BBL CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin (KV)

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1 BBL CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin (KV) Rev. 13 Octubre 2015 PROCEDIMIENTOS DE CONTROL DE CALIDAD (Opcionales) I. INTRODUCCION CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin (KV) (agar sangre de carnero lacada para anaerobios del CDC con kanamicina y vancomicina) es un medio de cultivo enriquecido para el aislamiento selectivo de bacilos gram negativos anaerobios obligados a partir de muestras clínicas y no clínicas. II. REALIZACION DEL PROCEDIMIENTO DE ANALISIS 1. Reducir todas las placas de agar anaerobias de un día para el otro a temperatura ambiente en un sistema anaerobio BD GasPak EZ. 2. Preparación de inóculos a. Para preparar los cultivos de prueba de anaerobios obligados, introducir con una torunda el crecimiento de una placa de agar 5% sangre de carnero para anaerobios del CDC de 2 5 días, en un tubo con 5 ml de medio de tioglicolato enriquecido reducido con vitamina K 1 y hemina. Mezclar bien y ajustar a una turbidez comparable al patrón 0,5 de McFarland. NOTA: Los cultivos deben manipularse rápidamente para evitar una exposición prolongada al oxígeno. El tiempo de exposición total no debe superar los 20 min. b. Utilizar un cultivo de caldo de h de organismos anaerobios facultativos diluidos a Inoculación de las placas a. Utilizando una pipeta volumétrica o un método equivalente, colocar 0,05 ml del inóculo apropiado en las muestras de medios en placa y extender la muestra para aislamiento. Para Proteus mirabilis, utilizar una dilución de 10-3 del cultivo de caldo como inóculo. b. Incluir placas del agar de soja Trypticase con sangre de carnero al 5% (TSA II) como controles para todos los organismos y placas de agar 5% sangre de carnero para anaerobios del CDC como controles para los anaerobios obligados. c. Incubar los controles de placa TSA II en atmósfera aerobia a 35 ± 2 C y todas las demás placas en atmósfera anaerobia (sistema anaerobio GasPak) a 35 ± 2 C. 4. Examinar todas las placas inoculadas a las 48 y 72 h para detectar el crecimiento, el tamaño de las colonias, la pigmentación y las reacciones hemolíticas. Observar las cepas de Porphyromonas y Prevotella bajo luz ultravioleta (365 nm) para detectar fluorescencia. 5. Resultados previstos *Bacteroides fragilis ATCC *Clostridium perfringens ATCC *Fusobacterium mortiferum ATCC Porphyromonas levii ATCC Prevotella intermedia ATCC Escherichia coli ATCC Proteus mirabilis ATCC Crecimiento Inhibición (completa) Crecimiento de promedio a denso a las 72 h. Las colonias tienen un color entre blanco sucio y amarillo tostado, son circulares con bordes entre dentados e irregulares, salientes, a menudo con superficie en desniveles, despareja y rígida. Falta de hemólisis a hemólisis alfa o beta de traza. Crecimiento de traza a denso a las 72 h. Las colonias son de color tostado a marrón medio, hasta negro, con forma circular, enteras, convexas y opacas. Fluorescencia brillante de color rosa a anaranjado hasta rojo ladrillo bajo luz ultravioleta.** Ausencia de crecimiento a crecimiento promedio. Las colonias tienen color gris, son de bajo nivel, convexas, húmedas, semiopacas a opacas, con superficie brillante. Ausencia de crecimiento a crecimiento moderado. Las colonias tienen un color gris claro, son circulares, translúcidas a opacas. Se evidencia una leve propagación. 1

2 Staphylococcus aureus ATCC Inhibición completa **Cepa de organismo recomendada para control de calidad del usuario. **La fluorescencia se detecta sólo en las colonias jóvenes. El pigmento se desarrolla lentamente y puede oscurecer la fluorescencia. NOTA: Según CLSI M22-A3, no es necesario que el usuario realice un control de la calidad de este medio. No obstante, se recomienda controlar los medios exentos utilizados para el cultivo de anaerobios. III. CONTROL DE CALIDAD ADICIONAL 1. Examinar las placas como se describe en la sección Deterioro del producto. 2. Examinar visualmente las placas representativas para asegurarse de que los defectos físicos existentes no interfieran con el uso. 3. Determinar el ph potenciométricamente a temperatura ambiente para verificar el cumplimiento de la especificación de 7,5 ± 0,2. 4. Tomar en cuenta la firmeza de las placas durante el procedimiento de inoculación. 5. Incubar las placas representativas sin inocular a 35 ± 2 C durante 72 h y examinar para detectar contaminación microbiana. INFORMACION DEL PRODUCTO IV. USO PREVISTO CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin se utiliza para el aislamiento selectivo de bacterias gram negativas anaerobias obligadas exigentes y de crecimiento lento, en diversas muestras clínicas y no clínicas. V. RESUMEN Y EXPLICACION El aislamiento de bacterias anaerobias obligadas a partir de muestras clínicas y no clínicas, requiere el uso de medios de enriquecimiento selectivo y no selectivo 1. La selección de medios a utilizar se basa en el tipo de material y los resultados de la observación directa al microscopio. Los medios no selectivos se utilizan para aislar organismos presentes en bajas cantidades y para proporcionar una indicación de los números y tipos de organismos presentes en la muestra. Los medios selectivos se utilizan para facilitar la recuperación de organismos deseados presentes en poblaciones mixtas. CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin fue formulada por Dowell et al de los Centers for Disease Control and Prevention como medio enriquecido selectivo para el aislamiento de Prevotella melaninogenica, Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium nucleatum y otros bacilos gram negativos anaerobios obligados exigentes a partir de muestras clínicas con poblaciones mixtas 2,3. El medio utiliza agar de soja Trypticase BBL suplementado con agar adicional, extracto de levadura, vitamina K 1, hemina, cistina, sangre de carnero al 5%, kanamicina y vancomicina. La combinación de kanamicina y vancomicina para uso en aislamiento selectivo de anaerobios gram negativos fue descrita por primera vez por Finegold et al 4. La vancomicina, sin embargo, puede inhibir a la Porphyromonas asaccharolytica 5. Este medio es similar a CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin excepto que se ha lacado la sangre, sometiéndola a tres ciclos de congelación-descongelación, para mejorar la pigmentación del grupo P. melaninogenica-p. asaccharolytica 4. VI. PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin es un medio altamente nutritivo debido a su contenido de peptonas, extracto de levadura, hemina, vitamina K 1 y sangre de carnero. Las peptonas proporcionan factores de crecimiento nitrogenados, carbono, azufre y otros elementos de traza. El extracto de levadura es una fuente importante de las vitaminas B. El cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico. La sangre de carnero, la hemina, la cistina y la vitamina K 1 proporcionan nutrientes esenciales para determinados anaerobios obligados 3,6-9. La sangre lacada mejora la pigmentación de Prevotella y Porphyromonas. La adición de agentes antimicrobianos, kanamicina y vancomicina, hace al medio selectivo para microorganismos gram negativos. La kanamicina inhibe la síntesis de proteína en organismos sensibles, mientras que la vancomicina inhibe las bacterias gram positivas interfiriendo con la síntesis en la pared celular 10. 2

3 VII. REACTIVOS CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin Fórmula aproximada* por litro de agua purificada Digerido pancreático de caseína... 15,0 g Digerido papaico de harina de soja... 5,0 g Cloruro sódico... 5,0 g Agar... 20,0 g Extracto de levadura... 5,0 g Hemina... 0,005 g Vitamina K ,01 g L-cistina... 0,4 g Kanamycin... 0,1 g Vancomicina... 0,0075 g Sangre de carnero, desfibrinada, lacada... 5% *Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento. Advertencias y precauciones Para uso diagnóstico in vitro. Si se observa humedad en exceso, invertir la parte inferior sobre una tapa desplazada y permitir que se seque al aire para impedir que se forme una barrera estanca entre la parte superior y la inferior de la placa durante la incubación. En las muestras clínicas puede haber microorganismos patógenos, como el virus de la hepatitis y el virus de la inmunodeficiencia humana. Para la manipulación de todos los elementos contaminados con sangre u otros líquidos corporales deben seguirse las precauciones estándar y las directrices del centro. Después de su uso, las placas preparadas, los recipientes de muestra y otros materiales contaminados deben esterilizarse en autoclave antes de ser desechados. Instrucciones para el almacenamiento Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a 2 8 C. No congelar ni sobrecalentar. No abrir hasta que vayan a utilizarse. Reducir al mínimo la exposición a la luz. Las placas preparadas almacenadas en su envase original a 2 8 C hasta momentos antes de su utilización, pueden inocularse hasta la fecha de caducidad en incubarse durante los tiempos de incubación recomendados. Dejar que el medio alcance temperatura ambiente antes de realizar la inoculación. Deterioro del producto No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación o cualquier otro signo de deterioro. VIII. RECOGIDA Y MANIPULACION DE LAS MUESTRAS Se han diseñado diversos recipientes y torundas para recolectar las muestras. Las muestras deben obtenerse antes de administrar el tratamiento antimicrobiano. Deben adoptarse las medidas necesarias para un transporte inmediato al laboratorio. Se han diseñado varios medios de conservación o sistemas de transporte tales como los productos de recogida y transporte de muestras BBL para prolongar la supervivencia de los microorganismos cuando se prevé una demora significativa entre la recogida y el cultivo definitivo. Consultar los textos correspondientes para conocer los detalles relativos a los procedimientos de recogida y manipulación de muestras. 15,16 El laboratorio debe contar con información clínica suficiente para permitir al especialista en microbiología seleccionar los medios más adecuados y técnicas apropiadas. IX. PROCEDIMIENTO Material suministrado CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin Materiales necesarios pero no suministrados Medios de cultivo auxiliar, reactivos, organismos para el control de calidad y el equipo de laboratorio que se requiera. Procedimiento de análisis Emplear técnicas asépticas. La superficie del agar debe ser lisa y húmeda pero sin humedad en exceso. 3

4 Extender la muestra tan pronto como sea posible después de recibirla en el laboratorio. Reducir al mínimo la exposición a la luz. En el caso de muestras líquidas, los medios deben inocularse con 1 gota de la muestra. Las muestras de tejido deben triturarse y pulverizarse en un caldo estéril tal como el medio de caldo enriquecido BBL antes de su inoculación. Luego se realiza la inoculación como en las muestras líquidas. Las muestras de torunda pueden hacerse rodar sobre el primer cuadrante de los medios en placa y luego utilizarse para inocular los medios líquidos. También la torunda puede fregarse en un pequeño volumen de caldo reducido y éste puede utilizarse para inocular los medios de la misma manera que las muestras líquidas. Este medio debe reducirse inmediatamente antes de la inoculación, colocándolo en condiciones anaerobias durante 6 24 h 17. Una manera fácil y eficaz para obtener condiciones anaerobias apropiadas es por medio del uso de los sistemas anaerobios Gaspak EZ. Los medios en placa deben inocularse usando el método de extensión en placa para obtener cultivos puros a partir de muestras con flora mixta. Un caldo de enriquecimiento tal como el medio de tioglicolato enriquecido BBL debe inocularse al mismo tiempo que las placas de aislamiento primario. Incubar inmediatamente en condiciones anaerobias o colocar en un frasco de contención lleno de gas(es) libres de oxígeno hasta que haya suficientes placas acumuladas (pero sin superar las 3 h) 18. Proteger de la luz. La incubación debe ser a 35 ± 2 C durante al menos 48 h y hasta un máximo de 7 días. Independientemente del sistema anaerobio utilizado, es importante incluir un indicador de anaerobiosis tal como el indicador anaerobio GasPak. Control de calidad del usuario Véase Procedimientos de control de calidad. Cada lote de medios se ha probado con los microorganismos de control de calidad adecuados mediante una prueba que cumple las especificaciones del producto y los criterios aplicables del CLSI. Como siempre, las pruebas de control de calidad se deben llevar a cabo conforme a la normativa local, estatal, federal o nacional aplicable, a los requisitos de los organismos de acreditación y/o a los procedimientos estándar de control de calidad del laboratorio. X. RESULTADOS Después de la incubación, la mayoría de las placas mostrarán un área de crecimiento confluente. Dado que el procedimiento de extensión de la muestra es una técnica de dilución, se depositan cada vez menos microorganismos en las áreas extendidas. Por consiguiente, una o más de estas áreas presentarán colonias aisladas de los organismos que contenga la muestra. Por otra parte, el crecimiento de cada microorganismo podrá medirse semi-cuantitativamente basándose en el crecimiento ocurrido dentro de las áreas en que se realiza la extensión. Examinar las colonias con un microscopio de disección y con una lámpara de luz ultravioleta de longitud de onda larga (las colonias de las especies Porphyromonas-Prevotella con pigmentación deben presentar una fluorescencia anaranjada a roja ladrillo bajo luz ultravioleta). La fluorescencia es visible antes de la pigmentación. Para determinar la relación en cuanto al oxígeno de cada tipo de colonia presente en el medio sólido anaerobio, inocular los siguientes medios 17 : 1. Una placa de agar sangre anaerobia para incubar en atmósfera anaerobia. 2. Una placa de agar sangre aerobia (o agar chocolate) para incubar en una atmósfera aerobia enriquecida con dióxido de carbono. El agar chocolate es necesario en especial para distinguir la especie Haemophilus exigente para la nutrición, además de otras bacterias que crecerán en el agar sangre anaerobio incubado en atmósfera anaerobia y en el agar chocolate a una mayor presión de dióxido de carbono, pero que no pueden crecer en agar sangre en presencia de dióxido de carbono o en el aire. 3. Una placa de agar sangre aerobia para incubar en atmósfera aerobia sin dióxido de carbono añadido. 4. Tubos de medio de tioglicolato enriquecido y/o medio de carne cocida y un tubo de caldo de peptona, extracto de levadura y glucosa. Incubar todos los cultivos a 35 ± 2 C durante un mínimo de 24 h y hasta un máximo de 7 días. Registrar la relación con el oxígeno, ya sea anaerobio obligado o no anaerobio (anaerobio aerotolerante, microaerofílico, o anaerobio facultativo) 17. Los organismos que no crezcan en las placas de subcultivo aerobias pueden suponerse organismos anaerobios obligados, en materia de requisitos de oxígeno. 4

5 Las colonias del tipo o tipos que resulten ser anaerobios obligados pueden estudiarse posteriormente utilizando los cultivos de caldo correspondientes. Consultar los textos apropiados para más información incluidos los procedimientos de identificación 8,9, XI. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La concentración de vancomicina (7,5 µg/ml) puede inhibir la especie Porphyromonas asaccharolytica 5,23. Algunas pruebas diagnósticas pueden realizarse con la placa primaria. Sin embargo, se recomienda un cultivo puro para las pruebas bioquímicas y otros procedimientos de identificación. Consultar los textos correspondientes para obtener información detallada y los procedimientos recomendados 22, Un solo medio es rara vez es adecuado para detectar todos los organismos de importancia posible en una muestra. Se debe reconocer que los organismos generalmente sensibles a un agente microbiano en un medio selectivo pueden verse inhibidos parcial o completamente según la concentración del agente, las características de la cepa microbiana y el número de organismos en el inóculo. Los organismos generalmente resistentes al agente microbiano no deben presentar inhibición. Los cultivos de muestras cultivadas en medios selectivos por consiguiente deben compararse con muestras cultivadas en medios no selectivos para obtener información adicional y favorecer la recuperación de patógenos potenciales. XII. CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Antes de su lanzamiento al mercado, todos los lotes de CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin (KV) se analizan para determinar sus características de rendimiento. Se inoculan por extensión muestras representativas del lote con 0,05 ml de los siguientes cultivos: Bacteroides fragilis (ATCC 25285), Clostridium perfringens (ATCC 13124), Fusobacterium mortiferum (ATCC 25557), Porphyromonas levii (ATCC 29147), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Escherichia coli (ATCC 25922), Proteus mirabilis (ATCC 12453) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Los inóculos para B. fragilis, C. perfringens, F. mortiferum, P. levii y P. intermedia se extraen de colonias cultivadas en placas de CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar y se ajustan a un patrón 0,5 de McFarland en medio de tioglicolato reducido y enriquecido. Los inóculos para E. coli y S. aureus se extraen de un cultivo de caldo y se diluyen a 10-1 ; el inóculo para P. mirabilis se extrae de un cultivo de caldo y se diluye a Después de la inoculación las placas deben incubarse a 35 ± 2 C en un sistema GasPak. Se efectúa la lectura de las placas después de una incubación de 48 h B. fragilis, F. mortiferum, P. levii y P. intermedia muestran crecimiento de traza a densa con morfología típica de colonias y reacciones hemolítica, mientras que E. coli y P. mirabilis muestran crecimiento de traza a densa. En comparación con el control no selectivo, el tamaño de colonias de E. coli se ve reducido, y la agrupación activa se reduce con P. mirabilis. Se encuentran inhibidas C. perfringens y S. aureus. Al examinarse bajo luz ultravioleta (365 nm), P. levii y P. intermedia muestran una fluorescencia color rosa intensa a anaranjado brillante y rojo ladrillo. XIII. DISPONIBILIDAD Nº de cat. Descripción BD BBL CDC Anaerobe Laked Sheep Blood Agar with Kanamycin and Vancomycin (KV), pqt. de 20 placas XIV.REFERENCIAS 1. Dowell, V.R., Jr Wound and abscess specimens, p In A. Balows (ed.), Clinical microbiology. How to start and when to stop. Charles C. Thomas, Springfield, Ill. 2. Dowell, V.R., Jr., G.L. 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