CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN oord Y SU RELACIÓN CON RESISTENCIA A FURAZOLIDONA EN AISLAMIENTOS DE Helicobacter pylori.

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1 CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN oord Y SU RELACIÓN CON RESISTENCIA A FURAZOLIDONA EN AISLAMIENTOS DE Helicobacter pylori. FABIAN MATEUS MARTINEZ TABAJO DE GRADO Presentado como requisito para optar al título de MICROBIOLOGO INDUSTIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIA CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA D.C. 2011

2 CARACTERIZACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN oord Y SU RELACIÓN CON RESISTENCIA A FURAZOLIDONA EN AISLAMIENTOS DE Helicobacter pylori. FABIAN MATEUS MARTINEZ DIERECTORA: ALBA ALICIA TRESPALACIOS RANGEL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIA CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL BOGOTA D.C. 2011

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5 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la Resolución N o 13 de julio de 1946 la Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velara por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

6 AGRADECIMIENTOS Gracias a la Doctora Alba Alicia por permitirme participar en este gran proyecto, por permitirme aprender cosas nuevas, por enriquecerme no solo como profesional sino como persona y por enseñarme a aplicar en la práctica lo aprendido durante mi carrera; a Jenny y Liliana por el apoyo y la colaboración en el laboratorio; a mis amigos y compañeros que siempre creyeron en mí, y a Paula Ospina por estar conmigo todo el tiempo dándome fuerzas para continuar en los momentos más difíciles de este proceso, en el que seguramente habría sido muy difícil continuar sin ese gran apoyo y cariño que me brindo. DEDICATORIA Este trabajo se lo dedico a mi mama, gracias a ella pude lograr ser la persona que soy el día de hoy, por darme la oportunidad de estudiar y ser cada día mejor gracias a tantos sacrificios cumplí una de mis grandes metas en la vida; a mi familia completa que siempre creyeron en mi como profesional y como persona para poder lograr culminar mi carrera con éxito.

7 TABLA DE CONTENIDO 1. Resumen introducción Justificación del problema y planteamiento del problema Justificación Pregunta de Investigación Marco Teórico Hipótesis Objetivos Objetivo General Objetivos Específicos Metodología Procedimiento Diseño Resultados Mutaciones en el gen oord CMI y su relación con mutaciones en el gen oord de H. pylori Análisis de datos obtenidos Discusión Conclusiones Recomendaciones Bibliografía 22

8 1. RESUMEN Se caracterizaron las mutaciones presentes en el gen oord de cepas resistentes a Furazolidona de Helicobacter pylori a partir de aislamientos del microorganismo presente en biopsias gástricas de 83 pacientes colombianos; se realizo extracción de DNA, amplificación y posterior secuenciación de las muestras de DNA obtenidas a partir de dichas muestras y se usaron herramientas estadísticas como Chi cuadrado y test de Kappa para interpretar los datos y evaluar la relación de las mutaciones con la resistencia de H. pylori a Furazolidona. Se obtuvieron resultados que indicaron presencia de mutaciones tanto en las cepas resistentes como en las sensibles al tratamiento con Furazolidona, mostrando que las mutaciones A408G y C716A no tiene relación con la resistencia a este antibiótico al haberse presentado en gran cantidad de cepas tanto resistentes como sensibles y que las mutaciones A489G y C716G si están relacionadas con la resistencia a Furazolidona por parte del microorganismo. 2. INTRODUCCION Helicobater pylori es un bacilo Gram negativo, microaerofilico, flagelado que coloniza el estómago de aproximadamente el 50% de la población mundial y puede causar enfermedades gastroduodenales como gastritis crónica y carcinoma gástrico (1,2,3). La erradicación para infecciones causadas por H. pylori resulta en úlceras curadas y puede reducir el riesgo de cáncer gástrico. A pesar que H. pylori es susceptible a muchos antibióticos in vitro solo algunos antibióticos pueden ser usados in vivo para erradicar la infección (3). 3. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: 3.1. JUSTIFICACION En el tratamiento contra H. pylori, el metronidazol es uno de los antibióticos más utilizados a escala mundial, su empleo en otras afecciones de forma indiscriminada

9 ha traído como resultado el desarrollo de altos niveles de resistencia. En la terapia se emplean dosis de 500 mg, 2 veces al día de 1 a 2 semanas combinado con algún otro antibiótico de segunda línea como amoxicilina o antibióticos bacteriostaticos como tetraciclina (2). En Colombia la prevalencia de la infección es cercano al 80% y no existen protocolos estandarizados para los imidazoles, solo para el metronidazol, lo que hace que la resistencia por parte de H. pylori sea un notable problema de salud publica en nuestro país. Por lo tanto es de gran importancia encontrar nuevas alternativas para combatir el microorganismo encontrando niveles menores de resistencia. Una alternativa para remplazar el uso de imidazoles es el uso de furazolidona, un nitrofurano con características similares a la de los imidazoles pero con bajas concentraciones mínimas inhibitorias en H. pylori. Por esta razón usar otras alternativas de tratamiento como la furazolidona que es una muy buena opción a considerar para lograr erradicar exitosamente este microorganismo PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN: Es posible encontrar mutaciones en el gen oord de H. pylori que estén relacionadas con resistencia a furazolidona? 4. MARCO TEORICO In vitro H. pylori puede ser inhibido por varios antibióticos, pero in vivo son pocos los antibióticos que pueden ser utilizados para la erradicación de la bacteria, porque no tienen la capacidad de llegar a niveles apropiados en la capa de la mucosa gástrica, se inactivan a ph bajo y por el crecimiento lento de H. pylori (4). El metronidazol, la calritromicina, la amoxicilina, tetraciclina y los 5-nitrofuranos como furazolidona son antibióticos ampliamente usados para el tratamiento de H. pylori pero la resistencia antibiótica de la bacteria principalmente a los imidazoles, ha sido un obstáculo para su erradicación, sobre todo en países de Latinoamérica, África y Asia, donde la bacteria tiene una prevalencia hasta del 80%. La infección por H. pylori en estos países es tratada generalmente con metronidazol, sin embargo estudios recientes han demostrado que el uso excesivo de este antibiótico para una amplia gama de infecciones, ha contribuido al desarrollo de resistencia de H. pylori a este tratamiento (4,5).

10 La resistencia a los imidazoles por parte de la bacteria es dada principalmente por mutaciones sin sentido presentes en diferentes genes, como fdxa, fdxb, flda, oord, PorD, rdxa y frxa, cuya principal función a nivel bioquímico es producir enzimas con capacidad redox, que tienen una relación directa con la reducción de los imidazoles activándolos y resultando en la denaturación del DNA bacteriano (5). El gen oord es el gen que codifica para la producción de la enzima 2-oxoglutarato oxidoreductasa que cataliza la descarbolxilación oxidativa de 2-oxoglutarato para formar succinil conenzima A (succinil CoA), el mayor intermediario del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. Para producir este compuesto esta enzima cataliza la reducción de aceptores de electrones de bajo potencial por la reacción: 2-oxoglutarato + CoA + Fd ox Succinil-CoA + CO 2 + Fd red La presencia de este gen en H. pylori tiene gran importancia por varias razones, la primera de ellas es porque este gen podría estar involucrado en la naturaleza microaerofílica de la bacteria ya que la enzima producida por el gen oord es altamente sensible al oxígeno. Otra razón para destacar la importancia del gen oord es que junto a el gen pord se han asociado con la resistencia de H. pylori a metronidazol, un antibiótico que al igual que furazolidona requiere de la reducción de su grupo nitro para ser activado y así una vez en su forma activa poder atacar el DNA bacteriano causando la muerte del microorganismo; se cree que la relación que existe entre oord, pord y la resistencia a metronidazol y furazolidona se debe a la disminución de la actividad de NADH oxidasa en las cepas resistentes, lo que hace que aumente la concentración intracelular de oxigeno inhibiendo así las nitroreductasas encargadas de llevar al metronidazol y furazolidona a su forma activa (6). La furazolidona (N-(-5-nitro-2-furfurilidina-)-3-amino-2-oxazolidona) proviene del grupo de los nitrofuranos sintéticos y posee un gran potencial antimicrobiano. Este fármaco reporta la inhibición de la biosíntesis de DNA y la división celular a causa de los daños producidos por el antibiótico en el DNA bacteriano (7). La furazolidona al igual que otros nitrofuranos deriva su actividad del metabolismo reductivo asociado con nitroreductasas que a través de la reducción del grupo 5-nitro de la furazolidona a una hidroxilamina intermedia logra dañar el DNA de la bacteria mediante un ion nitrenium (8, 9).

11 Figura 1. Reducción del grupo 5-nitro del anillo de Furazolidona (Hall, Et al. 2011) A pesar de la importancia de este gen en la bacteria no se ha podido determinar de qué forma o que tanta influencia tiene en la resistencia que desarrolla H. pylori a los diferentes antibióticos, ya que no es el único gen involucrado en este fenómeno, por lo tanto la secuenciación del gen podrá ayudar a determinar de que forma este gen influye en la resistencia desarrollada por la bacteria a la furazolidona (5,6,10). 5. HIPÓTESIS: Se ha determinado por ensayos anteriores que el gen oord de Helicobacter pylori confiere resistencia a furazolidona debido a mutaciones puntuales en varios locus, se puede afirmar que en los aislamientos obtenidos a partir de biopsias gástricas de población colombiana se presentan dichas mutaciones. 6. OBJETIVOS 6.1. Objetivo General: Caracterizar y relacionar las mutaciones en el gen oord con la resistencia de H. pylori a Furazolidona en cepas colombianas.

12 6.2. Objetivos Específicos. Amplificar y secuenciar el gen oord, en cepas de H. pylori susceptibles y resistentes a Furazolidona. Determinar la frecuencia de las mutaciones en los aislamientos estudiados Determinar si existe relación entre la presencia de mutaciones y la resistencia a Furazolidona Correlacionar la presencia de mutaciones con los resultados de sensibilidad antimicrobiana obtenida por la técnica de MIC 7. METODOLOGIA Tabla 1. Variables usadas en el estudio. Variable Unidad de medición Tipo de variable Cepas de H. pylori resistentes y sensibles a furazolidona. Mutaciones presentes en el gen oord de las diferentes cepas Frecuencia de las mutaciones en las cepas estudiadas Cualitativa Cualitativa Numérica Independiente Dependiente Dependiente 8. PROCEDIMIENTO 1. Extracción de DNA de 96 cepas de H. pylori resistentes y sensibles a furazolidona usando el kit de extracción DNAzol. 2. Amplificación del DNA extraído por medio de la Técnica de PCR usando primers específicos para oord reportados en el estudio de Su Et al

13 Tabla 2. Primers usados para amplificación de DNA por técnica de PCR PRIMER GEN (enzima) Secuencias Tamaño fragmento amplificado Forward oord (2- oxoglutarato Reverse oxidoreductasa) 5 -TTTAGCACAAAGGAGAATG-3 5 -AACTTGGCGTAATAGGAT-3 (457 pb) Adaptada de (Su, Et al. 2006) Tabla 3. Ciclo de amplificación de DNA por medio de la técnica de PCR Desnaturalización inicial 95 o C 3 min Desnaturalización 95 o C 30 seg Alineación del Primer 50 o C 30 seg 35 ciclos Extensión del Primer 72 o C 30 seg 3. Secuenciación de los genes amplificados por medio del servicio de la empresa MacroGen- Korea. 4. Análisis de datos; relación entre mutaciones en el gen y resistencia de H pylori a Furazolidona 5. Relación entre mutaciones que otorgan resistencia al furazolidona con resistencia a otros imidazoles como tinidazol y metronidazol 9. DISEÑO Observacional, Descriptivo, transversal 10. RESULTADOS Amplificación por PCR y secuenciación de las muestras La amplificación de las muestras se llevo a cabo usando los primers descritos por Su et al. Y estandarizando el protocolo amplificación por la técnica de PCR, obteniendo la

14 amplificación deseada en la mayoría de las muestras enlizadas, esto e comprobó usando la técnica de electroforesis usando geles de agar de poliacrilamida donde se observaron las bandas que permitían observar con claridad que las muestras habían sido amplificadas con éxito como se observa en la figura 2. Posterior a la amplificación por medio de la técnica de PCR se enviaron las muestras a MACROGEN en donde fueron amplificadas, sin embargo no todas las muestras pudieron ser amplificadas ni parcial ni totalmente como fue el caso de las muestras 3, 4, 5, 14, 15 y 49 las cuales fueron excluidas del análisis de resultados para evitar interpretaciones erróneas de los mismos. Figura 2. Electroforesis de muestras amplificadas usando técnica de PCR 10.1 Mutaciones del gen oord 1) 2) Figura 3. Secuencia del gen oord en tres diferentes locus (408, 489 y 716) en cepas susceptibles a Furazolidona de H. pylori (1). Mutaciones encontradas en los tres diferentes locus del gen oord en 83 cepas de H. pylori relacionadas con resistencia a furazolidona (2).

15 En las cepas analizadas y estudiadas se encontraron cuatro diferentes mutaciones en tres locus del gen diferentes, en el locus 408 una sustitución de A por G que llevo al cambio de la expresión original de treonina (T) por la expresión de una alanina (A); en el locus 489 se observo el cambio de A por una G que produjo la expresión de una valina (V) en vez de la expresión de una isoleucina (I) y por ultimo en el locus 716 donde se realizan dos cambios, el primero de C (que produciría normalmente asparagina (N)) por A llevando a la expresión de lisina (K) ò la sustitución de C por G que lleva a la expresión de también de lisina por parte de la tripleta de nucleótidos resultante de la sustitución como se observa en a figura CMI y su relación con mutaciones en el gen oord de H. pylori La resistencia a Furazolidona fue relacionada con las cuatro mutaciones encontradas en las muestras analizadas y el MIC obtenido en ensayos anteriores realizados en el laboratorio de Microbiología Especial de la Pontificia Universidad Javeriana. En el total de las cepas aisladas se obtuvieron un total de 6 cepas resistentes, la número 23, 27, 42, 44, 69, y 74 en donde se observan 2 mutaciones distintas en cada cepa a excepción de las muestras 69 y 74 la cual solo presenta una, A408G y C716G; A408G y A489G; A408G y C716G; A408G; y A408G respectivamente. Las cepas sensibles también presentaron todas las mutaciones a excepción de la A489G que solo se presento en la cepa resistente numero 27; las mutaciones que más se presentaron fueron la A408G que se presento en la totalidad de las cepas analizadas y la C716A que se presento en la gran mayoría de ellas como se observa en la tabla 3 presentada a continuación. Tabla 3. Relación de CMI y resistencia a furazolidona con resistencia hallada en las cepas estudiadas. No MIC MUTACION NUCLEOTIDOS FURAZOLIDO NA CMI ug/ml PUNTO DE CORTE RESULTADO POSICISION A408G POSICISION A489G POSICISION C716A POSICISION C716G MUTACION PROTEINA POSICISION T11V POSICISI ON I38V 1 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 2 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 6 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 7 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 8 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 9 2 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 16 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO SI SI NO SI POSICISIO N N113K

16 18 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 20 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 21 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 RESISTENTE SI NO NO SI SI NO SI 24 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 25 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 26 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 RESISTENTE SI SI NO NO SI SI NO 29 0,125 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI SI ,5-2 SENSIBLE SI NO NO SI SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI NO ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI NO ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO SI ,5-2 RESISTENTE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 RESISTENTE SI NO NO SI SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO SI 47 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 48 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 51 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO SI SI NO SI 53 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 55 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 56 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 58 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 60 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI NO ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO

17 64 1 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI NO 68 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 RESISTENTE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 RESISTENTE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI SI SI ,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO ,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 79 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 82 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 83 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 84 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 85 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 86 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 87 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 88 0,5 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 89 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 90 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 91 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 92 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 93 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO SI NO SI NO SI 94 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 95 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO 96 0,25 0,5-2 SENSIBLE SI NO NO NO SI NO NO

18 11. ANÁLISIS DE LOS DATOS OBTENIDOS. 1. Descriptivo: frecuencias de mutaciones Tabla 4. Frecuencia de las mutaciones evaluadas en 83 cepas de H. pylori extraídas de biopsias gástricas de pacientes colombianos. Muestra Mutación Resistente Sensible Total % A408G A489G ,2 C716A ,55 C716G ,02 2. Evaluación de la relación entre mutación y resistencia a Furazolidona usando prueba de Chi cuadrado (X 2 ). Tabla 5. Tabla de contingencia prueba de chi-cuadrado para mutación A489G Presencia mutación Resistente Sensible Total Si No Total X 2 = 12,99 P <0, Existe relación estadísticamente significativa entre la mutación A489G y la resistencia a Furazolidona de las cepas de H. pylori evaluadas. Tabla 6. Tabla de contingencia prueba de chi-cuadrado para mutación C716A Presencia mutación Resistente Sensible Total Si No Total X 2 = 1,308 P= 0,253 - No existe relación estadísticamente significativa entre la mutación C716A y la resistencia a Furazolidona de las cepas de H. pylori evaluadas.

19 Tabla 7. Tabla de contingencia prueba de chi-cuadrado para mutación C716G Presencia mutación Resistente Sensible Total Si No Total X 2 = 8,52 P= 0,004 - No existe relación estadísticamente significativa entre la mutación C716G y la resistencia a Furazolidona de las cepas de H. pylori evaluadas. 3. Comparación de CMI y presencia o ausencia de mutaciones mediante análisis de concordancia (kappa). Presencia mutación Resistente Sensible Total Alguna Ninguna Total Kappa = 0,065 P= 0, DISCUSION En el presente estudio se aislaron 83 cepas de H. pylori a partir de biopsias gástricas de pacientes colombianos donde se obtuvieron varios resultados entre los que se encuentran la identificación de 6 cepas resistentes a furazolidona con puntos de corte de 4 µg/ml de furazolidona y cepas sensibles con puntos de corte 2µg/ml. En los 83 asilamientos de H. pylori obtenidos por medio de la extracción de de biopsias gástricas de pacientes colombianos se encontraron diferentes tipos de mutaciones en las cuales se observaron cambios de nucleótidos en diferentes locus del gen oord. En el trabajo realizado por Su Et al Se describen cuatro diferentes tipos de mutaciones en las cuales se encontró sustitución de las bases A por G en la posición 408, A por G en la posición 489 y C por A ò G en la posición 716. Estas mutaciones encontradas en el gen oord se pensaba podrían ser las responsables de la resistencia de H. pylori a furazolidona, sin embargo en las 83 cepas aisladas en el presente estudio se encontró que la mutación en la posición 408 en la que se remplaza A por G está presente en la totalidad de las cepas aisladas, tanto en las resistentes como en las sensibles; esta mutación también descrita por (Hughes Et al1998). Mostraba una modificación en los aminoácidos de la proteína

20 específicamente un cambio de treonina por alanina en la estructura de la proteína. Este hallazgo sugiere que esta mutación ubicada en el nucleótido 408 del gen oord podría no estar relacionado con la resistencia que presenta H pylori a furazolidona, sino que podría tratarse de un polimorfismo presente en la totalidad de las cepas estudiadas por lo que se debe investigar más a fondo la razón por la cual todas las cepas la presentan y su frecuencia usando métodos de clonación en cepas recombinantes en las cuales se podría insertar el gen a evaluar y posteriormente enfrentar el microorganismo genéticamente modificado al antibiótico de interés para observar si este le otorga o no resistencia (11). Al igual que la frecuencia de la mutación A408G que se presento en el 100% de las cepas analizadas, se encontraron mutaciones con una frecuencia media, como en el caso de la mutación C716A la cual se presento ampliamente (32 cepas) tanto en resistentes como en sensibles haciendo de esta mutación un potencial polimorfismo que de la misma manera que la mutación A408G hace presumir que no tienen relación con la resistencia que presentan algunas cepas de H. pylori a furazolidona. Las mutaciones con menor frecuencia entre la totalidad de las cepas fueron las C716G que se presento en 5 cepas de las cuales 2 fueron resistentes y 3 sensibles y la mutación A489G que se presentó solamente en una cepa resistente. Estas mutaciones se pueden interpretar de diferentes formas teniendo en cuenta la CMI que presentaron las cepas y el punto de corte obtenido en la técnica de dilución en agar, ya que en el presente estudio se tomaron valores de entre 0,5 y 2 µg/ml para cepas sensibles y mayor a 2 µg/ml para cepas resistentes como reporto Mendonça Et al Se podría interpretar que un punto de corte de 2µg/ml y de 1µg/ml podrían ser resistencias medias al antibiótico por parte del microorganismo ya que a pesar de ser valores relativamente pequeños en comparación con otros antibióticos como metronidazol que presenta una MIC de 8 µg/ml en la mayoría de las cepas aisladas, se observa inhibición del microorganismos con valores de 0.5µg/ml o menos (13); por lo tanto seria probable que las mutaciones que otorgan resistencia a furazolidona en H. pylori también estén presentes en microorganismos con puntos de corte de estos dos valores como sucedió en las cepas con la mutación C716G las cuales presentaron una MIC de 1, 2 y 4µg/ml. Un parámetro más para tener en cuenta a la hora de relacionar la resistencia a Furazolidona con las mutaciones encontradas en las muestras analizadas es las infecciones mixtas que podrían haberse presentado en las biopsias gástricas extraídas de los pacientes, ya que en ocasiones no se pudo aislar la cepa pura de H. pylori, se extrajo DNA directamente de la biopsia lo que pudo haber sido un interferente a la hora de amplificar y secuenciar las muestras mostrando en el cromatograma de la secuenciación la presencia de varios nucleótidos diferentes en el mismo locus del gen como se observa en la figura 4.

21 Figura 4. Cromatograma que muestra la presencia de picos de dos bases (Citosina color azul y Alanina color verde) en la posición 330 del gen que demuestra la presencia de una infección mixta en la muestra numero 69. En la muestra numero 69 donde está presente la infección mixta se puede observar que la mutación C716G está presente en una de las cepas amplificadas por lo que se puede atribuir a esta cepa el resultado de la MIC en el cual se observo la resistencia de la cepa aislada de esta muestra. Debido a las mutaciones que se presentan a nivel molecular en las cepas estudiadas, se presentan cambios en la expresión de la proteína, donde se pueden observar variaciones de aminoácidos en la estructura original de la enzima 2-Oxoglutarato oxidoreductasa; estos cambios de aminoácidos especialmente el cambio de I por V en la posición 38 puede ser uno de los mayores responsables de la resistencia de H. pylori a furzolidona, por contribuir a la disminución de NADH oxidasa haciendo que las concentraciones de O 2 aumentaran intracelularmente inactivando las nitroreductasas que es el mecanismo que se cree responsable a nivel bioquímico de esta resistencia. 13. CONCLUSIONES Se encontró que el gen oord presenta mutaciones que probablemente si estén relacionadas con resistencia a Furazolidona por parte de H. pylori Se pudo observar que la mutación A408G descrita por Su Et al. (2006) Como posible causante de la resistencia a Furazolidona por parte de H. pylori no tiene relación con este fenómeno ya que se presento en el total de las cepas tanto en resistentes como en sensibles por lo que podemos concluir que se trata de un polimorfismo. Se pudo confirmar estadísticamente que las mutaciones C716G y A489G tiene relación con la resistencia presentada por algunas cepas de H. pylori a Furazolidona. Fue posible aislar, amplificar y secuenciar el gen oord de H. pylori y relacionarlo con la resistencia que presenta el microorganismo a Furazolidona.

22 14. RECOMENDACIONES Para confirmar que las mutaciones encontradas en las diferentes cepas resistentes de H. pylori confieren resistencia a Furazolidona se debería realizar un estudio de transformación de cepas susceptibles en las cuales se inserte el gen con la mutación a evaluar y posteriormente enfrentarlo a concentraciones altas del antibiótico y así determinar fenotípicamente si dichas mutaciones confieren la resistencia al antibiótico en estudio. 15. BIBLIOGRAFIA 1. Mansour B, burucoa C, Zribi M, Primary resistance to claritromycin, metronidazole and amoxicillin of Helicobacter pylori isolated from tunisian patients with peptic ulcers and gastritis: a prospective multicentre study, Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 2010, 9: Hernandez M, Reyes O, Rodriguez B, The resistence to antibiotics in Helicobacter pylori, Centro Nacional de Investigaciones Científicas Departamento de Microbiología e Inmunología, Jeong J, Mukhopadhyay A, Akada J, Dailididene D, Role of FrxA and RdxA nitroreductases of Helicobacter pylori in susceptibility and resistance to metronidazole, Journal of Biotecnology, sept, 2001, pag Gerrits M, Vliet A, Kuipers E, Kusters J, Helicobacter pylori and antimicrobial resistance: molecular mechanism and clinical implications, Lancet infect dis, 2006 pag Solca N Bernasconi M, Piffaretti J, Mecanism of Metronidazole Resistance in Helicobacter pylori: Comparision of the rdxa gene sequences in 30 strains, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000 pag Hughes. N, Clayton. C, Chalk. P; Helicobacter pylori porcdab and oordabc genes encode distinct pyrubate:flavodoxin and 2-oxoglutarate:aceptor oxidoreductases which mediate electron transport to NADP; Departamente of molecular biology adn biotechnology, university of Sheffield; journal of bacteriology; 1998, pag

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