BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA)

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1 BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA) Rev. 10 Enero 2015 PROCEDIMIENTOS DE CONTROL DE CALIDAD I. INTRODUCCION CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA) (agar sangre de carnero al 5% anaerobio CDC con feniletil alcohol) es un medio de cultivo enriquecido para el aislamiento selectivo de bacterias anaerobias obligadas de los cultivos mixtos. II. REALIZACION DEL PROCEDIMIENTO DE ANALISIS 1. Reducir todas las placas de agar anaerobias de un día para el otro a temperatura ambiente en un sistema anaerobio BD Gaspak EZ. 2. Preparación de inóculos a. Preparar cultivos de prueba de anaerobios obligados extendiendo con torunda el crecimiento (de 2 a 5 días) de una placa de CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar en un tubo con 5 ml de medio de tioglicolato enriquecido con vitamina K 1 y hemina. Mezclar bien y ajustar a una turbidez comparable a un patrón 0,5 de McFarland. NOTA: Los cultivos deben manipularse con rapidez para evitar la exposición prolongada al oxígeno. El tiempo de exposición total no debe superar los 20 min. b. Utilizar cultivos de caldo de h del organismo anaerobio facultativo diluido a Inoculación de las placas a. Con una pipeta volumétrica o método equivalente, suministrar 0,05 ml del inóculo adecuado a las muestras de medio en placa y extenderlo para su aislamiento. Para Proteus mirabilis, utilizar una dilución de 10-3 del cultivo de caldo como inóculo. b. Incluir placas de agar de soja Trypticase con sangre de carnero al 5% (TSA II) como controles para todos los organismos y placas de CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar como controles para los anaerobios obligados. c. Incubar los controles de la placa TSA II en atmósfera aerobia a 35 ± 2 C y todas las demás placas en atmósfera anaerobia (sistema anaerobio BD Gaspak EZ) a 35 ± 2 C. 4. Examinar todas las placas inoculadas a las h para observar crecimiento, tamaño de colonias, pigmentación y reacciones hemolíticas. Observar la cepa Porphyromonas bajo luz UV (365 nm) para detectar la fluorescencia. 5. Resultados previstos *Bacteroides fragilis ATCC *Clostridium perfringens ATCC *Peptostreptococcus anaerobius ATCC Porphyromonas levii ATCC Escherichia coli ATCC *Proteus mirabilis ATCC Crecimiento Crecimiento, beta-hemólisis Crecimiento de moderado a denso a las 72 h. Colonias de color blancuzco a marrón claro, salientes, circulares con borde completo. Crecimiento de promedio a denso a las 72 h. Colonias de color blancuzco a marrón claro, completas, convexas, opacas. Fluorescencia de color rosa brillante a anaranjado y rojo ladrillo bajo luz UV**. Crecimiento de traza a denso; tamaño de colonias reducido cuando se compara con el control no selectivo. Colonias de color gris, poco convexas, húmedas, semiopacas con superficie brillante. Crecimiento de traza a denso; agrupamiento dinámico inhibido al compararse con el control no selectivo. Colonias de color gris claro, circulares, de translúcidas a opacas. * Cepa de organismo recomendada para control de calidad del usuario. ** La fluorescencia se observa sólo en las colonias jóvenes. El pigmento se desarrolla lentamente y puede oscurecer la fluorescencia. 1

2 III. CONTROL DE CALIDAD ADICIONAL 1. Examinar las placas como se describe en la sección Deterioro del producto. 2. Examinar visualmente las placas representativas para asegurarse de que los defectos físicos existentes no interfieran con el uso. 3. Determinar el ph potenciométricamente a temperatura ambiente para verificar el cumplimiento de la especificación de 7,5 ± 0,2. 4. Observar la firmeza de las placas durante el procedimiento de inoculación. 5. Incubar las placas sin inocular a 35 ± 2 C durante 72 h y examinar si presentan contaminación microbiana. INFORMACION DEL PRODUCTO IV. USO PREVISTO CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol se utiliza para el aislamiento selectivo de bacterias anaerobias obligadas exigentes de crecimiento lento a partir de una variedad de muestras clínicas y no clínicas. V. RESUMEN Y EXPLICACION El aislamiento de bacterias anaerobias obligadas a partir de muestras clínicas y no clínicas requiere el uso de medios de enriquecimiento selectivo y no selectivo 1. La opción de medios a utilizar se basa en el tipo de muestra y los resultados de la observación directa al microscopio. Se utilizan medios no selectivos para aislar organismos presentes en pequeñas cantidades y para proporcionar una indicación de las cantidades y los tipos de organismos presentes en la muestra. Se emplean medios selectivos para facilitar la recuperación de los organismos deseados presentes en poblaciones mixtas. CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol fue formulado por Dowell et al de los Centers for Disease Control and Prevention como un medio selectivo enriquecido para el aislamiento y cultivo de bacterias anaerobias obligadas a partir de muestras clínicas con bacterias anaerobias facultativas de crecimiento rápido, tal como Proteus y otros miembros de la familia Enterobacteriaceae 2. El medio emplea agar de soja Trypticase BBL suplementado con agar adicional, extracto de levadura, vitamina K 1, hemina, cistina, sangre de carnero al 5% y alcohol feniletílico. VI. PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol es un medio altamente nutritivo debido a su contenido de peptonas, extracto de levadura, hemina, vitamina K 1 y sangre de carnero. Las peptonas proporcionan factores de crecimiento nitrogenado, carbono, azufre y otros elementos de traza. El extracto de levadura es una fuente importante de vitaminas B. El cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico. Los componentes de la sangre de carnero, hemina, cistina y vitamina K 1 proporcionan factores requeridos por determinados organismos anaerobios obligados 3-7. Se logra selectividad por la adición de alcohol feniletílico, que reduce el crecimiento de bacterias gram negativas anaerobias facultativas sin inhibir el crecimiento de bacterias anaerobias obligadas 8. VII. REACTIVOS CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol Fórmula aproximada* por litro de agua purificada Digerido pancreático de caseína... 15,0 g Digerido papaico de harina de soja... 5,0 g Cloruro sódico... 5,0 g Agar... 20,0 g Extracto de levadura 5,0 g Hemina...0,005 g Vitamina K 1...0,01 g L-cistina...0,4 g Alcohol feniletílico...2,5 g Sangre de carnero, desfibrinada... 5% * Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. 2

3 Advertencias y precauciones Para uso diagnóstico in vitro. Si se observa humedad excesiva, invertir la parte inferior sobre una tapa desplazada para dejar secar al aire y así impedir que se forme una barrera estanca entre la parte superior y la inferior de la placa durante la incubación. En las muestras clínicas puede haber microorganismos patógenos, como los virus de la hepatitis y el virus de la inmunodeficiencia humana. Para la manipulación de todos los elementos contaminados con sangre u otros líquidos corporales deben seguirse las Precauciones estándar 9-12 y las directrices del centro. Después de ser usados, las placas preparadas, los recipientes de muestras y otros materiales contaminados deben esterilizarse en autoclave antes de ser desechados. Si se utilizan frascos BBL GasPak con envolturas generadoras de gas, utilizar solamente envolturas de la marca GasPak. Instrucciones para el almacenamiento Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a 2 8 ºC. No congelar ni sobrecalentar. No abrir hasta que vayan a utilizarse. Reducir al mínimo la exposición a la luz. Las placas preparadas almacenadas en su envase original a 2 8 ºC hasta momentos antes de utilizarse pueden inocularse hasta la fecha de caducidad e incubarse por los tiempos de recomendados. Dejar que el medio alcance temperatura ambiente antes de realizar la inoculación. Deterioro del producto No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación o cualquier otro signo de deterioro. VIII. RECOGIDA Y MANIPULACION DE LAS MUESTRAS Se han diseñado diversos recipientes y torundas para recolectar las muestras. Las muestras deben obtenerse antes de administrar el tratamiento antimicrobiano. Deben adoptarse las medidas necesarias para un transporte inmediato al laboratorio. Se han diseñado varios medios de conservación o sistemas de transporte, tales como los productos para recogida y transporte BBL, con el fin de prolongar la supervivencia de los microorganismos cuando se prevé una demora significativa entre el momento de recogida y el cultivo definitivo. Consultar los textos correspondientes para conocer los detalles relativos a los procedimientos de recogida y manipulación de muestras 13,14. El laboratorio debe contar con información clínica suficiente para permitir al especialista en microbiología seleccionar los medios más adecuados y técnicas apropiadas. IX. PROCEDIMIENTO Material suministrado CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol Materiales necesarios pero no suministrados Medios de cultivo auxiliar, reactivos, organismos para el control de calidad y el equipo de laboratorio que se requiera. Procedimiento de análisis Emplear técnicas asépticas. La superficie de agar debe ser lisa y húmeda, pero sin humedad en exceso. Extender las muestras tan pronto como sea posible después de recibirlas en el laboratorio. Reducir al mínimo la exposición a la luz. Con las muestras líquidas, los medios deben inocularse con 1 gota de muestra. Las muestras de tejido deben triturarse y pulverizarse en caldo estéril tal como el medio de tioglicolato enriquecido BBL antes de la inoculación. Luego, la inoculación se realiza como con las muestras líquidas. Las muestras de torundas pueden hacerse rodar en el primer cuadrante de los medios en placa y luego utilizarse para inocular los medios líquidos. También, la torunda puede fregarse en un pequeño volumen de caldo reducido y éste utilizarse para inocular los medios de la manera que se hace con las muestras líquidas. 3

4 Este medio debe reducirse inmediatamente antes de la inoculación, colocándolo en condiciones anaerobias durante h 3. Una manera eficaz y fácil de obtener condiciones anaerobias adecuadas es por medio del uso de sistemas anaerobios BD GasPak EZ. Los medios en placas deben inocularse con el método de extensión en placa para obtener cultivos puros de medios con flora mixta. Un caldo enriquecido tal como el medio de tioglicolato enriquecido BBL debe inocularse al mismo tiempo que las placas de aislamiento primario. Incubar de inmediato en condiciones anaerobias o colocar en un frasco de conservación con gas o gases libres de oxígeno hasta acumular suficientes placas (pero no dejar transcurrir más de 3 h) 15. La incubación debe realizarse a 35 ± 2 C durante al menos 48 h y preferentemente durante 5 7 días. Independientemente del sistema anaerobio utilizado, es importante incluir un indicador de anaerobiosis tal como un indicador anaerobio GasPak. Control de calidad del usuario Véase Procedimientos de control de calidad. El control de calidad debe llevarse a cabo conforme a la normativa local y/o nacional, a los requisitos de los organismos de acreditación y a los procedimientos estándar de control de calidad del laboratorio. Se recomienda consultar las instrucciones de CLSI y normativas de CLIA correspondientes para obtener información acerca de las prácticas adecuadas de control de calidad. X. RESULTADOS Después de la incubación, la mayoría de las placas mostrarán un área de crecimiento confluente. Dado que el procedimiento de extensión de la muestra es, de hecho, una técnica de dilución, se depositan cada vez menos microorganismos en las áreas extendidas. Por consiguiente, una o más de estas áreas deben mostrar colonias aisladas de organismos contenidos en la muestra. Por otra parte, el crecimiento de cada microorganismo podrá medirse semi-cuantitativamente basándose en el crecimiento ocurrido dentro de las áreas en que se realiza la extensión. Examinar las colonias con un microscopio de disección y con una lámpara de UV de longitud de onda larga (las colonias de las especies Porphyromonas-Prevotella con pigmentación deben mostrar fluorescencia de color anaranjado a rojo ladrillo bajo luz UV). La fluorescencia es visible antes de la pigmentación. Para determinar la relación con el oxígeno de cada tipo de colonia presente en medios sólidos anaerobios, inocular los siguientes medios 16 : 1. Una placa de agar sangre anaerobio para incubar en atmósfera anaerobia. 2. Una placa de agar sangre aerobio (o agar chocolate) para incubar en una atmósfera aerobia enriquecida con dióxido de carbono. El agar chocolate es particularmente necesario para distinguir las especies Haemophilus exigentes con respecto a la nutrición y otras bacterias que crecerán en agar sangre anaerobio incubado en atmósfera anaerobia y en agar chocolate a una mayor presión de dióxido de carbono, pero que no crecerán en agar sangre en presencia de dióxido de carbono o al aire. 3. Una placa de agar sangre aerobio para incubar en atmósfera aerobia sin añadir dióxido de carbono. 4. Tubos de medio de tioglicolato enriquecido y/o medio de carne cocida y un tubo de caldo de peptona, extracto de levadura y glucosa. Incubar todos los cultivos a 35 ± 2 C por lo menos 24 h y hasta un máximo de 7 días. Registrar la relación con el oxígeno como anaerobio obligado o no anaerobio (anaerobio aerotolerante, microaerofílico o anaerobio facultativo) 16. Los organismos que no crecen en las placas de subcultivo aerobias pueden suponerse anaerobios obligados con respecto a sus requisitos de oxígeno. Las colonias del tipo o tipos que demuestren ser anaerobios obligados pueden estudiarse posteriormente mediante los cultivos de caldo que correspondan. Consultar los textos correspondientes para obtener más información, incluidos los procedimientos de identificación 6,7,

5 XI. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Algunas pruebas de diagnóstico pueden realizarse con la placa primaria. Sin embargo, se recomienda un cultivo puro para pruebas bioquímicas y otros procedimientos de identificación. Consultar los textos correspondientes para obtener información detallada y procedimientos recomendados Un solo medio es rara vez es adecuado para detectar todos los organismos de importancia posible en una muestra. Se debe tener en cuenta que los organismos por lo general sensibles al agente antimicrobiano en un medio selectivo pueden ser inhibidos completa o sólo parcialmente según la concentración del agente, las características de la cepa microbiana y la cantidad de organismos en el inóculo. Los organismos generalmente resistentes al agente antimicrobiano no deben estar inhibidos. Por consiguiente, los cultivos de muestras cultivadas en medios selectivos deben compararse con las muestras cultivadas en medios no selectivos para obtener información adicional y favorecer la recuperación de patógenos posibles. XII. CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Antes de su lanzamiento al mercado, todos los lotes de CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA) se analizan para determinar sus características de rendimiento. Se inoculan mediante extensión muestras representativas del lote con 0,1 ml de los siguientes cultivos: Bacteroides fragilis (ATCC 25285), Clostridium perfringens (ATCC 13124), Peptostreptococcus anaerobius (ATCC 27337), Porphyromonas levii (ATCC 29147), Escherichia coli (ATCC 25922) y Proteus mirabilis (ATCC 12453). Los inóculos para B. fragilis, C. perfringens, P. anaerobius y P. levii se extraen de colonias cultivadas en placas de CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar y ajustadas a un patrón 0,5 de McFarland en medio de tioglicolato enriquecido reducido. El inóculo para E. coli se extrae de un cultivo de caldo y se diluye a 10-1 ; el inóculo para P. mirabilis se extrae de un cultivo de caldo y se diluye a Después de la inoculación, las placas se incuban a 35 ± 2 ºC en un sistema GasPak completo. Efectuar la lectura de las placas después de 48 h de incubación. Todos los organismos anaerobios muestran crecimiento ligero a denso, con morfología de colonias típica y reacciones hemolíticas, mientras que E. coli y P. mirabilis muestran crecimiento de traza a denso. En comparación con un control no selectivo, el tamaño de colonia de E. coli es reducido y el agrupamiento dinámico se reduce con P. mirabilis. Al observarse bajo luz UV (365 nm), P. levii presenta una fluorescencia rosa brillante a anaranjado brillante y rojo ladrillo. XIII. DISPONIBILIDAD Nº de cat. Descripción BD BBL CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Phenylethyl Alcohol (PEA), pqt. de 20 placas XIV. REFERENCIAS 1. Dowell, V.R., Jr Wound and abscess specimens, p In A. Balows (ed.), Clinical microbiology. How to start and when to stop. Charles C. Thomas, Springfield, Ill. 2. Dowell, V.R., Jr., G.L. Lombard, F.S. Thompson, and A.Y. Armfield Media for isolation, characterization, and identification of obligately anaerobic bacteria. CDC laboratory manual. Center for Disease Control, Atlanta. 3. Dowell, V.R., Jr., and T.M. Hawkins Laboratory methods in anaerobic bacteriology. CDC laboratory manual. HHS Publication No. (CDC) Centers for Disease Control, Atlanta. 4. Gibbons, R.J., and J.B. MacDonald Hemin and vitamin K compounds as required factors for the cultivation of certain strains of Bacteroides melaninogenicus. J. Bacteriol. 80: Wilkins, T.D., S.L. Chalgren, F. Jimenez-Ulate, C.R. Drake, Jr., and J.L. Johnson Inhibition of Bacteroides fragilis on blood agar plates and reversal of inhibition by added hemin. J. Clin. Microbiol. 3: Isenberg, H.D. (ed.) Clinical microbiology procedures handbook, vol. 1,2 and 3, 2nd ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Rodloff, A.C., P.C. Appelbaum, and R.J. Zabransky Cumitech 5A, Practical anaerobic bacteriology. Coordinating ed., A.C. Rodloff. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 8. Dowell, V.R., Jr., C.O. Hill, and W.A. Altemeier Use of phenylethyl alcohol in media for isolation of anaerobic bacteria. J. Bacteriol. 88: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 5

6 10. Garner, J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 12. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Isenberg, H.D., F.D. Schoenknecht, and A. von Graevenitz Cumitech 9, Collection and processing of bacteriological specimens. Coordinating ed., S.J. Rubin. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 14. Miller, J.M. and H.T. Holmes Specimen collection, transport, and storage, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 15. Martin, W.J Practical method for isolation of anaerobic bacteria in the clinical laboratory. Appl. Microbiol. 22: Allen, S.D., J.A. Siders, and L.M. Marler Isolation and examination of anaerobic bacteria, p In E.H. Lennette, A. Balows, W.J. Hausler, Jr., and H.J. Shadomy (ed.), Manual of clinical microbiology, 4th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 17. Holdeman, L.V., E.P. Cato, and W.E.C. Moore (ed.) Anaerobe laboratory manual, 4th ed. Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg. 18. Engelkirk, P.G., J. Duben-Engelkirk, and V.R. Dowell, Jr Principles and practice of clinical anaerobic bacteriology. Star Publishing Co., Belmont, Calif. 19. Summanen, P., E.J. Baron, D.M. Citron, C.A. Strong, H.M. Wexler, and S.M. Finegold Wadsworth anaerobic bacteriology manual, 5th ed. Star Publishing Co., Belmont, Calif. 20. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley, and S.T. Williams (ed.) Bergey's ManualTM of determinative bacteriology, 9th ed. Williams & Wilkins, Baltimore. 21. Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken (ed.) Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 22. Koneman, E.W., S.D. Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberger, and W.C. Winn, Jr Color atlas and textbook of diagnostic microbiology, 5th ed. J.B. Lippincott Company, Philadelphia. 23. MacFaddin, J.F Biochemical tests for identification of medical bacteria, 3rd ed. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore. 24. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld Bailey & Scott's diagnostic microbiology, 11th ed. Mosby, Inc., St. Louis. Servicio técnico de BD Diagnostics: póngase en contacto con el representante local de BD o visite Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, MD USA Benex Limited Pottery Road, Dun Laoghaire Co. Dublin, Ireland ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company BD 6