normas de interpretación para estos dos agentes antimicrobianos. Basándose en los estudios apuntados anteriormente, el uso de cefaclor, cefprozilo o trimetoprima/sulfametoxazol no se recomienda en este medio cuando se realicen pruebas de S. pneumoniae. Además, las referencias en la literatura recogen errores de interpretación excesivos en las pruebas de difusión en discos con trimetoprima/sulfametoxasol en placas de agar Mueller Hinton con sangre de carnero 9. Con respecto a algunas combinaciones de organismos-agente antimicrobiano, la zona de inhibición tal vez no tenga un borde claramente demarcado, lo que puede llevar a una interpretación incorrecta. Se han identificado diversos factores que afectan las pruebas de sensibilidad de difusión en disco. Se incluyen en esta categoría el medio, la profundidad del agar, la potencia del disco, la concentración del inóculo, la edad del inóculo y el ph 2. La concentración incorrecta del inóculo puede producir resultados inexactos. Las zonas de inhibición pueden ser demasiado pequeñas si el inóculo es demasiado denso o pueden ser demasiado grandes y difíciles de medir si el inóculo está muy diluido. El almacenamiento inadecuado de los discos con agentes antimicrobianos puede causar una pérdida de potencia y un resultado resistente falso. La sensibilidad in vitro de un organismo a un agente antimicrobiano específico no necesariamente significa que el agente tendrá eficacia in vivo. Consultar las referencias correspondientes para obtener instrucciones para la interpretación de resultados 2,10. No utilizar este medio para pruebas de sensibilidad de bacterias diferentes a S. pneumoniae y estreptococos beta-hemolíticos. REFERENCIAS 1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Approved Standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at PA

5 2. Washington, J.A., and G.L. Woods Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17: Swenson, J.M., B.C. Hill, and C. Thornsberry Screening pneumococci for penicillin resistance. J. Clin. Microbiol. 24: Hindler, J.F., and J.M. Swenson Susceptibility test methods: fastidious bacteria. In: In: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical microbiology, 8 th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 6. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Standard: M2-A5. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 5th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 7. National Committee for Clinical Laboratory Standards Sixth informational supplement: M100- S6. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 8. Data on file at Becton Dickinson Microbiology Systems. 9. Jorgensen, J.J Detection of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae by use of standardized susceptibility testing methods and recently developed interpretive criteria. Clin. Microbiol. Newsl. 16(13) Neumann, M.A., D.F. Sahm, C. Thornsberry, J.E. McGowan, Jr Cumitech 6A, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing: a practical guide. Coordinating ed., J.E. McGowan, Jr. American Society of Microbiology, Washington, D.C. ENVASE/DISPONIBILIDAD BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (placas Stacker de 90 mm) Nº de cat Medios en placa listos para usar, 20 placas Nº de cat Medios en placa listos para usar, 120 placas BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep Blood (150 mm) Nº de cat Medios en placa listos para usar, 20 placas BD Mueller Hinton Agar with 5% Sheep blood, Square (120 x 120 mm) Nº de cat Medios en placa listos para usar, 20 placas INFORMACIÓN ADICIONAL Para obtener más información, diríjase a su representante local de BD. Becton Dickinson GmbH Tullastrasse 8 12 D Heidelberg/Germany Phone: Fax: Prompt is a trademark of 3M. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection BD, BD Logo and all other trademarks are the property of Becton, Dickinson and Company BD PA

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