ES A1 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA. 11 Número de publicación: Número de solicitud:

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Número de solicitud: Int. Cl. 7 : G01N 33/02 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 Fecha de presentación: Fecha de publicación de la solicitud: Solicitante/s: Consejo Superior de Investigaciones Científicas c/ Serrano, Madrid, ES 72 Inventor/es: Méndez Cormán, Enrique; García Ortiz, Enrique y Ferre López, Sergio 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: Agente: No consta 4 Título: ELISA competitivo para la detección de gluten hidrolizado y sus aplicaciones. 7 Resumen: ELISA competitivo para la detección de gluten hidrolizado y sus aplicaciones. La presente invención consiste en un kit de ELISA competitivo para identificar gluten hidrolizado en alimentos y materias primas, y su uso. La ventaja que presenta este kit sobre otros es la de permitir la identificación de gluten hidrolizado. ES A1 Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN ELISA competitivo para la detección de gluten hidrolizado y sus aplicaciones Sector de la técnica Esta invención se relaciona, en general, con el análisis de alimentos para enfermos celiacos, y, en particular, se refiere a un procedimiento para la identificación de gluten hidrolizado en alimentos y materias primas, y en concreto a un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) competitivo, y a los kits que comprende dicho ELISA. Estado del arte Se está descubriendo, con el perfeccionamiento de técnicas diagnósticas y analíticas, que la Enfermedad Celiaca presenta una prevalencia muy elevada, de alrededor de 1 de cada 1 individuos (Fasano A. European and North American populations should be screened for coeliac disease. Gut 03 Feb; 2(2): 168-9). El único tratamiento válido que tiene esta enfermedad, hasta el momento, es la supresión del gluten en la dieta del enfermo (Luchtefeld W, Burton MS, Donavon P. The importance of a gluten-free diet. Nurse Pract. 03 Jul; 28(7 Pt 1): 47-9); y desde hace años se está trabajando en el desarrollo de alimentos especiales para celiacos, en los que esté controlada la ausencia de gluten. Por tanto, es muy importante el desarrollo que se lleve a cabo en cuanto a técnicas de detección y cuantificación de gluten, tanto en alimentos ya preparados como en las materias primas con las que se van a preparar. El gluten, que forma parte de un grupo de proteínas denominadas prolaminas, está compuesto por diversas proteínas y se encuentra en los cereales, siendo el de algunos de ellos tóxico para los celiacos, como es el caso del trigo (gliadinas), la cebada (hordeinas) y el centeno (secalinas). Gran parte de los alimentos para enfermos celiacos han sido sometidos a procesos de hidrólisis en su elaboración. El gluten se encuentra frecuentemente hidrolizado en productos tales como siropes, alimentos infantiles, cervezas, etc, no pudiéndose medir con exactitud usando el sistema ELISA-R tipo Sándwich (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 03 May; 1 (): 46-74). Dado que el ELISA-R Sándwich está diseñado para cuantificar gluten (gliadinas, hordeinas y secalinas) que se encuentre intacto, podría ser ideal el desarrollo de un sistema de ELISA-R Competitivo que sea capaz de detectar y cuantificar gluten hidrolizado incluso a nivel de muy pocos aminoácidos, necesitando simplemente que aparezca un solo epítopo en los fragmentos. La capacidad de necesitar tan sólo la existencia de un solo epítopo en los fragmentos hidrolizados seria la gran ventaja de la utilización de un ELISA-R Competitivo. Descripción de la patente Descripción breve La invención se enfrenta con el problema de proporcionar nuevos procedimientos y herramientas para la identificación de gluten en alimentos y materias primas. La solución proporcionada por esta invención se basa en que es posible cuantificar, por primera vez, con gran exactitud prolaminas hidrolizadas, o más preferentemente parcialmente hidrolizadas, mediante un ELISA Competitivo basado en el anticuerpo monoclonal R utilizado en el ELISA-R Sándwich (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 03 May; 1 (): 46-74), y en el uso de un estándar de gliadinas nativas, hidrolizadas mediante una serie de enzimas proteólíticas, y, sorprendentemente, gliadinas no hidrolizadas, y obteniéndose en ambos casos unos valores de recuperación cuantitativa superiores a los del ELISA-R Sándwich convencional. Así, un objeto de la presente invención lo constituye un equipo kit de ELISA Competitivo, en adelante kit de ELISA Competitivo de la presente invención, basado en el uso de un único anticuerpo monoclonal que reconoce un fragmento de gluten con uno o más epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca, preferentemente el anticuerpo monoclonal R (Osman AA, Uhlig HH, Valdes I, Amin M, Mendez E, Mothes T. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur J Gastroenterol Hepatol. 01 Oct;13(): ), y un estándar seleccionado entre el siguiente grupo: a) un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas nativas no hidrolizadas, preferentemente, el estándar EE nativo o b) de un pool de diferentes digestiones realizadas sobre un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas nativas, preferentemente, a partir del EE, con distintas enzimas proteolíticas, para la detección y cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) parcialmente hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico. Por ello, otro objeto de la invención lo constituye el uso del kit de ELISA Competitivo de la presente invención para la identificación y cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico, entre otros, los pertenecientes al siguiente grupo: siropes, alimentos infantiles (papillas sin gluten, papillas hidrolizadas, etc) y cervezas. Lo más importante de dicho desarrollo es que, por una parte se resuelve el problema que existía hasta entonces para 2

3 la correcta detección y cuantificación de gluten hidrolizado en alimentos que han pasado por procesos proteolíticos, y por otra parte es que el uso de un estándar de reconocimiento europeo (BE) da robustez al método, y el que se use en su estado nativo (sin ningún tipo de tratamiento enzimático) hace el método más reproducible y preciso Descripción detallada Así, un objeto de la presente invención lo constituye un kit de ELISA Competitivo, en adelante kit de ELISA Competitivo de la presente invención, basado en el uso de un único anticuerpo monoclonal que reconoce un fragmento de gluten con uno o más epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca, preferentemente el anticuerpo monoclonal R (Osman AA, Uhlig HH, Valdes I, Amin M, Mendez E, Mothes T. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur J Gastroenterol Hepatol. 01 Oct;13(): ), y un estándar seleccionado entre el siguiente grupo: a) un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas nativas no hidrolizadas, preferentemente, el estándar EE nativo o b) de un pool de diferentes digestiones realizadas sobre un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas nativas, preferentemente, a partir del EE, con distintas enzimas proteolíticas, para la detección y cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) parcialmente hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico. El término epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca tal como se utiliza en la presente invención se refiere a los epítopos pertenecientes al siguiente grupo: QQPFP, LQPFP, QLPYP, QLPTP, QQSFP, QQTFP, PQPFP, QQPYP, PQPFP (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 03 May;1 (): 46-74) y epítopos presentes en el recientemente descrito péptido 33-mer supuestamente tóxico para los enfermos celiacos (Lu Shan, Φyvind Molberg, Isabelle Parrot, Felix Hausch, Ferda Filiz, Gary M. Gray, Ludvig M. Sollid, Chaitan Khosla. Structural Basis for Gluten Intolerance in Celiac Sprue. Science 02 Sep;297: ). Un objeto específico de la presente invención lo constituye el kit de ELISA Competitivo de la presente invención en el que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal R y el estándar seleccionado es el EE nativo. Otro objeto específico de la presente invención lo constituye el kit de ELISA Competitivo de la presente invención en el que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal R y el estándar seleccionado es un pool de diferentes digestiones realizadas sobre el EE con distintas enzimas proteolíticas, preferentemente con las enzimas pertenecientes al siguiente grupo: pepsina, tripsina/pepsina, tripsina y quimiotripsina. Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso del kit de ELISA Competitivo de la presente invención para la identificación y cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico, entre otros, los pertenecientes al siguiente grupo: siropes, alimentos infantiles (papillas sin gluten, papillas hidrolizadas, etc) y cervezas. En resumen, las ventajas de este nuevo ELISA R Competitivo son: a) La utilización como estándar de gliadinas completas, preferentemente el Estándar Europeo (en adelante, EE) de gliadinas nativo, que está validado por el Prolamin Working Group, y recomendado para su utilización en ELISAs para la detección de gluten, se puede conseguir comercialmente y no requiere una preparación especial. Esta ventaja es la más relevante en el desarrollo de este ELISA Competitivo dado que puede universalizar su uso, de manera fiable y reproducible, resolviendo el problema de la búsqueda de un estándar hidrolizado representativo de todos los tipos de procesos que pueden sufrir las materias primas desde su origen hasta que llegan a formar parte de un producto final. b) También se puede usar como estándar un pool de digeridos enzimáticos del EE en el ELISA-R Competitivo con una eficacia similar a la del nativo, con el inconveniente de que la preparación del pool de digeridos es más laboriosa y menos reproducible. c) La ventaja del ELISA-R Competitivo es que permite cuantificar en su totalidad fragmentos de prolaminas de trigo/cebada/centeno de alto o bajo peso molecular que contengan uno o más epítopos, en comparación con el ELISA- R Sándwich que está limitado a cuantificar fragmentos con más de dos epítopos. d) Dicha ventaja del ELISA-R Competitivo basado en el EE nativo respecto al ELISA-R Sándwich, se confirma en los altos valores obtenidos en alimentos que contienen gluten hidrolizado (siropes y cervezas) en comparación con los resultados obtenidos con el ELISA-R Sándwich que infravaloran la presencia de gluten, tóxico para los enfermos celiacos, en dichos alimentos (Figura 3). Descripción de las figuras 6 Figura 1. SDS-PAGE (Izquierda) y Western-Blot R (derecha) de los resultados del EE nativo (Nat.) de las digestiones del EE de gliadinas, con Pepsina (P), Tripsina (T), Tripsina+Pepsina (T+P), Quimiotripsina (QT), y del Pool (preparado a partes iguales, P:T:T+P:QT:Nativo;1:1:1:1:1). 3

4 Figura 2. Curvas utilizando como estándar el EE nativo o el pool para la cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas, en un ELISA Competitivo basado en el anticuerpo monoclonal R. Figura 3. Valores superiores de gliadinas obtenidos con el ELISA-R Competitivo en el análisis de alimentos que tienen gliadinas hidrolizadas (siropes y cervezas) respecto al ELISA-R Sándwich. Ejemplos de realización de la invención Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma. Ejemplo 1 Valoración de un ELISA R Competitivo Para el diseño de un ELISA Competitivo (Crowther J R (199) ELISA, theory and practice. Methods in Molecular Biology, vol 42, pp 3-0. New Jersey: Humana Press Inc.) que sea capaz de detectar y cuantificar fragmentos pequeños de prolaminas hidrolizadas presentes en determinados alimentos como siropes, cervezas, alimentos infantiles, etc, existen dos problemas que hay que afrontar: a) El primero de ellos es seleccionar qué tipo de estándar hidrolizado debería usarse, que sea similar al de las gliadinas hidrolizadas en los alimentos, para detectar prolaminas hidrolizadas, y con el que realizar la curva estándar. Por este motivo hemos diseñado estándares basados en el Estándar de Referencia Europeo de Gliadinas, a partir de ahora EE, (Ref.: IRMM-480: Klein C, Franchini F, Schimmel H. Towards a certified reference material for Gliadin from European Wheat : study design and methodological approaches. Proceedins of the 17 th Meeting. Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity 02 Oct; ) digerido con enzimas proteolíticas, y un pool de estos digeridos, y el propio EE nativo. b) El segundo de ellos es qué anticuerpo usar para que sea capaz de detectar pequeños fragmentos hidrolizados, incluso hasta un nivel de pocos aminoácidos (4- aa). Hemos seleccionado el anticuerpo monoclonal R porque tiene la ventaja de su gran capacidad de reconocer numerosos epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca (QQPFP, LQPFP, QLPYP, QLPTP, QQSFP, QQTFP, PQPFP, QQPYP y PQPFP) (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 03 May;1 (): 46-74), que aparecen muy repetidos en las prolaminas, y cuya secuencia es muy corta, pudiendo ser el idóneo para reconocer fragmentos digeridos hasta incluso a nivel de pocos aminoácidos Análisis por SDS-PAGE y por Western-Blot R del Estándar digerido 4 0 Para comprobar que las digestiones del EE habían funcionado tal y como se esperaba se llevaron a cabo dos tipos de análisis, primero se realizó un SDS-PAGE, con el fin de observar el perfil de bandas que se obtenían en las distintas digestiones por separado, en un pool de dichas digestiones y en el EE nativo, y si realmente estaba digerido el material y a qué nivel, y segundo un Western-Blot R (Valdes I, Garcia E, Llorente M, Mendez E. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using a novel sándwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol. Eur J Gastroenterol Hepatol 03 May; 1(): 46-74) para comprobar si los fragmentos obtenidos eran susceptibles de ser reconocidos por el anticuerpo R con el que posteriormente se iba a desarrollar el ELISA Competitivo (Figura 1). En ella se puede observar a la izquierda el patrón de péptidos que presentan las distintas muestras analizadas mediante un gel SDS-PAGE. En el carril de la izquierda se ve el patrón que presenta el EE nativo (Nat), donde se puede observar la zona con bandas más oscuras, correspondientes a las fracciones de gliadinas, en las columnas situadas a continuación hacia la derecha se puede apreciar como el tratamiento enzimático al que se le ha sometido provoca un cambio en el perfil peptídico de dicho EE, en mayor o menor grado, quedando demostrado que las distintas digestiones habían actuado sobre el mismo, degradándolo en mayor o menor medida. Cuando se completó el estudio realizando un Western Blot con el anticuerpo monoclonal R, se observó (a la derecha en la Figura 1) que aún estando hidrolizados, los péptidos que se generaban presentaban inmunorreactividad frente a dicho anticuerpo, observándose también el grado distinto de hidrólisis que obtenido según las enzimas usadas para ello, todo eso nos empujó a pensar en el anticuerpo monoclonal R como idóneo para el desarrollo de este ELISA Competitivo Realización del ELISA-R Competitivo 6 Se procedió a la realización de un ELISA Competitivo basado en el anticuerpo monoclonal R de cantidades controladas de cada uno de los estándares preparados. Representadas las curvas obtenidas con los estándares de las distintas digestiones, así como el pool de digeridos con nativo, y el nativo original, se observó, que todas las curvas eran muy similares y próximas, incluyendo las más digeridas y el nativo sin digerir (Figura 2). Por lo tanto, se puede concluir que el EE nativo puede ser usado perfectamente como estándar para el desarrollo del ELISA-R Competitivo (Figura 2). Al evaluar el nuevo prototipo de ELISA-R Competitivo se pensó en la posibilidad de realizar el proceso usando tanto el EE nativo, como estándar para la curva del ELISA, como el pool de digeridos, con el fin de dilucidar cuál seria el más apropiado, dado que como se observa en la Figura 2 dan ambos unas curvas casi solapadas. Hay que tener 4

5 en cuenta que la utilización como estándar del EE de gliadinas nativo, que está validado por el Prolamin Working Group, y recomendado para su utilización en ELISAs para la detección de gluten, se puede conseguir comercialmente y no requiere una preparación especial, mientras que un estándar de un pool de digeridos enzimáticos del EE presenta el inconveniente de que la preparación del pool de digeridos es más laboriosa y menos reproducible. TABLA 1 Recuperación cuantitativa obtenida con el ELISA-R Competitivo, utilizando como estándar el EE nativo en muestras digeridas con diferentes enzimas proteolíticas conteniendo cantidades de gliadinas hidrolizadas conocidas (, 12., 2, 0 ppm) Entonces, con las distintas soluciones de las muestras de cada digestión y de sus controles nativos se prepararon unas muestras a concentraciones conocidas de gliadinas (, 12., 2 y 0 partes por millón, teóricas), con el fin de comprobar el grado de recuperación que se obtenía usando el EE tanto nativo como el pool (ver Tabla 1 y 2, respectivamente). Se obtuvo un rendimiento alto, unos valores muy elevados de recuperación entre los valores teóricos de las muestras cuantificadas (en el caso de las digestiones con Pepsina, Tripsina, y el pool de digeridos más nativo), valores que se encuentran entre el % (Tabla 1), y cuando se evalúan usando como estándar un pool de digeridos enzimáticos del EE, se obtienen unos valores cuantitativos, aunque sobrestiman ligeramente las muestras (Tabla 2). TABLA 2 Recuperación cuantitativa obtenida con el ELISA-R Competitivo, utilizando como estándar el pool en muestras digeridas con diferentes enzimas proteolíticas conteniendo cantidades de gliadinas hidrolizadas conocidas (, 12., 2, 0 ppm) 0 6

6 Además se usó el ELISA-R Sándwich con el fin de comprobar el resultado que daban las muestras nativas y digeridas por cada uno de los dos sistemas. Los resultados obtenidos en el análisis de estas muestras teóricas rindieron los porcentajes de recuperación que se muestra en la Tabla 3. Estos datos obtenidos con el ELISA-R Competitivo son cuantitativos y contrastan con los valores de entre el 70-80% de recuperación obtenidos usando el ELISA-R Sándwich (que no permite cuantificar péptidos con un solo epítopo). TABLA 3 Recuperación obtenida en muestras de EE digeridas, con contenido de gliadinas hidrolizadas conocido (, 12., 2,0 ppm) por el ELISA-R Sándwich Dichos resultados avalan la validez del método de cuantificación de prolaminas hidrolizadas, mediante un ELISA Competitivo en el que se usa como estándar el EE nativo y el anticuerpo monoclonal R, para el análisis de alimentos (siropes, alimentos infantiles (papillas hidrolizadas, papillas sin gluten) y cervezas, entre otros, y materias primas, tales como los almidones de trigo, que pueden venir contaminados con prolaminas de trigo (gliadinas) que se encuentren parcialmente hidrolizadas. Además, se realizó un estudio sobre la sensibilidad del método y el límite de detección, y se obtuvieron los siguientes valores: Sensibilidad del método: 1.22 ng/ml de gliadinas (0.12 mg/0 g, ó 1.2 partes por millón de gliadinas). 0 6 Ejemplo 2 Límite de detección teórico: 0.3 ng/ml de gliadinas (0.03 mg/0 g, ó 0.3 partes por millón de gliadinas). Dilución de trabajo mínima de la muestra: 1:2 (extraída de la siguiente forma 0. mg/ ml de etanol %). Valoración de la presencia de prolaminas en alimentos hidrolizados (siropes y cervezas) Se usaron para el experimento un total de siropes y 2 cervezas diferentes, y fueron extraídas las prolaminas usando el siguiente procedimiento: Lo primero fue pesar un total de mg de cada una de las muestras y llevarlas a un volumen de ml de Etanol %. Esto se preparó en tubos de polipropileno de 12 ml, que se pusieron en un agitador rotatorio durante 1 hora a temperatura ambiente y a una velocidad de unas rpm, tras la extracción de las gliadinas con el Etanol %, se procedió a centrifugar durante minutos a 0 rpm las muestras, para recoger posteriormente con el sobrenadante obtenido. Dicho sobrenadante fue recogido en tubos limpios de ml, y posteriormente se pasó a analizar las muestras por ambos sistemas de ELISA, el Competitivo (para prolaminas hidrolizadas) y el tipo Sándwich (para prolaminas intactas), observándose las diferencias que se muestran en la Figura 3, donde se reflejan únicamente alguna de las 6

7 muestras analizadas. En cualquier caso los valores de prolaminas contenidas en las muestras fueron siempre iguales o superiores cuando se analizaban las muestras por el ELISA Competitivo, siendo más notables las diferencias en las muestras de cervezas, que presentaban mayor nivel de hidrólisis. Materiales y métodos A continuación se describen los Materiales y Métodos utilizados para la realización de los ejemplos de la invención. 1 Estándar de referencia Europeo de gliadinas -EE- (IRMM-480) Se trata de una mezcla de variedades de trigo diferentes, representando las diferentes composiciones de gliadinas que pueda haber entre distintas variedades, con el fin de que se pueda usar como referencia a nivel europeo. Se trata de un material que está a disponible a través del Prolamin Working Group (Van Eckert R. The PWG gliadin, a new reference material. Proceedins of the 16 th Meeting. Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity 01 Nov; 2-28). Preparación de las digestiones enzimáticas del Estándar Europeo de gliadinas (IRMM-480) Se pesaron 6 mg de gliadina de estándar europeo (EE) y se disolvieron en 6 ml de etanol % (1 mg/ml). De acuerdo con el factor 0.86 (corrección según determinación de nitrógeno por Kjendals) Una vez preparado se procedió a ajustarlo a una concentración 1 mg/ml reales secando la cantidad de 81.4 µl y resuspendiéndolo en 00 µl en cada una de las alícuotas que se preparan para las digestiones posteriores a las que será sometido. (Concentración final: 4 g/0g, ó.000 partes por millón (ppm) de gliadinas). Para tratar de encontrar el estándar adecuado se realizaron primero unas cinéticas de digestiones del EE de gliadinas con las siguientes enzimas: Digestión con Pepsina (P). Se prepara a una concentración de 1 mg de pepsina/ml de ácido fórmico 1% (ph 2.). Se incuba a una relación enzima:estándar Europeo de 1:0, a Temperatura ambiente (26 C) durante 18 horas. Digestión con Tripsina (T). Se prepara a una concentración de 2 mg de tripsina/ml de bicarbonato amónico 0 mm (ph 8.). Se incuba a una relación enzima:estándar Europeo de 1:0, a Temperatura ambiente (26 C) durante 18 horas. Tripsina seguido de Pepsina (T/P), combinando de forma sucesiva las condiciones mencionadas en los puntos anteriores. Digestión con Quimiotripsina (QT). Se prepara a una concentración de 2 mg de tripsina/ml de bicarbonato amónico 0 mm (ph 8.). Se incuba a una relación enzima:estándar Europeo de 1:0, a Temperatura ambiente (26 C) durante 18 horas. Se añadieron 2. µl de enzima sobre todas las alícuotas, con sus soluciones correspondientes de EE (1 mg/ml) volumen final 00 µl Los reactivos (ácido fórmico, bicarbonato amónico) se eliminaron de las muestras por medio de liofilización. Preparación de un Pool de digestiones de Estándar Europeo 0 Una vez realizadas todas las digestiones overnight 18h del estándar de referencia europeo de gliadinas, se realizó un pool, mezclando todos los digeridos y el EE nativo tal como se indica a continuación: Se tomaron volúmenes iguales de cada una de las digestiones llevadas a cabo sobre el EE de gliadinas, y además se añadió una parte más de EE nativo (P+T+T/P+QT+Nativo), quedando en la relación 1:1:1:1:1. 6 Preparación del Estándar Europeo digerido a concentraciones teóricas conocidas (, 12., 2, 0 ppm, partes por millón de gliadinas) Se prepararon a concentraciones teóricas conocidas de gliadinas (, 12., 2 y 0 partes por millón, teóricas) todos los digeridos y nativos, con el fin de analizarlos por los dos sistemas en paralelo, el Competitivo nuevo y el Sándwich tradicional. Además se usó el ELISA-R Sándwich con el fin de comprobar el resultado que daban las muestras nativas y digeridas por cada uno de los dos sistemas. Para la muestra de 0 ppm se diluye la solución de etanólica del EE a 1 mg/ml (real,.000 ppm) con etanol %, hay que realizar una dilución 1:800 de la solución de partida. Se preparan las de 2 y 12. en diluciones seriadas a Y2 en etanol %, y la de ppm 1/2. con respecto a la de

8 ELISA-R Competitivo 1. - Tapizado de la placa ELISA Finalmente se llegó a la conclusión de que la mejor concentración para el tapizado de la placa de ELISA era de 0.12 µg gliadinas EE/ ml A. Se prepara la solución de recubrimiento a partir de la solución de EE (a 1mg/ml), haciendo una dilución 1:8000 en tampón de recubrimiento. B. Se echan 0 µl de la solución de recubrimiento/pocillo, 12.ng de gliadinas EE/0 µl. C. Se incuba a 4 C durante toda la noche Lavado de la placa (3 veces con solución de lavado, PBS + Tween 0.%) Bloqueo de la placa: PBS + Tween (0.%) + 2% BSA (albúmina de suero bovino) Solución de Bloqueo (SB). A. Se añaden 280 µl de SB/pocillo en la placa de ELISA. B. Se incuba en estufa, a 37 C, durante 1 hora Preparación de las muestras y la curva estándar de gliadinas Preparación de la curva estándar de gliadinas con EE nativo Una vez establecida la concentración del tapizado, se ajustaron las concentraciones de partida de los distintos digeridos para realizar la curva estándar usando un total de 8 puntos de estándares. Quedando de la siguiente forma los distintos estándares: S 1 2. µg/ml a S ng/ml. a) Para el primer punto de la curva estándar (S1) (2. µg gliadina/ml) se diluye la solución de gliadina del EE a 1:0 en PBS + Tween (0.%) + 1% BSA, (SD). 3 b) El resto de los puntos de la curva estándar (8 en total), se obtienen a partir de la primera solución (S1) por dilución seriada con factor 1/4. Como sigue: 4 S1 S2 = 0,1 ml S1 + 0,3 ml SD S3 = 0,1 ml S2 + 0,3 ml SD S4 = 0,1 ml S3 + 0,3 ml SD S = 0,1 ml S4 + 0,3 ml SD S6 = 0,1 ml S + 0,3 ml SD S7 = 0,1 ml S6 + 0,3 ml SD S8 = 0.1 ml S ml SD [2. µg/ml] [0.62 µg/ml] [0.16 mug/ml] [0.039 µg/ml] [ µg/ml] [ µg/ml] [ µg/ml] [ µg/m Dilución de los extractos etanólicos de las muestras Las muestras se analizan a diluciones a partir de 1:2 en SD. Las diluciones siempre se preparan el doble de concentradas de la que finalmente se desea analizar*. Dilución 1:2 y 1:0, si son necesarias diluciones más elevadas pueden prepararse a partir de estas anteriores por dilución 1:2. *Nota: Al calcular la concentración de gliadinas en las muestras debe tenerse en cuenta que estas antes de aplicarse a la placa de ELISA se preincuban con el conjugado, mezclándolos 1:1 (v/v) de modo que en el ensayo las muestras quedan diluidas al doble que la dilución preparada inicialmente.. - Preparación del anticuerpo R conjugado: Como conjugado se utiliza el anticuerpo monoclonal R conjugado con peroxidasa diluido 1: La dilución del anticuerpo conjugado se prepara justo antes de la preincubación con las muestras Preincubación de las muestras y la curva estándar con el conjugado. Las muestras y el anticuerpo conjugado ya diluidos se mezclan v/v para preincubarlos antes de aplicarlos en la placa de ELISA. 8

9 Se mezclan 0.3 ml de las muestras diluidas y los estándares con 0.3 ml del anticuerpo conjugado diluido 1: Se incuba a temperatura ambiente agitando constantemente en el agitador orbital a la mínima velocidad. 1 Las concentraciones finales de los estándares quedan así: C 1 C 2 C 3 C 4 C C 6 C 7 C 8 (1.2 µg/ml) (0.31 µg/ml) (0.078 µg/ml) (0.019 µg/ml) ( µg/ml) ( µg/ml) ( µg/ml) ( µg/ml) La dilución del conjugado queda en 1: Aplicación de las muestras y la curva estándar en la placa. Se aplican por duplicado en la placa de ELISA 0 µl de cada mezcla preincubada y se incuba 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda y en oscuridad Se lava la placa 6 veces con solución de lavado Aplicación de la solución sustrato (TMB-plus). Se añaden 0 µl de la solución sustrato con TMB-plus en cada pocillo de la placa de ELISA. Se incuba durante 13-1 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad.. - Parada de la reacción. La reacción se para echando 0 µl/pocillo de solución de parada (H 2 SO 4 2. M) Lectura. Se lee la absorbancia en un lector de placas ELISA a nm

10 REIVINDICACIONES Kit de ELISA Competitivo para la detección y cuantificación de prolaminas hidrolizadas caracterizado porque está, al menos, constituido por único anticuerpo monoclonal que reconoce un fragmento de gluten con uno o más epítopos relacionados con la toxicidad del gluten en enfermos con enfermedad celiaca, preferentemente, el anticuerpo monoclonal R y por un estándar seleccionado entre el siguiente grupo: a) un estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas completas no hidrolizadas, preferentemente, el estándar EE nativo, o b) un estándar consistente en un pool de diferentes digestiones realizadas sobre el EE con distintas enzimas proteolíticas. 2. Kit ELISA Competitivo según la reivindicación 1 caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal R y el estándar elaborado a partir de un conjunto de gliadinas completas no hidrolizadas es el EE nativo. 3. Kit ELISA Competitivo según la reivindicación 1 caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal R y el estándar es un estándar consistente en un pool de diferentes digestiones realizadas sobre el EE con distintas enzimas proteolíticas, preferentemente con las enzimas: pepsina, tripsina/pepsina, tripsina y quimiotripsina. 4. Uso del Kit ELISA Competitivo según las reivindicaciones 1 a la 3 para la identificación y cuantificación de prolaminas (gliadinas, hordeinas y secalinas) hidrolizadas presentes como contaminantes en alimentos o materias primas, que han sido sometidos a tratamiento proteolítico.. Uso del ELISA Competitivo según la reivindicación 4 caracterizado porque los alimentos pertenecen al siguiente grupo: siropes, alimentos infantiles (papillas hidrolizadas, papillas sin gluten) y cervezas

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14 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 ES Nº de solicitud: Fecha de presentación de la solicitud: Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA 1 Int. Cl. 7 : G01N 33/02 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas A WO A1 (CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS) A ELENA BAZZIGALUPPI et al. Comparison of Tissue Traniglutaminase- Specific Antibody Assay with Established Antibody Measurements for Coeliac Disea. Journal Autoinmunity, 1999, 12, páginas 1-6. Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe Examinador Página M. Ybarra Fernández 1/1