Nanopartículas de plata como una alternativa al tradicional empleo de los sulfitos en vinos

Transcripción

1 JORNADA NANOTECNOLOGIA Y ALIMENTACIÓN Nanopartículas de plata como una alternativa al tradicional empleo de los sulfitos en vinos M. Victoria Moreno-Arribas

2 Número de publicaciones Hace años nanotecnología y vino? La Copa de Licurgo en su estado 'normal', e iluminada desde atrás Trustees of the British Museum References for Nano* & Wine or/& Grape (ISI Web of Knowledge) ( ) Año

3 ANHÍDRIDO SULUROSO (SO₂) Actividad antimicrobiana y antioxidante Bajo coste Los derivados utilizados habitualmente en enología son el metabisulfito de sodio y/o potásio (Na 2 S 2 O 5 y K 2 S 2 O 5 ) DOSIS ELEVADAS: Alteraciones organolépticas Riesgo para la salud humana - International Organization of Vine and Wine (OIV): mg/l total SO 2 - European Union (maximum levels of sulphites tolerated in wines)* red wines: 160 mg/l total SO 2 white wines: 210 mg/l total SO 2 * Directives nº 1493/1999 and nº 1622/2000 EU (Directive 1991/2004): SO 2 > 10 mg/l 26 Noviembre 2005

4 APLICACIÓN DE LA PLATA COMO AGENTE ANTIMICROBIANO EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Y ENOLÓGICA Crespo y col., 2012: Nanopartículas de plata (NNPs) como agente antimicrobiano frente a patógenos de los alimentos Izquierdo-Cañas y col., 2012 y Garde-Cerdán y col., 2014: Coloide de caolín plata como agente antimicrobiano en vinificación Necesidad de estudios sistemáticos de la capacidad antimicrobiana de la plata (NNps) frente a los microorganismos del vino

5 Proyecto PRI-PIBAR (MINECO): Nuevas nanopartículas de plata con acción antimicrobiana de aplicación en la industria enológica. Evaluación tecnológica y toxicológica ( NANOTOXIWINE) ( ) OBJETIVO GENERAL Evaluar la actividad antimicrobiana de nanomateriales de plata nanopartículas de plata y coloide de plata- sobre microorganismos de interés en enología, como posible alternativa, total o parcial al uso de SO₂. Objetivos concretos 1.- Síntesis y caracterización de nuevas nanopartículas de plata 2.-Evaluación de la actividad antimicrobiana de las nanopartículas desarrolladas frente a microorganismos vínicos en ensayos en cultivos puros y de vinificación. Comparación del efecto antimicrobiano de materiales de plata en relación al SO₂ 3.-Evaluar los potenciales riesgos toxicológicos derivados del empleo de las nanopartículas de plata durante la vinificación

6 Nanomateriales de plata Nanomateriales basados en sílice funcionalizada 1. SiO 2 Ag1: Sílice funcionalizada (0.54% Ag) 2. SiO 2 Ag2: Sílice funcionalizada (0.07% Ag) Nanomateriales en polímeros solubles en agua 3. PEG-Ag NP3: estabilizada con el polímero polietilenglicol (% Ag = 20% Ag, 6% Ag) 4. GSH-Ag NP4: estabilizada con glutatión ([Ag] = mg/ml) Microorganismos y ensayos de actividad antimicrobiana COLOIDE DE CAOLÍN PLATA (comercial, aprox. 10% Ag) BACTERIAS LÁCTICAS (11) Pediococcus pentosaceus (n=4) Lactobacillus casei (n=3) Lactobacillus plantarum (n=1) Oenococcus oeni (n=3) BACTERIAS ACÉTICAS (2) Acetobacter aceti (n=1) Gluconobacter oxydans (n=1) LEVADURAS (3) Brettanomyces bruxellensis (n=3) Experiencias IC₅₀ MBC Microplaca: 20 μl suspensión bacteriana 200 µl material de plata (0,063-2 mg/ml) Ensayos de fermentación (microvinificaciones contraladas) Microscopía de epifluorescencia qpcr Vinos contaminados y desinfección de barricas

7 SÍNTESIS DE NUEVOS NANOMATERIALES BASADOS EN POLÍMEROS SOLUBLES EN AGUA Y NANOPARTICULAS DE PLATA POLIETILENGLICOL [Ag(C 6 5 )] + PEG Tolueno 4h, reflujo Ag NP + PEG = O H n OH = PEG-Ag NPs GLUTATIONA AgB 4 + NaBH 4 + GLU H 2 O Ag NP GLU = SH O O O H N HO N OH H = GLU-Ag NPs NH 2 O

8 Absorbance (a.u.) Absorbance (a. u.) SÍNTESIS DE NUEVOS NANOMATERIALES BASADOS EN POLÍMEROS SOLUBLES EN AGUA Y NANOPARTICULAS DE PLATA POLIETILENGLICOL H O PEG-Ag NP (% Ag=20% Ag, 5-10 nm y 25 nm, %Ag= 6% ) n O H GLUTATIONA GSH-Ag NP (Ag= mg/ml y tamaño entre 10 y 50 nm) 1,00 1,0 0,8 0,6 401 nm 0,75 0, nm 0,4 0,25 0,2 0, (nm) 0, (nm) Micrografías de Microscopía de Transmisión Electrónica (TEM) y espectros de absorción UV/vis de las nanopartículas PEG-Ag NPs (izda.) y GSH-Ag NPs (dcha.)

9 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE MATERIALES DE PLATA RENTE A BACTERIAS LÁCTICAS Y ACÉTICAS DEL VINO CEPAS PEG-Ag NP Coloide de plata IC₅₀ IC₅₀ MBC. exp. est. exp. est P. pentosaceus CIAL-16 0,07 0,60 2 0,05 1,36»2 P. pentosaceus CIAL-49 0,08 0,43 2 0,05 1,45»2 P. pentosaceus CIAL-85 0,48 2,35 2 0,58 2,24»2 P. pentosaceus CIAL-86 0,57 2,05 2 0,76 2,61»2 L. casei CIAL-51 0,19 1,16 2 0,01 1,93»2 L. casei CIAL-52 0,17 1,90 2 0,01 1,99»2 L. casei CIAL-92 0,37 1,85 2 0,26 1,89»2 L. plantarum CIAL-121 0,16 0,44 2 0,43 2,31»2 O. oeni CIAL-117 0,20 1,04 1 0,52 1,49»2 O. oeni CIAL-118 0,49 1,01 1 0,92 1,62»2 O. oeni CIAL ,72 1,05 1 0,70 1,86»2 A. aceti CECT-298 0,06 0,15 1 0,14 0,21»2 G. oxydans CECT-360 0,09 0,16 1 0,16 0,33»2 EECTO ANTIMICROBIANO: PEG-Ag NP > coloide SENSIBILIDAD BACTERIANA: Bacterias aceticas > bacterias lácticas MBC IC₅₀ y MBC expresados en mg/ml n.e.: no efecto

10 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE MATERIALES DE PLATA RENTE A BACTERIAS LÁCTICAS Y ACÉTICAS DEL VINO Evaluación del mecanismo de acción de los materiales de plata por microscopía de epifluorescencia P. pentosaceus CIAL-16 A. aceti CECT-298 A) Control B) Nanopartícula PEG-Ag Np (IC₅₀= 0,60 mg/ml) C) Coloide de plata (IC₅₀= 1,36 mg/ml). A) Control B) Nanopartícula PEG-Ag Np (IC₅₀= 0,15 mg/ml) C) Coloide de plata (IC₅₀= 0,21 mg/ml). García-Ruiz et al., ood Control 2015, 50,

11 COMPARACIÓN DEL EECTO ANTIMICROBIANO DE MATERIALES DE PLATA EN RELACIÓN AL SO₂ CEPAS IC₅₀ K₂S₂O₅ PEG-Ag Np Coloide de plata P. pentosaceus CIAL-16 0,59 0,60 1,36 P. pentosaceus CIAL-49 0,61 0,43 1,45 P. pentosaceus CIAL-85 0,55 2,35 2,24 P. pentosaceus CIAL-86 0,60 2,05 2,61 Sensibilidad de bacterias lácticas : K₂S₂O₅ > materiales de plata L. casei CIAL-51 0,54 1,16 1,93 L. casei CIAL-52 0,31 1,90 1,99 L. casei CIAL-92 0,82 1,85 1,89 L. plantarum CIAL-121 0,54 0,44 2,31 O. oeni CIAL-117 0,36 1,04 1,49 Sensibilidad de bacterias acéticas Materiales de plata > K₂S₂O₅ O. oeni CIAL-118 0,44 1,01 1,62 O. oeni CIAL-119 0,56 1,05 1,86 A. aceti CECT-298 0,48 0,15 0,21 G. oxydans CECT-360 0,47 0,16 0,33 IC₅₀ expresado en mg/ml

12 CONCLUSIONES 1.- Los nanomateriales de plata específicamente sintetizados para este estudio, con recubrimientos a base de ambos polímeros solubles (polietilenglicol y glutatión), son capaces de inhibir el crecimiento de las principales especies de bacterias lácticas y acéticas del vino, y en concreto el efecto inhibidor sobre las bacterias acéticas, fue superior al del metabisulfito potásico. 2.- En el mecanismo de acción antimicrobiano de las nanopartículas de plata, parece que están implicados cambios en la membrana plasmática con pérdida de la viabilidad celular y de las funciones vitales de la célula, siendo las bacterias acéticas (Gram negativas) más sensibles (valores IC50 más bajos) que las bacterias lácticas (Gram positivas), lo que puede explicarse por las diferencias en la estructura de la pared celular. 3.- El tratamiento del vino con los nanomateriales de plata (polietilenglicol y glutatión) es eficaz para eliminar la población de Brettanomyces de vino contaminados, tras 10 días de tratamiento, y permite reducir a la mitad la dosis de SO 2. Perspectivas

13 Digestión monitorizada de nanopartículas de plata (ingesta aguda y crónica) Toxicidad mediante modelos celulares del intestino humano Dynamic Gastrointestinal Tract Simulator (SIMGI) A) Stomach B&C) Automatic controler D) Small intestine E) Ascending colon ) Transverse colon G) Descending colon H) Pumps G E H D C A B (Barroso et al. 2014; Cueva et al. 2015) 3.-Evaluar los potenciales riesgos toxicológicos derivados del empleo de las nanopartículas de plata durante la vinificación

14 JORNADA NANOTECNOLOGIA Y ALIMENTACIÓN Nanopartículas de plata como una alternativa al tradicional empleo de los sulfitos en vinos M. Victoria Moreno-Arribas victoria.moreno@csic.es UNED, Qué sabemos de Nanotecnología?. El vino, Capítulo 9, 17 oct 2014