Estudio de la fosforilación de eif4e y del factor 4E T en situaciones de estrés celular en cáncer de mama

Transcripción

1

2 I

3 II

4 DepartamentodeBiologíayBioquímicaMolecular EstudiodelafosforilacióndeeIF4Eydelfactor4ET ensituacionesdeestréscelularencáncerdemama MemoriadeTesisDoctoralpresentadaporAlbaMartínezDíazparaoptaral gradodedoctoraenlauniversidadautónomadebarcelona. TrabajorealizadoenelDepartamentodePatologíaMoleculardelHospital UniversitarioValld Hebron,bajoladireccióndelDr.SantiagoRamónyCajal AgüerasydelDr.TrondAasen. Barcelona,2014 Doctoranda Director Codirector Tutor Alba Santiago Trond Anna Martínez RamónyCajal Aasen Meseguer III

5 IV

6 Amispadresyabuelas, atiagus, yenespecialamisyayos,avelinoyfélix V

7 VI

8 Lacienciasecomponedeerrores, queasuvez, sonlospasoshacialaverdad JulioVerne VII

9 VIII

10 ÍNDICE IX

11 X

12 Índicedefiguras...XVII Índicedetablas...XXI Abreviaturas...XXV Resumen...XXXI 1.INTRODUCCIÓN Traducción(Síntesisdeproteínas) Regulacióndelatraduccióncapdependiente Iniciodelatraduccióncapdependiente FactoresimplicadosenlaformacióndelcomplejoeIF4F...7 eif4e...7 eif4a...7 eif4g eIF4E FuncióndeeIF4E eIF4Ecomofactordeiniciodelatraduccióncapdependiente eIF4EcomotransportadordemRNAsdenúcleoacitoplasma OtrasfuncionesdeeIF4E RegulacióndeeIF4E EBPs RegulacióneIF4EvíaMnk1/ Mnks EfectosdelafosforilacióndeeIF4E OtrasmodificacionesyregulacióndeeIF4E Traducciónycáncer eIF4Eycáncer PapeldelafosforilacióndeeIF4Eencáncer eIF4Eencáncerdemama Transiciónepiteliomesénquima(EMT) Cadherinas PapeldeeIF4Eenlainvasiónymigracióncelular ET Regulación4ET Función4ET Estréscelular...33 XI

13 XII 1.6.1Gránulosdeestrés(GS) Processingbodies(PBs) HUR(ELAVlikeRNAbindingprotein1) Ago eIF4Eenestrés eIF4Ey4ETenestrés HIPÓTESISDELTRABAJO OBJETIVOS MATERIALESYMETODOS Cultivoscelulares Recuentodecélulas Construccióndelosplásmidos Transformación AislamientodelDNA Generaciónderetroviruseinfección Generacióndelentiviruseinfección TransfecciónconsiRNAS Estréscelular Ensayoclonogénico Ensayodemigracióncelular Ensayodeinvasióncelular EnsayoMTT Deteccióndeapoptosis Extraccióndeproteínas Cuantificacióndeproteínas Westernblot Inmunoprecipitación Ensayo7MethylGTPSepharosapulldown Inmunocitofluorescencia Perfilpolisómico ExtracciónRNApolisomas SíntesisdecDNA PCRconretrotranscriptasa(RTPCR)atiemporeal Obtencióndemuestrasdetumores...69

14 4.26Inmunohistoquímicadelasmuestrastumorales Evaluacióninmunohistoquímicadetumores Análisisestadísticodelasmuestrastumorales RESULTADOS EstudioinvitrodelafuncióndelafosforilacióndeeIF4E FosforilacióndeeIF4Eyresistenciaaestréscelular LafosforilacióndeeIF4Eaumentalacapacidaddeformacióndecolonias La fosforilación de eif4e incrementa la resistencia a diferentes situaciones de estrés LafosforilacióndeeIF4Eprevienelaactivacióndelaapoptosis LainhibicióndelafosforilaciónendógenadeeIF4Eincrementalasensibilidada estrés ElmutanteeIF4ES209Dformaunoscuerposcitoplasmáticosconelevadaafinidad hacia4et ElcomplejopeIF4E/4ETinteraccionaconlasproteínasHuRyAgo ElcomplejopeF4E/4ETjuegaunpapelimportantebajosituacionesdeestrés Ago2 y HuR juegan un papel importante junto al complejo peif4e/4et en la recuperacióncelular ElmutanteS209DdeeIF4Emedialasíntesisproteicadeciertasproteínastrasel estrés EstudioinvitrodelafuncióndeeIF4ETransporter(4ET) Lasobreexpresiónde4ETincrementalamigraciónylainvasióncelular Serequierelaunión4ET/eIF4Eparaqueseproduzcaunincrementoeninvasióny migración eIF4EtienequeestarfosforiladoenelcomplejoeIF4E/4ETparaqueseproduzcaun aumentoenlacapacidadmigratoriaeinvasivadelacélula peIF4Eencáncerdemama ETencáncerdemama DISCUSIÓN EstudiodelafosforilacióndeeIF4Eensituacionesdeestrés LafosforilacióndeeIF4Eincrementalaresistenciaaciertassituacionesdeestrés LafosforilacióndeeIF4Eprevienelaactivacióndelaapoptosis Elmutantefosfomiméticoformaunoscuerposcitoplasmáticosconelevadaafinidad hacia4et XIII

15 6.1.5ElmutantefosfomiméticodeeIF4Emedialasíntesisproteicadeciertasproteínastras elestrés Estudioinvitrodelafunciónde4ET Serequierelaunión4ET/peIF4Eparaqueseproduzcaunincrementoeninvasióny migración peIF4Eencáncerdemama ETencáncerdemama CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXO AGRADECIMIENTOS XIV

16 ÍNDICEDEFIGURAS YTABLAS XV

17 XVI

18 Índicedefiguras Introducción Figura1:Fasesdelatraducción.. 4 Figura2:OrganizacióndetripletesdelasecuenciadelmRNA Figura3:Mecanismodeiniciodelatraducción..8 Figura4:ModelodelasdosfuncionesconocidasdeeIF4E:exportacióndemRNAsytraducción capdependiente.14 Figura5:EsquemadelasvíasderegulacióndeeIF4E..15 Figura6:Señalesdeidentidaddelcáncer.21 Figura7:NiveleselevadosdeeIF4Eincrementanlatumorigénesis 23 Figura 8: Vía de activación de la invasión celular mediante el complejo Ncadherina y FGFR Figura9:Representaciónesquemáticadelosseislugaresdefosforilaciónde4ETporJNK 31 Figura10:4ETmedialaimportacióndeeFI4Eanúcleo 33 Figura11:ModelohipotéticoentrelarelacióndeGSyPBs...35 Figura12:ComponentesdelosPBsyGS..36 Figura13:Esquemarepresentativodelroledelafosforilaciónde4ETenPBs.38 Materialesymétodos Figura14:CámaradeNeubauer..53 Figura15:MapaderestricciónvectorpCS3MTypLPCX.55 Figura16:MapaderestriccióndelvectorpBABE 56 Figura17:Mapaderestriccióndelvectorsh4ETpLKO.1puro 57 Resultados Figura18:NivelesdelaexpresióndeeIF4EyMyctag 75 Figura19:EnsayodeproliferacióncelularmedianteMTT 76 XVII

19 Figura20:Tinciónconcristalvioletadelensayodeformacióndecoloniasrealizadoenlaslíneas celularesmdamb231yhacat..77 Figura21:Efectoenlaproliferaciónyresistenciacelulardediferentestiposdeestrés.79 Figure22:Actividadapoptóticamedidaconelensayodeluminiscenciacaspasa3/7.80 Figura23:WesternblotdelosnivelesdeeIF4Efosforilado(peIF4E)yeIF4E.80 Figura24:LainhibicióndelafosforilacióndeIF4Edisminuyelaresistenciaaestrés 81 Figura25:NivelesdepeIF4EenMEFWTyMEFKO..82 Figura26:LainhibicióndelafosforilacióndeeIF4Einhibelarecuperacióntraseltratamiento conarsénicoycisplatino 82 Figura27:ColocalizacióndelmutanteS209DenlaslíneascelularesMDAMB231yHaCaTcon 4ET..84 Figura28:InmunoprecipitacióndeeIF4Ey4ET..85 Figura29:InmunofluorescenciaenlalíneacelularMDAMB231conlasobreexpresióndeeIF4E S209AyeIF4ES209D,de4ETconlosmarcadoresdeGS(TIA1)yPBs(DCP1A) 86 Figura30:Inmunoprecipitaciónde4ET,Ago2yHuR..87 Figura31:Lainhibiciónde4ETendógenodisminuyelacapacidaddeS209Dderecuperarsetras unestréscelular..88 Figura32:EsnecesarialaunióndeeIF4Ea4ETyqueeIF4Eestéfosforiladoparaquesedéla recuperacióntraselestréscelular.89 Figura 33: 4ET por sí solo no permite la recuperación celular tras el tratamiento con arsénico.89 Figura34:LainhibicióndeAgo2yHuRevitalarecuperacióncelulardelmutanteS209Dtrasel tratamientoconarsénico.90 Figura 35: eifes209d inhibe rápidamente la síntesis proteica tras el tratamiento con arsénico.91 Figura 36: Se observa un incremento de la síntesis proteica en células que sobreexpresan el mutantes209d.92 Figura37:QPCRdelmRNAdeCiclinaD1yMcl1delafracciónpolisomal.93 Figura38:Nivelesbasalesde4ETenlasdiferenteslíneascelulares...93 Figura39:Lasobreexpresiónde4ETincrementalosnivelesdeNcadherina 94 Figura 40: Los marcadores de EMT Slug, Twist y Snail no se ven aumentados por la sobreexpresiónde4et..95 XVIII

20 Figura41:Lasobreexpresiónde4ETincrementalosnivelesdeMMP9yMMP3 96 Figura42:EnsayodeproliferacióncelularmedianteMTTdelmutantede4ETY30A,4ETWTy sh4et 97 Figura43:Lasobreexpresiónde4ETconfieremáscapacidadmigratoria Figura44:MTTalas24horasconmitomicinaC..98 Figura45:Lasobreexpresiónde4ETconfieremáscapacidadinvasiva.99 Figura46:Lainhibicióndel4ETendógenodisminuyelacapacidadmigratoriaeinvasivadelas células.99 Figura 47: La unión de 4ET y eif4e es necesaria para el incremento en migración e invasión debidoa4et..100 Figura 48: La fosforilación de eif4e es necesaria para que la unión 4ET/eIF4E incremente la migraciónylainvasióncelular 101 Figura49:Inmunohistoquímicade4ET,peIF4EnuclearyHuR.105 Figura 50: Análisis por western blot del grado de expresión de peif4e y eif4e en diferentes tumoresdelaserieclínicadeestudio 106 Figura51:Inmunohistoquímicadelaexpresiónde4ET,YB1,pYB1,Ago2yNcaderinaendos tumoresdelaserieclínicadeestudio 107 Discusión Figura52:PosiblerelaciónentreGSyPBs..116 Figura53:Modelodelaposiblevíadeactivacióndelainvasiónymigracióncelular.121 XIX

21 XX

22 Índicedetablas Introducción Tabla1:Descripcióndelosdiferentesfactoresdeiniciaciónyproteínasimplicadaseneliniciode latraducción.9 Tabla2:EjemplosdeproteínasdeuniónaeIF4E...11 Materialesymétodos Tabla 3: Dosis del antibiótico puromicina utilizadas para la selección de las líneas celulares infectadas. 59 Tabla4:Soluciónparaprepararelgelconcentrador 65 Tabla5:Soluciónparaprepararelgelseparador 65 Tabla6:Anticuerposutilizadosparawesternblot.66 Tabla7:Anticuerposprimariosutilizadosenlasinmunohistoquímicas..71 Resultados Tabla8:Característicasdelaseriedetumoresdemamaanalizados.102 Tabla9:TestdecoeficientedecorrelacióndeSpearmandeeIF4Etotalyfosforilado(nucleary citoplasmático)condiferentescaracterísticasclínicopatológicas 103 Tabla10:Nivelesdeexpresióndemarcadoresanalizadosenlaserieclínicade77tumoresde mama 104 Tabla11:TestdecoeficientedecorrelacióndeSpearmandeeIF4Etotalyfosforilado(nucleary citoplasmático)con4et,ago2yhur..104 Tabla12:Significanciaycoeficientedecorrelaciónde4ETconYB1,pYB1,Ago2,Ncaderonay peif4enuclear 106 XXI

23 XXII

24 ABREVIATURAS XXIII

25 XXIV

26 Abreviaturas 4ET:TransportadordeeIF4E(eIF4Etransporter) A:Adenina Ago2:Argonaute2 AMD:DegradacióndeelementosARE(AREmediateddecay) ARE:mRNAsquecontienenelementosARE(ricosenAU)(AURichElements) ATM:Proteinkinaseataxiatelangiectasiamutated ATP:Adenosíntrifosfato BclX:Bcelllymphomaextralarge BIRC2:BaculoviralIAPrepeatcontaining2 BRSK2:BRserine/threoninekinase2 BSA:Albúminaséricabovina BTF3:Basictranscriptionfactor3 C:Citosina Cap:Guanosinatrifosfatometilada CDDP:Cisplatino CDK1:QuinasadependientedeCiclina1 CGP:N3(4Fluorophenyl)1Hpyrazolo[3,4d]pyrimidine3,4diamine CK1:Caseinkinase1 COX2:Ciclooxigenasa2 CPE:Cytoplasmicpolyadenylationelement CPEB: Proteína citoplasmática de unión a elementos poliadenilados (Cytoplasmic polyadenylationelementbindingprotein) CRM1:Chromosomalregionmaintenance1 CYFIP1:CytoplasmicFMR1interactingprotein1 Dcp:DecappingmRNA DMSO:Dimetilsulfòxid DNA:Ácidodesoxiribonucleico dntps:desoxinucleótidostrifosfato DTT:Ditiotreitol EDTA:Ácidoetilendiaminotetraacético EGF:Factordecrecimientoepidérmico(EpidermalGrowthFactor) eif:factordeiniciodelatraduccióneucariota(eukaryoticinitiationfactor) EMT:Transiciónepiteliomesénquima XXV

27 EMX2:Emptyspiracleshomeobox2 ERK:Quinasareguladoradeseñalesextracelulares(Extracellularsignalregulatedkinases) FGF:Factordecrecimientodefibroblastos(FibroblastGrowthFactors) FGFR:Receptordelfactordecrecimientodefibroblastos(FibroblastGrowthFactorReceptors) FXR1:FragileXMentalRetardation,AutosomalHomolog1 G3BP:RasGAPSH3domainbindingprotein GDP:Guanosíndifosfato GFP:Proteínaverdefluorescente(GreenFluorescentProtein) GS:Gránulosdeestrés GTP:Guanosíntrifosfato HCL:Ácidoclorhídrico HEPES:Ácido2[4(2hidroxietil)1piperacinil(1)]etanosulfónico hnrnp:heterogeneousnuclearribonucleoproteins HuR:ELAVlikeRNAbindingprotein1 IF:Inmunofluorescencia IHQ:Inmunohistoquímica IP:Inmunoprecipitación Jnk:QuinasascJunNterminal(JunNterminalkinase) KCL:Clorurodepotasio kda:kilodalton KI:Knockin KO:Knockout LB:CaldodeLisogenia(Lysogenybroth) LRRC:leucinerichrepeatprotein LSm1:U6smallnuclearRNAassociated MAPK:Proteínasquinasasactivadaspormitógenos(MitogenActivatedProteinKinase) MEF:Fibroblastosembrionariosderatón(MouseEmbryonicFibroblast) MEK:Proteínaquinasaactivadapormitógenos(MAPkinasekinase) Met:Metionina MgCl 2 :Clorurodemagnesio MKK1:Proteínaquinasaactivadapromitógenos(Mitogenactivatedproteinkinasekinase) MMPs:Metaloproteinasasdelamatriz(Matrixmetalloproteinases) Mnk: Proteínas quinasas activadas por mitógenos que interaccionan con quinasas [(Mitogen ActivatedProteinKinase)InteractingKinase] mrna:rnamensajero MTA1:Metástasisassociated1 XXVI

28 mtor:mammaliantargetofrapamycin MTT:(3(4,5dimethylthiazol2yl)2,5diphenyltetrazoliumbromide) Myc:OncogénviralhomólogodeMielocitomatosisaviarVmyc Na 3 VO 4 :Ortovanadatodesodio NaAsO 2 :Arsenitodesodio NaCl:Clorurodesodio NaF:Fluorurodesodio NaOAc:Acetatodesodio NaPPi:Pirofosfatotetrasódico NES:Señaldeexportaciónnuclear(NuclearExportSignal) ng:nanogramos NLS:Señaldelocalizaciónnuclear(NuclearLocalizationSignal) NMD:NonsensemediatedmRNAdecay NPC:Complejodeporonuclear(nuclearporecomplex) NTP:Nucleótidotrifosfato OCT:Mediodecongelación(OptimalCuttingTemperatur) ODC:Ornitinadescarboxilasa PABP:ProteínadeunionaPolyA(Poly(A)bindingprotein) PBs:Processingbodies PBS:Tampondefosfatosalino(PhosphateBufferSaline) PCR:Reacciónencadenadelapolimerasa PERK:ProteinkinaseRNAlikeendoplasmaticreticulumkinase PI3K:Fosfoinositol3quinasas(phosphatidylinositol3kinase) Pkc:ProteínaquinasaC PKR:DoublestrandedRNAdependentproteinkinasePKR PML:Progressivemultifocalleukoencephalopathy PMSF:fluorurodefenilmetilsulfonilo PP2A:Proteinphosphatase2A PSF:Proteinassociatedsplicingfactor PVDF:PolyvinylideneFluoride QPCR:PCRcuantitativa r.p.m.:revolucionesporminuto Raf:Proteínaquinasaserinatreonina RISC:ComplejodesilenciamientoinducidoporRNA(RNAinducedsilencingcomplex) RNA:Ácidoribonucleico ROS:Especiesreactivasdeoxigeno(ReactiveOxygenSpecies) XXVII

29 RQ:Métodocomparativo,estudiodelaexpresióndelosgenes(oPCR) RTPCR:PCRconretrotranscriptasainversa SDS:Dodecilsulfatosódico shrna: Short hairping RNA. ARN de interferencia pequeño con conformación de horquilla, codificadoenunvectordeexpresión sirna:smallinterferencerna.arndeinterferenciapequeñoconconformaciónlineal SMN:Survivalofmotorneuron1 SUMO:Smallubiquitinlikemodifier T:Timina TBS:TrisBufferSaline TEMED:N,N,N',N'tetrametiletilenodiamina TIA1:TIA1cytotoxicgranuleassociatedRNAbindingprotein TNF:Tumornecrosisfactor Tris(Trizma):tris(hidroximetil)aminometano Triton:octylphenolethoxylate trna:rnadetransferencia TTBS:Tween20enTBS TTP:Tristetraprolin U:Uracilo UTR:Regiónnotraducida(Untranslatedregión) UV:Ultravioleta VEGF:Factordecrecimientoendotelialvascular(VascularEndothelialGrowthFactor) VPg:viralproteingenomelinked WB:westernblot WT:Wildtype Xrn1:5'3'exoribonuclease1 YB1:Yboxbindingprotein1 ZEB:ZincfingerEboxbindinghomeobox g:microgramos l:microlitro XXVIII

30 RESUMEN XXIX

31 XXX

32 Resumen En los últimos años se ha descrito la desregulación de la síntesis proteica en muchas enfermedades,estohaincrementadolainvestigacióndenuevosmecanismosquecontrolanla expresión génica, en particular a nivel del inicio de la traducción. La mayor enfermedad con alteraciones en la traducción de mrnas es el cáncer, donde sehan encontrado desregulados variosfactoresimplicadoseneliniciodelatraducción,incluyendoelefi4e,eif4gy4ebps. Hipotetizamosquelaregulacióndeliniciodelatraducciónesimportanteparalarespuestayla resistencia al estrés celular que ocurre durante el desarrollo del tumor. Nuestro estudio se centraenelfactordeiniciodelatraduccióneif4e(ysuproteínadeunión4et)encáncerde mama,dondesehaobservadoqueelevadosnivelesdeeif4eseencuentranasociadosconla malignidadyunpeorpronóstico.lafosforilacióndelaserina209deefi4epareceseresencial paralaspropiedadestumorigénicasdeeif4e.hemosanalizadoelroldelafosforilacióndeeif4e en diferentes líneas celulares tumorales bajo diferentes situaciones de estrés como el tratamiento conarsénico(estrésoxidativo),ladeprivacióndenutrientesyeltratamientocon drogasquimioterapéuticas(cisplatino).mediantelautilizacióndeunmutantehipofosforiladoy un mutante fosfomimético de eif4e, observamos que la fosforilación de eif4e aumentaba la resistenciacelulartrasunasituacióndeestrés,asícomoinhibíalaapoptosis,correlacionándose con un aumento de ciertas proteínas relacionadas con la proliferación, como es el caso de Ciclina D1, y un incremento de proteínas antiapoptóticas, como es el caso de Mcl1. El tratamientoconarsénicoconduceaunbloqueomayordelatraduccióndeproteínasencélulas que expresan el mutante fosfomimético, una vez regresado a las condiciones normales la sobreexpresión de este mutante permite una recuperación más rápida de la síntesis de proteínasnormal. La sobreexpresión del mutante fosfomimético conduce a la formación de unos cuerpos citoplasmáticos que colocalizan con la proteína 4ET. Este complejo peif4e/4et también interaccionaconlasproteínasago2yhur.lainhibicióndelaexpresiónde4et,hury/oago2, inhibelarecuperacióncelular,trasdeterminadassituacionesdeestrés,mediadaporpeif4e. Debido que la interacción de eif4e con 4ET parece ser esencial para la función de la fosforialción de eif4e en respuesta a estrés, especulamos que este factor también juega un papelimportanteenelprocesotumorigénico.enefecto,lasobreexpresiónde4etincrementa losnivelesdencadherinaydelasmetaloproteinasas3y9.aparteseobservaunincremento delamigracióneinvasiónalsobreexpresar4et;porelcontrario,observamosunadisminución delainvasiónymigraciónalinhibirlaexpresiónde4etoalutilizarelmutantede4etincapaz deunirseaeif4eo,cuandoinhibimoslafosforilacióndeeif4e.estosresultadosnosindicanque lainteracciónpeif4e/4etregulalainvasiónylamigracióncelular. Finalmente, realizamos unas inmunohistoquímicas de 77 tumores de mama. Se encontraron altosnivelesdeeif4ey peif4e,loscualessecorrelacionabanconeltamaño deltumor.enel casode4et,estecorrelacionabaconaltosnivelesdencadherina,talycomoobservamosin vitroalsobreexpresar4et. Enconclusión,hemosidentificadoelcomplejopeIF4E/4ETcomouncomplejoreguladordela resistencia a estrés y de la invasión y migración celular. El estudio de este complejo ofrece nuevasoportunidadesterapéuticascontraelcáncer. XXXI

33 XXXII

34 INTRODUCCIÓN 1

35 2

36 1.INTRODUCCIÓN 1.1Traducción(Síntesisdeproteínas) Lasíntesisproteicaotraducciónpermiteenúltimotérminoquelainformacióngenética almacenadaenlasmoléculasdelosácidosnucleicosseplasmeenformadeproteínas,queson loscomponentesestructuralesyfuncionalesbásicosparalaorganizaciónyelfuncionamientode lacélula(grayandwickens1998).esdecir,eselprocesoporelcuallainformacióncontenidaen elrna(ácidoribonucleico)mensajero(mrna)estraducidaaproteínas.esteprocesotienelugar enlosribosomasdelcitoplasmacelular.estádivididoentresfases:lainiciación,laelongacióny la terminación (Figura 1). El inicio de la traducción requiere diferentes factores denominados eifs(factoresdeiniciodelatraduccióneneucariotas)(kozak1999);estosfactoresactúanen conjuntoparaunirelribosomaaunmrnaypermitenqueesteseaescaneadohastallegaral codóndeiniciodelatraducción(enun95%deloscasosaug)(kozak1984).losribosomasson complejos macromoleculares formados por proteínas y RNAs ribosomales (rrnas), los cuales están divididos en dos subunidades diferentes, la subunidad pequeña, con un coeficiente de sedimentaciónde40s(formadaporunasolamoléculaderrnay33proteínasdiferentes)yla subunidad grande con un coeficiente de sedimentación de 60 S (formada por tres tipos de rrnas:5s,28sy5,8sy49proteínasdiferentes);sufunciónesfacilitarlasíntesisdelpéptido utilizandolasecuenciadeaminoácidosdefinidaporelmrna(doudnaandrath2002). ElmRNAeselácidoribonucleicoquecontienelainformacióngenéticaprocedentedelDNA,es elresultadodelatranscripcióndeungencodificadordeunacadenapolipeptídicadeterminada, se trata de un ácido nucleico monocatenario. Determina el orden en que se unirán los aminoácidosdeunaproteínayactúacomoplantillaparalasíntesisdedichaproteína;también marca cuando empieza y acaba el proceso de traducción mediante codones de inicio y finalizacióndelatraducción.lasecuenciadelmrnaestádescritapor4basesnucleotídicasa (adenina), U (Uracil), C (Citosina) y G (guanina) y es leída por el ribosoma de forma unidireccionalentripletesensentido5 3.Elcodóndeiniciodelatraduccióngeneralmentees AUGycomocodóndefinalizacióndelatraducciónencontramostresdiferentes:UAG,UAAo UGA (Brenner, Stretton et al. 1965; Hinnebusch 2011). Las secuencias distales se denominan región 5 no traducidas (5 UTR) o región 3 no traducida (3 UTR) (Gingras, Raught et al. 1999)(Figura2). Ensuextremo5 terminalpodemosencontrarunaguaninametiladaoestructuracap,m 7 GpppX (donde X es cualquier nucleótido) (Banerjee 1980); el grupo fosfato que se encuentra en el extremoterminal5 eseliminadomediantelaaccióndeunafosfatasacreándoseunextremo5 difosfato, este extremo se une con GTP (guanosina trifosfato) para formar un enlace 5 5 trifosfato; seguidamente la guanina es metilada por una metiltransferasa formándose la estructuracap(kappandlorsch2004).laestructuracapproporcionaunlugardeunióndelos factoresdeiniciodelatraducciónparaquesepuedaproducirlatraduccióncapdependiente,a parte,protegeelmrnadeladegradaciónporexonucleasas. En el extremo 3 terminal encontramos la cola poly(a), compuesta por un promedio de 250 residuosdeadenina(wickens1990)confiereestabilidadalmrna(walther,wittopkoningetal. 1998)yfacilitalaunióndelosfactoresdeiniciodelatraducciónalforzarqueelmRNAtenga 3

37 unaconformacióndebuclecerrado(munroeandjacobson1990;tarunandsachs1995),estose logragraciasalaproteínadeuniónapoly(a)(pabps),lacualseasociaconlacolapoly(a)ycon elcomplejoeif4geif4e,elcualselocalizaenelextremo5 delmrna. Figura 1: Fases de la traducción. A) proceso de inicio de la traducción donde intervienen las dos subunidadesribosomales,mrnayeltrna.b)elongacióndelatraducción,incorporacióndeaminoácidos atravésdelosdoslugaresdeunión,ayp.c)finalizacióndelatraducción(murray,d.etal.1997). 4

38 La regulación del inicio de la traducción en eucariotas es debida a los factores de iniciación eucarióticos, conocidos como eifs (eukaryotic initiation factor). Estos pueden ser un factor limitante en el inicio de la traducción. En ambientes donde estos factores se encuentran en concentracioneslimitadasalgunosmrnascelularesyviralessepuedentraducirmedianteotro tipodetraducciónnodependientedecap,denominadatraduccióncapindependiente.launión delribosomadependedeunaregiónespecíficadelmrnadentrodel5 UTR,denominadaIRES (InternalRibosomeEntrySite)(PelletierandSonenberg1988) Figura2:OrganizacióndetripletesdelasecuenciadelmRNA(McGrawHill2012) Regulacióndelatraduccióncapdependiente El inicio de la traducción es un punto importante en la regulación de la expresión de muchosgenes.suregulaciónesunpuntoimportantedeestudio,yaquesehavistocorrelación dealteracionesenlasíntesisdeproteínasconun grannúmerodeenfermedades(sonenberg and Hinnebusch 2009). La síntesis proteica es un proceso que consume elevados niveles de energía,porlotanto,necesitaestarregulado. La traducción envuelve tres etapas diferentes la iniciación, la elongación y la terminación. Aunquelatraducciónesreguladaencadaunadelasetapas,elpasolimitanteeslainiciación, que se centra en el reclutamiento de las subunidades ribosomales al mrna. El inicio de la traducción envuelve la interacción entre RNAproteínas y proteínaproteína donde están implicados muchos factores. Los niveles celulares de los diferentes factores de inicio de la traduccióndifierenenlosdiferentestiposdecélulasytejidos;modulandolaactividaddeestos factoresseregulanlosratiosglobalesdelasíntesisproteica. Loscambiosqueregulaneliniciodelatraducciónsonmediadosporcambiosenelestadodela fosforilacióndelosfactoresdelatraducciónydeproteínasespecíficasdeuniónalrna.lasvías que controlan la capacidad traduccional se coordinan con las que controlan la actividad de factores de traducción y de esta manera se garantiza un control coordinado de la síntesis proteica.elratiodesíntesisparaunaproteínaesproporcionaldelaconcentraciónylaeficiencia delatraduccióndelmrna.(hershey,sonenbergetal.2012) Elcontroldelasíntesisproteicaesunafunciónhomeostáticafundamental delascélulasque están estrechamente asociadas a los estímulos extracelulares que impulsan el crecimiento celularylaproliferación,porlotanto,lasvíasmitogénicasdetransduccióndeseñalesconvergen 5

39 con los factores de inicio de la traducción (Dobrikov, Dobrikova et al. 2011). Entre los mecanismos de control de la traducción capdependiente, destaca la regulación sobre los nivelesdeeif4e(vercapítulo1.2.2regulacióndeeif4e).eneliniciodelatraduccióneif4ese uneaeif4g,eldominio deuniónes compartido porlasproteínasdeuniónaeif4e (4EBPs). Cuando estas proteínas están hipofosforiladas, se unen a eif4e secuestrándolo de eif4g e inhibiendo el inicio de la traducción. Mediante la activación de la vía PI3K/Akt/mTOR, en respuesta a factores de crecimiento y determinados estados de estrés celular, se produce la fosforilaciónde4ebp,elcualliberaeif4eysepuededareliniciodelatraducción(harris,chiet al.2006;sonenberg2008).porotroladolosnivelesdeproteínadeeif4esonbajosenlacélula, comparadoconotrosfactoresdeiniciodelatraducción.debidoasusbajosnivelesdeexpresión y ser el único de los factores de inicio de la traducción que se unen directamente con la estructuracapdelmrna,esunodelosfactoreslimitantesparalaunióndelcomplejoeif4fa Cap;porlotantounpuntoreguladorimportantedeliniciodelatraducción. A parte de la regulación por fosforilación, modificaciones postranscripcionales como la metilación, glicosilación o sumoylación pueden afectar al ratio de síntesis proteica, pero el efectodeestasmodificacionesnohasidoestudiadodeformaextensa. Una nueva área de estudio es la regulación de la traducción por micrornas, estos pueden estimularladegradacióndeciertosmrnasoafectaralasíntesisproteicadirectamente(braun, Huntzingeretal.2012) 1.1.2Iniciodelatraduccióncapdependiente El inicio de la traducción en eucariotas es un proceso en el cual se requiere el reclutamientodelasubunidad80sdelribosomaalmrna,laidentificacióndelcodóndeinicioy elreclutamientodeltrnainiciadoralasubunidadpequeñadelribosoma40s.esunproceso muycomplejoquerequierevariosfactores,incluyendoeltrnadetransferenciaquecontiene unametionina(mettrna i met ),lassubunidadesribosomales40sy60s,12factoresdeiniciode latraducciónyenergíaenformadeatpygtp. Unpuntoimportanteenelprocesodeiniciodelatraduccióneslaformacióndelcomplejode preiniciación43s;requiereelreclutamientodeltrnainiciador(mettrna i met )alasubunidad40 Sdelribosoma.ParaelloserequierelaunióndeleIF2aGTPparaformaruncomplejobinario. EstecomplejoseunealmettRNA i met formandoelcomplejoternarioeif2/gtp/mettrna.eif2 estácompuestaportressubunidades,y.lafosforilacióndeeif2enlaserina51estabiliza la unión a GDP impidiendo que eif2 pueda reciclarse, por lo tanto se inhibe el inicio de la traducción(kappandlorsch2004).unavezformadoelcomplejoternariojuntoaotrosfactores de iniciación (eif1, eif5 y eif3) se unen a la subunidad 40 S para formar el complejo de preiniciación43s(chaudhuri,chowdhuryetal.1999;majumdar,bandyopadhyayetal.2003; Bilanges and Stokoe 2007) (Figura 3 punto 1 y 2). El complejo 43 S recluta el extremo 5 del mrna.estoesfacilitadoporelcomplejoeif4f,elcualestáformadoportresfactoresdeinicio delatraducción:eif4e,eif4ayeif4g. LaestructuracapdelmRNAsseuneconfactoresdeiniciaciónespecíficosantesdeasociarsecon elcomplejodepreiniciación.enelprocesodereclutamientodelribosomaalmrnajueganun papelmuyimportantevariasproteínas:pabp[poly(a)bindingprotein],eif3ylaformacióndel complejoeif4f;eif4fregulalaunióndelmrnaalasubunidad43syeselpasolimitantedel iniciodelatraducción,requierelainteraccióndeeif4econelcapdelmrna.(gingras,raughtet 6

40 al.1999).eif3juegaunpapelmuyimportanteenelmantenimientodelaunióndelasubunidad grandedelribosomaytambiénseunealcomplejoeif4f.(figura3punto3). Una vez el complejo eif4f y el complejo 43 S se han unido al mrna, éste es escaneado en dirección 5 3. Posteriormente un cambio de conformación del complejo 43 S activa la hidrólisisdelgtp,permitiéndoseelreconocimientodelcodóndeiniciaciónydesencadenándose laliberacióndeeif1yeif2gdp,locualpermiteelreclutamientodelasubunidadribosomal60s yqueseinicielasíntesisproteica(kozak1989;jaramillo,deveretal.1991)(figura3punto4y 5). A partir de este punto el mettrna i met está unido al mrna dentro de un lugar específico del ribosomallamadop(lugardelpéptido),elotrolugar,a(aminoácido),serápordondeentrarán lossiguientestrnascargadosconelaminoácidoconcretoentrandoenlafasedeelongaciónde latraducción. Enlatabla1semuestranlasdiferentesfuncionesdelosfactoresdeiniciodelatraducciónasí comodeproteínasimplicadasenlaregulacióndeestosfactores FactoresimplicadosenlaformacióndelcomplejoeIF4F eif4e (ver capítulo 1.2 eif4e) es la proteína que físicamente reconoce y se une a la estructuracapdelmrnayesunfactorindispensableylimitanteparaquesepuedaproducirel inicio de la traducción capdependiente, es el factor menos abundante de todos los eifs (Mochizuki,Oguroetal.2005).Suactividadpuedeserreguladaporunaseriedeproteínasde unión,las4ebps(eif4ebindingproteins),enmamíferosencontramos3diferentes(4ebp1,4e BP2y4EBP3),4EBP1eslamayoritariaenmamíferos;4EBPinteraccionaconeIF4Eenelmismo dominio de unión que eif4g XXXXLdonde es un residuo hidrofóbico y X cualquier aminoácido. Medianteestaunión4EBPbloquealaunióndeeIF4EaeIF4G,impidiendoasíla traduccióncapdependiente(mader,leeetal.1995);otraproteínadeuniónpococonocidaes 4ET(vercapítulo1.54ET),lacualseencargadeltransportedeeIF4Edecitoplasmaanúcleo mediantesuuniónenelmismodominiodeuniónqueeif4g(dostie,ferraiuoloetal.2000). eif4aformapartedeunagranfamiliadeproteínas(másde28miembros)denominada DEADbox.Estasproteínasparticipanenvariosprocesosapartedelatraducción,incluyendoel splicingdepremrnas,biogénesisderibosomas,eldesarrollo,espermatogénesisyovogénesis. eif4aesunaproteínade46kdaquehidrolizaelatpytieneactividadhelicasa,desenrollala estructurasecundariadelmrnaparapermitirelaccesodelassubunidadesribosomalesyque estaspuedanescanearelmrnahastallegaralcodóndeiniciación;suactividadesestimulada poreif4gyeif4b(rozen,ederyetal.1990;rogers,komaretal.2002).existentresisoformas en mamíferos: eif4ai, eif4aii y eif4aiii (Gingras, Raught et al. 1999). Las isoformas humanas eif4aiyeif4aiisonaltamentehomólogasysonfuncionalmenteequivalentes,peroseexpresan de forma diferente según el tejido celular y juegan diferentes roles durante el desarrollo (NielsenandTrachsel1988). 7

41 Figura3:Mecanismodeiniciodelatraducción.1)Disociacióndelcomplejoribosomal80Spreexistente promovidaporeif6,elcualseunealasubunidad60s,eif3yeif1aseunenalasubunidad40s.2)unión delcomplejoternarioeif3gtpmettrnaalasubunidad40sformandoelcomplejodepreiniciación43s. 3)unióndelcomplejo43SalmRNA,necesarioqueelcomplejoeIF4FreconozcaelmRNAysedéhidrólisis deatp.4)colocacióndelcodóndeiniciodelatraducciónendirección5 3.5)liberacióndelosfactores deiniciacióndelatraducción.6)uniónelasubunidadribosomal60s.(gingras,raughtetal.1999) 8

42 FactordeIniciaciónyproteínas implicadasensuregulación eif1 eif2 eif2a eif2b(tambiénllamadogef) factordeintercambiodel nucleótidoguanina eif3,compuestode13 subunidades Actividad ReposicióndemettRNAparafacilitarlaunióndelmRNA FormacióndeuncomplejoternarioeIF2GTPMettRNA AUGdependientedemettRNAuniendoalribosoma40S IntercambiodeGTP/GDPduranteelreciclajedeeIF2 Uniónsubunidadgrandedelribosoma eif4fcompuestopor3 subunidades:eif4e,eif4a,eif 4Gyporlomenos2factores UnióndelmRNAalasubunidad40S,actividadhelicasadel RNA dependiente de ATPasa, la interacción entre la cola poliaylaestructuracubierta(cap) adicionales:pabp,mnk1(omnk2) PABP:proteínadeuniónpoliA eif4a eif4e 4EBP(3formasconocidas) eif4g eif4b eif5 UnelacolapoliAdelosmRNAs,permitelauniónaleIF4G HelicasadeRNAdependientedeATPasa Reconocimientodecubierta5';frecuentementeencontrada sobre expresada en cánceres humanos, la inhibición de eif4eesactualmenteunblancoparaterapiascancerígenas Cuando4EBPestadefosforiladoseuneeIF4Eyreprimesu actividad, la fosforilación de 4EBP ocurre en respuesta a muchos estímulos de crecimiento conduciendo a la liberación de eif4e e incrementando la iniciación de la traducción ActúacomounabaseparaelensamblajedeeIF4Ey4Aen elcomplejoeif4f Estimulalahelicasa,seunesimultáneamenteconeleIF4F Liberación de eif2 y de eif3, GTPasa dependiente del ribosoma Tabla1:Descripcióndelosdiferentesfactoresdeiniciaciónyproteínasimplicadaseneliniciodela traducción. eif4gesunaproteínadeuniónquejuegaunpapelimportanteenelreclutamientodel ribosoma al mrna. Hay dos isoformas en mamíferos, eifgi y eifgii, que son en un 46 % idénticas y funcionalmente homólogas, de 171 kda y 176 kda respectivamente. eif4gi es constitutivamenteexpresadaaunaconcentraciónmáselevadaqueeig4gii(coldwell,sacketal. 2012).Lasdossoncapaceesdeiniciarlatraduccióncapdependiente.eIF4GIesimportanteenla proliferación, la actividad mitocondrial y es importante para la traducción de mrnas relacionadosconesteproceso(caron,charonetal.2004;ramirezvalle,braunsteinetal.2008). 9

43 Tienentresdominiosestructuralesfuncionales,queseencuentranconectadosentresí;lostres dominios interactúan con diferentes factores de inicio de la traducción. Contiene lugares de unión para eif4e y PABP en el dominio Nterminal; eif4a y eif3 en el dominio central de la proteína;yrealizaunafuncióndepuenteentreelribosomayelmrna,encontrándoseellugar deuniónalrnaenelcentrodelaproteína,amas,eif4gestablececontactoconlacola3 polia vía PABP (proteína de unión a la cola polia). La asociación de PABP con eif4g induce la recircularización del mrna, esto aumenta la iniciación y la estabilidad del mrna (Lamphear, Kirchwegeretal.1995;Imataka,Gradietal.1998).Porotroladotambiénencontramosunlugar deinteracciónamnk(fukunagaandhunter1997)(vercapítulo mnks).eldominiode unión a eif4e es el más estudiado, contiene la secuencia YXXXXL, donde es cualquier aminoácidohidrofóbico.porotroladoeif4greclutalamrnahelicasaeif4a. 1.2.eIF4E eif4e fue identificado por su habilidad de unirse a cap y promover el inicio de la traducción. (Sonenberg, Morgan et al. 1978). Es una proteína de 24 kda, es esencial en el reconocimientodelaestructuracap5 presenteenlamayoríademrnayenelreclutamiento delribosomaalmrnaeneliniciodelatraduccióncapdependiente(lazariskaratzas,montine etal.1990).apoyandoestasevidenciasvieronquelaeliminacióndeeif4edeextractoscelulares dramáticamente reducía la traducción cap dependiente. Estos experimentos apoyaron fuertemente la evidencia de que eif4e recluta el complejo eif4f a la estructura cap. En consecuencia, el análisis mediante cristalografía de rayos X de eif4e, reveló una estructura perfectamenteapropiadapararealizarestafunción(marcotrigiano,gingrasetal.1997).sedice queeif4eesunpotenciadortraduccional,aunqueenlaúltimadécadasehadescubiertoque tambiénpuedeactuarcomorepresortraduccional(rhoads2009). Debido a las funciones que desempeña en la célula, no es sorprendente que la secuencia primariadeaminoácidosdeeif4eseaaltamenteconservadaentodoslosorganismos.mediante rayosxyresonanciamagnéticanuclear(nmr)handemostradoqueeif4etieneunaestructura flexibleenellugardeuniónacap,elnúcleodelaestructuraseasemejaaunguantedebeisboly elreconocimientodecapocurreenlapartecóncavamediantelainteraccióndedostriptófanos altamenteconservados;porotroladolamayoríadeproteínasqueinteraccionanconeif4ese unenporlacaraconvexadelaestructura(rhoads2009). Ha sido estudiada en diferentes organismos, encontrándose una región evolutivamente conservadaenlaproteína,queconsisteentre160y170aminoácidosubicadosentrelahis37y lahis200,losextremosnycterminalsonmásvariables.sehanencontrado411miembrosde lafamiliaeif4een230especies,todosellostienenuncontenidoelevadoentrp.seconocen diferentes isoformas, Arabidopsis thaliana no solo expresa eif4e, también eif(iso)4e y ncbp (Ruud, Kuhlow et al. 1998); Homo sapiens expresa un segundo miembro de la familia, 4EHP (Rom,Kimetal.1998);yC.elegansexpresatresmiembrosdelafamiliadeeIF4E,IFE1,2y3 (JankowskaAnyszka,Lamphearetal.1998).Enel2005Joshietalagruparonalosmiembrosde lafamiliadeeif4eentresclasesdiferentessegúnlapresenciaderesiduoscorrespondientesa Trp43yTrp56: Clase1:Trpenlosdosaminoácidos.Enmamíferosseuneacap,eIF4Gy4EBPs. 10

44 Clase2:Enlaposición43podemosencontrarTyp,PheoLeuyenlaposición56Tyro Phe.Enmamíferossolouniónacapy4EBPs. Clase3:Enlaposición43encontramosunTrpyenla56Cys.Enmamíferossolounióna capyeif4g. Cadaunodelostipostienediferentesgradosdeafinidaddeuniónacap,eIF4Go4EBPssegún la especie. En organismos que presentan varios miembros de la familia de eif4e, se ha encontradoquesólounodeellosesubicuoyseencuentraexpresadoconstitutivamente,siendo ésteresponsabledelatraduccióncapdependiente;enmamíferoscorresponderíaaleif4e1.el restodeeif4essonactivosendiferentestejidos,endiferentesetapasdeldesarrollooseunena ciertosmrnas.(joshi,cameronetal.2004;joshi,leeetal.2005;rhoads2009) eif4e fue inicialmente descubierto como un solo polipéptido, pero cuando fue encontradoencomplejoconeif4gfueredefinidocomounasubunidaddeunnuevofactorde iniciodelatraducciónenmamíferosdenominadoeif4f.sonenbergylawrencevieronqueefi4e podíatenerotrasproteínasdeuniónapartedeeif4g,lasdenominadas4ebps(pause,belsham etal.1994).elnúmerodeproteínasdeunióndeeif4econocidashaincrementadoenlaúltima década;muchasdelasnuevasfuncionesdeeif4eestánmediadasporlainteracciónconalgunas desusproteínasdeunión(tabla2). LalocalizacióndeeIF4Epuedesertantonuclearcomocitoplasmática.Enelcitoplasma puedeestarformandopartedelcomplejodeiniciodelatraducciónasícomoformandopartede los denominados processing bodies (PBs) o gránulos de estrés (GS) (Ferraiuolo, Basak et al. 2005; Parker and Sheth 2007). Según Topisirovic et al. el 68 % del eif4e reside en el núcleo participando en el secuestro de ciertos mrnas y su exportación (Culjkovic, Topisirovic et al. 2007). En el núcleo se ha encontrado tanto de forma difusa por el nucleoplasma como en cuerposnucleares,peronoseencuentraenelnucléolo(lejbkowicz,goyeretal.1992). Proteínas eif4g 4EBP1,2,3 Maskin 4ET Lipoxigenasa2 BTF3 Gemin5 Neuroregulina CYFIP LRRC Consecuenciasdeunión ReclutaeIF4AyelribosomaalmRNA Reprimelatraduccióncapdependiente ReprimelatraduccióndemRNASquecontienenCPE TransportaeIF4Ealnúcleo CompiteconeIF4GparaunirseaeIF4E CompiteporlaunióneIF4EaeIF(iso)4E Inhibelatraducción.CololalizaciónenPBs ReprimelatraduccióndemRNAsquecontienenCPE SeuneaeIF4Eenextractoscerebrales.Presenteensinapsis ModulapositivamentelaexportacióndemRNAsconlasecuencia4ESEde formadependientedeeif4e ModulalasfuncionesdeeIF4Eeneldesarrollodelsistemanervioso DisminuyeeltransportedemRNAsdenúcleoacitoplasma EMX2 PML Tabla2:EjemplosdeproteínasdeuniónaeIF4E 11

45 eif4e se considera una proteína de supervivencia envuelta en la progresión del ciclo celular, la transformación celular y la resistencia a la apoptosis. Tiene un papel crítico en la traduccióndemrnasreguladoresdelciclocelularydeproteínasoncogénicas.(wang,yueetal. 2007). Modula la expresión de genes, mediante el incremento de su traducción o por el transporte de estos del mrna de núcleo a citoplasma, envueltos en la proliferación y la supervivencia celular. La sobreexpresión de eif4e produce una desregulación del crecimiento celularyunatransformaciónmaligna(beghi,azzonietal.1990;lazariskaratzas,montineetal. 1990;Avdulov,Lietal.2004)(Vercapítulo1.3.1eIF4Eycáncer) 1.2.1FuncióndeeIF4E eIF4Ecomofactordeiniciodelatraduccióncapdependiente Esunfactorclaveeneliniciodelatraducciónalinteraccionarconlaestructura5 Capdel mrna durante su reclutamiento al ribosoma (Filipowicz, Furuichi et al. 1976). Como hemos comentado anteriormente, forma un complejo con eif4g y eif4a, denominado eif4f, que facilitalaunióndelcomplejoribonucleoproteicodepreiniciación43salmrna,imprescindible paraeliniciodelatraducción.parallevaracaboestafunción,eif4eseunealextremo5 metil 7guanosina (m 7 G cap) que se encuentra en los transcritos (Figura 4). Su unión con eif4g favorecelaestabilidaddelauniónacapypermiteelreclutamientodelrestodefactoresdel complejo(duncan,milburnetal.1987;sonenbergandgingras1998). Recientemente Feoktistova et al. han visto que la unión de eif4e a eif4g incrementa la capacidaddeeif4gparaestimularlaactividadhelicasadeeif4a,eif4epermitequeeif4gtome laconformaciónnecesariaparaestimulareif4a,manteniendolaunióneif4e/eif4galolargo delescaneodelmrnapuedeexplicarunposiblemecanismodecómolaabundanciadeeif4e promueve la traducción de mrnas altamente estructurados (Feoktistova, Tuvshintogs et al. 2013) LasobreexpresióndeeIF4EnoconduceaunincrementoglobaldelatraduccióndemRNAs,pero síquesevenaumentadosciertosmrnasespecíficoscomoodc,cmycociclinad1(clemens 2004; Mamane, Petroulakis et al. 2004). Así como la downregulacion de eif4e no afecta los nivelesglobalesdesíntesisproteica(graff,koniceketal.2007).sehavistoquetranscritoscon regiones 5 UTRs altamente estructuradas son más sensibles a ser traducidos por eif4e (SonenbergandGingras1998) eIF4EcomotransportadordemRNAsdenúcleoacitoplasma Como hemos comentado anteriormente, eif4e también se encuentra en cuerpos nucleares a lo largo del nucleoplasma (Lejbkowicz, Goyer et al. 1992). En el núcleo eif4e contribuyeenlaexportaciónnúcleocitoplasmáticodeciertosmrnasmediantelauniónenun elementoestructurallocalizadoenelextremo3 UTRconocidocomoeIF4Esensitivityelements (4ESE), tiene función carrier de ciertos mrnas de núcleo a citoplasma. Los elementos 4ESE están formados por unos 50 nucleótidos, estos confieren sensibilidad del mrna hacia eif4e permitiendolaexportaciónsuexportación.(rousseau,kasparetal.1996;proud2002;culjkovic, Topisirovicetal.2006; Topisirovic,Siddiquietal.2009;Topisirovic,Siddiqui etal.2009). Este 12

46 procesoesdependientedelavíadeexportacióncrm1ran,enelnúcleoeif4eseasociaacrm 1parapermitirlaexportacióndelmRNAalcualseencuentraunido(Culjkovic,Topisirovicetal. 2006)(Figura4). Igual que en el citoplasma, eif4e afecta tan solo a un número específico de mrnas, mayormentegenesinvolucradosenlaproliferaciónylasupervivencia. EnresumeneIF4Epromuevelaexpresióndeungrupodeterminadodetranscritosmedianteel incrementodelaexportaciónnuclearvía4esey/omedianteelincrementodelatraducciónen citoplasmadetranscritosconunasestructurascomplejasenelextremo5 UTR OtrasfuncionesdeeIF4E Se han descrito otras funciones de eif4e en los últimos años, por ejemplo su importanciaenlaformacióndelamemoria,secreequeestárelacionadoencambiosenlaunión entre conexiones sinápticas de neuronas (Klann and Sweatt 2008). También se ha visto implicadoenlatraduccióndemrnasdevirus,comoseríaelcasodelafamiliacaliciviridae,lo cualescontienenensumrnaunaproteínaviral(vpg)lacualactúacomounsubstitutodecapy reclutaeif4eparalatraduccióndelmrna(chaudhry,nayaketal.2006). PorotroladosehavistoqueeIF4Epuedeformarpartetantodelosgránulosdeestrés (GS) como de los processing bodies (PBs), esto significa que juega un papel en el almacenamientooturnoverdeciertosmrnas(ferraiuolo,basaketal.2005;parkerandsheth 2007).Puedeincrementarlatraduccióndeciertostranscritosparticularmenteduranteperiodos deestréscelularyproliferación(vercapítulo1.6estréscelular) RegulacióndeeIF4E Dado la relevancia de eif4e en la expresión génica es un blanco de múltiples mecanismosderegulaciónquepuedenafectarsufunción;mediantelaregulacióndeeif4ese mantienen los niveles óptimos de crecimiento y división celular, respondiendo a estímulos externos. Una serie de condiciones debe cumplirse para que eif4e pueda participar en la iniciacióndetraducción(gingras,raughtetal.1999).elhechodequeeif4eesgeneralmenteel factordeiniciaciónmenoscomúnencuantoalnúmerodemoléculasporcélulaloconvierteen unpuntoclaveparalaregulación. eif4e actúa como punto convergente de dos vías de señalización, la vía PI3K y la vía de las MAPK. Encontramos dos vías principales de regulación de eif4e, por un lado mediante sus proteínas de unión 4EBPs activadas vía PI3K (Pause, Belsham et al. 1994) y por otro lado la regulación de su fosforilación vía las quinasas Mnk1/2 en la serina 209 activadas vía ERK o p38/mapk(waskiewicz,flynnetal.1997;waskiewicz,johnsonetal.1999)(figura5). 13

47 Figura 4: Modelo de las dos funciones conocidas de eif4e: exportación de mrnas y traducción cap dependiente.eif4epermitelatraduccióndemrnasconlaestructuracapenelextremo5 ;porotraparte media la exportación de mrnas de núcleo a citoplasma mediante la su unión al extremo 3 UTR del mrna, en unas secuencias denominadas eif4esensitivity elements (4ESE) (adaptado de Carroll and Borden2013) EBPs Sonproteínaspequeñasde10a15kDa.Sehandescritotresisoformasde4EBPs1,2y 3.4EBP1y4EBP2compartenun65%deidentidady4EBP3comparteun57%yun59%de identidadcon4ebp1y4ebp2respectivamente;lastresinhibenlatraduccióncapdependiente. 4EBP1eslamayormenteexpresada,peropredominantementesedetectaeneltejidoadiposo (TsukiyamaKohara, Poulin et al. 2001), 4EBP2 es ante todo expresada en el celebro (Banko, Hou et al. 2004) y la tercera isoforma, 4EBP3, se expresa mayormente en el colon, hígado y riñón(poulin,gingrasetal.1998). La unión de las 4EBPs aeif4e se controla a través de su fosforilación (Pause, Belsham et al. 1994; Poulin, Gingras et al. 1998). Las formas hipofosforiladas de 4EBPs se unen a eif4e impidiendolaformacióndelcomplejodeiniciodelatraducción(haghighat,maderetal.1995), por el contrario, en respuesta a nutrientes o células estimuladas con suero las 4EBPs se hiperfosforilanysereducesuafinidadhaciaeif4e,deformaqueéstequedaliberadoypuede formarelcomplejoefi4fparadarasíeliniciodelatraduccióncapdependiente. 4EBP1hasidolamáscaracterizadadelastres.Presentaseislugaresdefosforilación,entreellos se destacan cuatro: treonina 37, treonina 46, treonina 70 (esta fosforialción permite la 14

48 liberacióndeeif4e)ylaserina65(sufosforilaciónimpidelareasociaciónde4ebp1coneif4e). Lasdiferentesfosforilacionespresentanunseguimientojerárquico.LavíaPI3K/AkT/mTORseha descritocomolavíaprincipaldefosforilaciónde4ebp1(wang,beugnetetal.2005),apesarde ello otras quinasas pueden estar también implicadas en la fosforilación de 4EBP1, como por ejemplocdk1(heesom,gampeletal.2001),atm(yangandkastan2000),erk(herbert,teeet al.2002). Figura 5: Esquema de las vías de regulación de eif4e. La vía Ras/Raf/MAPK, activada por factores de crecimiento y estrés activa las Mnks, las cuales fosforilan eif4e. eif4e participa en el inicio de la traducción y su fosforilación incrementa la mitogénesis y la oncogénesis. Por otro lado la vía PI3K/Akt/mTOR es activada por factores de crecimiento, mitógenos y hormonas. mtor fosforila 4EBP inhibiendosufunciónrepresorahaciaeif4e(adaptadodemamane,petroulakisetal.2004) RegulacióneIF4EvíaMnk1/2 eif4eesfosforiladoenrespuestaaciertosestímulos.unasdelasprincipalesquinasas responsablesdelafosforilacióndeeif4esonlasmnks(mapkinaseactivatedproteinkinase)las cuales acceden a eif4e mediante su unión a eif4g (Pyronnet, Imataka et al. 1999). eif4e es fosforiladoenunsololugarinvivo,enlaser209enmamíferos,queseencuentraenelextremo Cterminal (Joshi, Cai et al. 1995; Fukunaga and Hunter 1997; Waskiewicz, Flynn et al. 1997). eif4erápidamenteesfosforiladoenrespuestaaunagranvariedaddeestímulosextracelulares como mitógenos, hormonas polipeptídicas, promotores tumorales y factores de crecimiento (Proud 1992; Flynn and Proud 1996). Las proteínas quinasas Mnk1 y Mnk2 son activadas vía MEK/ERK(Extracellularsignalregulatedkinases),sehaobservadoquehayunainhibicióndela 15

49 fosforilación de eif4e al utilizar inhibidores de dicha vía (Waskiewicz, Johnson et al. 1999; Tschopp, Knauf et al. 2000). Otra vía que activa Mnk1 y Mnk2 es la vía p38mapk, la cual es activadaenrespuestaamitógenos,citoquínasoestréscelular(morleyandmckendrick1997),el uso de inhibidores específicos de las isoformas y de p38 demostraron que estas dos isoformassonlasresponsablesdelincrementoenlafosforilacióndeeif4eenrespuestaaestrés mediantelaactivacióndelasmnks(cuenda,rouseetal.1995).mnk1ymnk2sonlasquinasas fisiológicasdeeif4e,mediantelautilizacióndeldoblekodemnksenfibroblastosembrionarios no se observó un incremento en la fosforialción de eif4e, indicando que son las quinasas responsablesdedichafosforialción(ueda,watanabefukunagaetal.2004). ElestadodefosforilacióndeeIF4Etambiénescontroladoporlaproteínafosfatasa2A(PP2A) (BuandHagedorn1992). Sehandadoalgunasconfusionesconrespectoalaexistenciadeotroslugaresdefosforilación, como por ejemplo, en la serina 53; se generó un mutante de eif4e donde la serina 53 fue mutadaaalanina,impidiendolafosforilacióndedichoresiduo.estemutantenoprovocabala transformacióncelularqueseobservabaalsobreexpresarlaformawildtypedeeif4e,estohizo pensarquedichafosforilacióneranecesariaparalatransformacióncelular(debenedettiand Rhoads1990).Estudiosrealizadosposteriormentevieronquelaserina53noeraelverdadero lugardefosforilacióndeeif4e,medianteanálisisdefosfoaminoácidosvieronquesolohabíaun lugardefosforilacióneneif4e,yobservaronqueesteestabaposicionadocercadelextremon terminal. En la secuencia de eif4e hay tres serinas que pueden ser fosforiladas, mediante un mapeobidireccionaldelpéptidoseeliminarondosdelasserinas,tansoloquedandolaserina 209,confirmandoqueesteeraelmayorpuntodefosforialcióndeeIF4E(FlynnandProud1995). In vitro también se ha observado la fosforilación de la Thr210 cuando la Ser209 es mutada a alanina o en ciertas circunstancias como el tratamiento celular con ácido okadaico, no se observóunatransformacióncelularalproducirselafosforilacióndelathr210.(makkinje,xiong etal.1995;scheperandproud2002;topisirovic,ruizgutierrezetal.2004) Mnk1 y Mnk2 son proteínas quinasas treonina/serina y fueron originalmente descubiertas como resultado de un screening de los substratos o proteínas de unión de Erk (FukunagaandHunter1997;Waskiewicz,Flynnetal.1997).Enhumanossehanencontradodos genesquecodificanparadosisoformascadauno(mnk1a,2a,1by2b),lasisoformasbsonlas formascortasynocontienenelmotivodeuniónamapk.elanálisisdesusecuenciarevelaque lascuatroisoformastienenunaseñaldelocalizaciónnuclear(nls),unlugardeuniónaeif4gen elextremonterminalyeldominioquinasa;tansolomnk1contieneunaseñaldeexportación nuclearylasisoformasmnk1aymnk2aunlugardeuniónamapk,elcualpuedeserfosforilado yactivadoporlavíaerkyp38mapk.lasisoformasmnk1bymnk2bnocontienenestedominio, porlotantonosonsubstratodeerkyp38;porotroladoalnotenerelfragmentocterminalde exportaciónnucleartienenunadistribucióntantonuclearcomocitoplasmática,mientrasquelas isoformasmnk1aymnk2apredominanenelcitoplasma(shenberger,zhangetal.2007;hou, Lametal.2012). Mnk1y Mnk2tienen unasimilitud del88%enel dominiocatalíticoydel77%y65% enel dominio N y Cterminal respectivamente. La actividad y regulación de las Mnks por MAPKs dependedecadaunadelasisoformas.enelcasodelamnk1a,quetieneunaactividadbasal 16