Mucho antes de que se conociera la existencia de microorganismos, se utilizaban métodos para su destrucción (agentes físicos y químicos).

Transcripción

1

2 Mucho antes de que se conociera la existencia de microorganismos, se utilizaban métodos para su destrucción (agentes físicos y químicos). La Ley de Moisés obligaba a los hebreos a quemar la ropa de quienes morían de lepra. Los egipcios incineraban materiales infecciosos. Utilizaban sustancias químicas para embalsamar los cuerpos. * Aristóteles ( ac) Recomendó a Alejandro Magno hervir el agua que le daba a beber a sus soldados. * Avicena ( ) Indicaba que el agua podía potabilizarse por evaporación y destilación o por ebullición.

3 Empleó microscopios muy simples de construcción propia para examinar el contenido microbiano de sustancias naturales y describe por primera vez los microorganismos. Cohn ( ) Ideó métodos simples para evitar la contaminación de medios de cultivo estériles. Descubrió bacterias formadoras de endosporas (resistentes a la temperatura). Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ª ed.

4 Spallanzani ( ) y Pasteur ( ) En experimentos para refutar la teoría de la generación espontánea se establecen los principios de la esterilización Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12ª ed.

5 * Robert Lister (1867) Establece los principios antisépticos de la cirugía * Instrumentos esterilizados por calor * Vendajes esterilizados con fenol Desde entonces el control del crecimiento de los microorganismos se ha tomado un tema central en: * Prevención de enfermedades e infecciones * Conservación de alimentos

6 ES EL USO DE AGENTES FÍSICOS O QUÍMICOS CON EL FIN DE DESTRUIR O ELIMINAR LA TOTALIDAD DE LOS MICROORGANISMOS VIABLES PRESENTES EN UN MATERIAL, PRODUCIENDO UNA CONDICIÓN DE ESTERILIDAD.

7 Pipetas, tubos, pacas de Petri, pinzas etc. que van a ser utilizados en el laboratorio de Microbiología con fines de investigación o diagnostico. Preparación de medios de cultivo para cultivo y aislamiento de microorganismos a partir de diferentes tipos de muestras o para control de medio ambiente, equipos, personal, medicamentos o cosméticos. Descontaminación del material utilizado Equipos y materiales quirúrgicos de uso medico con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes.

8 ES EL USO DE AGENTES QUÍMICOS PARA ELIMINAR LA INFECTIVIDAD POTENCIAL DE UN MATERIAL (NO IMPLICA LA ELIMINACIÓN DE TODAS LAS FORMAS MICROBIANAS). DESTRUYE LAS FORMAS VEGETATIVAS Y NO ELIMINA LAS ENDOSPORAS BACTERIANAS.

9 Términos relacionados con el control microbiano: -Estéril: ausencia absoluta de toda formas de vida microbiana. -Asepsia: conjunto de medidas destinadas a impedir toda contaminación microbiana. -Agente bactericida: agente que mata las bacterias. -Agente bacteriostático: agente que inhibe el crecimiento microbiano. -Agente fungicida: agente que mata los hongos. -Agente fungistático: agente que inhibe el crecimiento fúngico. -Agente virucida: agente que detiene la replicación y la actividad vírica. - Agente virustático: agente que inhibe la replicación vírica.

10 ESTERILIZACIÓN: Probabilidad de sobrevida de microorganismos: 10-6 SAL: sterility assurence level: nivel de seguridad en esterilización SAL 10-6 Probabilidad de una unidad no-estéril es igual a 1 en 10 6 unidades procesadas

11 CINÉTICA DE MUERTE N t = N o e- Kt Ln Nt/No= - K t No/Nt= e- Kt

12 log Nº sob brevivientes CARGA DE POBLACIÓN BAJA CARGA DE POBLACIÓN ALTA Tiempo (min) Esto se cumple para el tratamiento con calor como para el tratamiento químico.

13 D C B A A: curva logarítmica normal B: esporas C: microorganismos altamente sensibles bifásica, por calor y radiación D: en tratamientos químicos

14

15

16 LAVADO ENJUAGADO SECADO ENVOLTURA

17 Se realiza con agua y detergente - Reduce la tensión superficial del agua colaborando en la solubilización de albúmina, emulsión de grasa y suspensión de partículas. - El empleo de detergentes enzimáticos es de mayor eficiencia.

18 - Para asegurar la eliminación de partículas extrañas - Eliminar materia orgánica que protege a los microorganismos

19 # Cómo se realiza el enjuague? Se debe enjuagar muy bien y con suficiente cantidad de agua corriente potable y agua destilada. # Para qué secamos? Para evitar la contaminación posterior y deterioro del material. # Para qué envolvemos? Para evitar la recontaminación microbiana en el momento de la salida de la cámara de esterilización, durante el transporte y almacenamiento hasta el momento de su utilización.

20 Permeable al agente esterilizante Resistente a la penetración de microorganismos Libre de pérdida de fibras y partículas. No tóxico Resistente a mojaduras y pinchaduras o roturas

21 MÉTODOS FÍSICOS MÉTODOS QUÍMICOS Calor seco Llama directa Aire caliente (estufa) Incineración Óxido de etileno Formaldehído Glutaraldehído Gas plasma Calor húmedo A vapor fluente (tyndalización) A presión (autoclave) Radiaciones Ultravioletas Ionizantes Filtración Filtros de profundidad Filtros de membrana Filtros de nucleación (Nucleopore)

22 MECANISMO DE ACCIÓN DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS, DISOLUCIÓN DE LÍPIDOS Y DAÑO DE ÁCIDOS NUCLEICOS NO APTO PARA SUSTANCIAS Ó MATERIALES TERMOSENSIBLES RAPIDO Y PENETRANTE 70 C : hongos, virus y cel vegetativas de las bacterias 121 C: endosporasbacterianas

23 Llama directa Material a esterilizar: -Ansas -Tijeras -Portaobjetos -Pinzas -Material muy resistente al calor - Incineración: desechos infecciosos ( C, en desuso por estropear el medio ambiente)

24 ESTUFAS DE ESTERILIZACIÓN (U HORNOS) 160º C /2 h 180º C h

25 Qué material podría esterilizarse por calor seco?? - Materiales resistentes al calor -Sustancias no miscibles en agua (soluciones oleosas, aceites, vaselina líquida) en recipientes cerrados. -Polvos (talco) -Material de vidrio resistente y metal No se pueden esterilizar: Medios de cultivo sólidos o líquidos (se deshidratan) Material de goma (guantes, sondas) Textiles.

26 AUTOCLAVE: 121º C, durante15 a 20 min, a 1 atm de presión interna Fundamento: a mayor presión interna del autoclave mayor temperatura de ebullición del agua. Mecanismo de acción: desnaturalización de proteínas, disolución de lípidos Autoclave tipo Chamberland

27 Tipo Chamberland

28 Diferentes tipos:

29 Objeto Autoclave La temperatura de un objeto bastante voluminoso se eleva más lentamente que la temperatura del autoclave

30 - Material de vidrio o metálico - Agua destilada, solución fisiológica (NaCl 0,9 %) - Medios de cultivo que no lleven incorporados hidratos de carbono - Material de plástico autoclavable (tips, tubos Eppendorf, equipos de filtración)

31 Se puede realizar: * A vapor fluente (olla a presión o autoclave c/ espita abierta) * A Baño María a ebullición PROCESO DE ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO EN TRES ETAPAS 1er. Proceso 20 min a 100º C 24 h a temperatura ambiente Ó A 37 C 2do. Proceso 20 min a 100º C 24 h a temperatura ambiente Ó A 37 C 3er.Proceso 20 min a 100º C 24 h a temperatura ambiente Ó A 37 C

32 Durante los períodos de incubación las esporas germinarán pasando a formas vegetativas Para que las esporas germinen necesitan: Un shock térmico Un medio de cultivo rico en nutrientes Una temperatura y tiempo adecuado

33 Se pueden tyndalizar: Medios que no resisten 121º C Medios ricos en nutrientes (hidratos de carbono) y que permitan la germinación de esporas No se pueden tyndalizar: Agua destilada Solución fisiológica Soluciones de buffers o electrolitos Medios pobres en nutrientes

34 Menor tiempo de esterilización Menor temperatura El calor húmedo es más penetrante que el calor seco Se pueden esterilizar medios de cultivo Se pueden esterilizar otros líquidos como agua destilada (AD) y solución fisiológica (SF)

35 CUÁL ES EL OBJETIVO? DESTRUIR MICROORGANISMOS PATÓGENOS (Listeria monocytogenes, algunas especies decampylobacter, Salmonella y Escherichia coli O157:H7 ) Y REDUCIR LA MICROFLORA ALTERANTE PRESENTE, LO QUE PROLONGA LA VIDA ÚTIL DEL PRODUCTO EN CONDICIONES DE REFRIGERACIÓN. Aplicaciones: - leche - jugos de frutas - bebidas (vinos, cervezas) La pasteurización no es sinónimo de esterilización.

36 LHT (Low Temperature Holding) 30 minutos a 63-66º C HTST (High Temperature Short Time) 15 segundos a 72-73º C - Altera el sabor en menor medida - Mata los MO resistentes al calor con mayor eficacia - Puede realizarse en un sistema continuo - Este método se utiliza en la industria de productos lácteos

37 140º C 150º C durante pocos segundos Proceso continuo Necesita envasado aséptico Logra esterilidad comercial

38 LOS MICROORGANISMOS NO SE DESTRUYEN SINO QUE SON REMOVIDOS SE APLICA PARA LA ESTERILIZACIÓN DE LÍQUIDOS Y GASES SE APLICA PARA LA ESTERILIZACIÓN DE LÍQUIDOS TERMOSENSIBLES: soluciones oftálmicas e intravenosas, radiosótopos, vacunas, H de C, medios ricos para cultivo celulares, soluciones de antibióticos y vitaminas

39 FILTROS DE PROFUNDIDAD Filtración Filtros de profundidad Filtros de membrana Filtros de nucleación (Nucleopore) -En este tipo de filtros la retención de partículas se produce por una combinación de absorción y efecto tamiz. -Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo (fibras de papel o vidrio de borosilicato). -Dado que el material de filtración está dispuesto al azar en una lámina gruesa, los filtros de profundidad no se obstruyen fácilmente, por lo que se usan como prefiltros para eliminar partículas grandes de suspensiones líquidas. Filtros HEPA

40 FILTROS DE NUCLEACIÓN (Nucleopore) Filtración Filtros de profundidad Filtros de membrana Filtros de nucleación (Nucleopore) - Son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias químicas. -Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente, funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro. -Menor cantidad de poros, la velocidad de flujo es mas baja y se produce atascamiento -Se usan en microscopía electrónica de barrido para concentración y visualización.

41 Filtración Filtros de profundidad Filtros de membrana Filtros de nucleación (Nucleopore)

42 LA FILTRACIÓN SE UTILIZA PARA ESTERILIZAR LÍQUIDOS TERMOLÁBILES

43 MECANISMOS DE ACCIÓN FILTROS DE PROFUNDIDAD: Adsorción y efecto tamiz Filtros de membrana: Efecto tamiz - Usos actuales de filtros de profundidad: prefiltros. - Usos de las membranas filtrantes: laboratorio de microbiología, investigación e industria

44 * Filtran más rápido líquidos y gases Filtran únicamente por efecto tamiz No alteran las características organolépticas de las suspensiones Filtran mediante la aplicación de una bomba de vacío Son esterilizados en autoclave Se desechan una vez utilizados Además de esterilizantes tienen otras utilidades en microbiología (recuentos, concentración y separación de microorganismos).

45 FILTRO HEPA (High Efficiency Particulate Aire) Laminas de borosilicato que atrapan partículas y agentes infecciosos de más de 0,3 micras con una efectividad del 99,97%. Efecto Tamiz. FILTROS ULPA: retienen partículas de entre 0,1 y 0,2 micras. Eficiencia de 99.99%

46 FILTROS HEPA LUZ UV Gabinete de clase II Cabina de flujo laminar

47 CBS de clase II

48 UV entre 220 y 300nm. Fuente: Introducción a la Microbiología. Tortora y Col

49 RADIACIONES NO IONIZANTES Ej. UV CARACTERÍSTICAS -Alta energía, baja longitud de onda -Gran poder de penetración -Ionizan átomos y moléculas -No requieren altas temperaturas CARACTERÍSTICAS -Baja energía, sin poder ionizante -Sin poder penetrante -Máxima eficiencia biocida a 260 nm FUENTES MÁS HABITUALES -Rayos gamma -Rayos catódicos (electrones acelerados) - Rayos X

50 Radiaciones ionizantes MECANISMOS DE ACCIÓN Radiaciones ultravioletas Ionización de los contenidos celulares, formación de radicales libres, y moléculas excitadas y esto lleva a la desorganización de enzimas y del DNA. Produce lesiones del DNA letales o modificaciones químicas como uniones cruzadas entre bases que interfieren en la replicación (dímeros de pirimidinas T-T)

51

52

53 RADIACIONES UV Afectan a las moléculas de DNA formando dímeros de Timina. Son escasamente penetrantes y se utilizan para esterilizar superficies y el aire en salas y cabinas y el agua que no la absorbe.

54 CREACCIÓN Y REPARACIÓN DE UN DÍMERO DE TIMINA PRODUCIDO POR LA LUZ UV LUZ UV

55 RADIACIONES IONIZANTES - Son acumulativas - Material medico quirúrgico: guantes de goma, implantes (válvulas cardiacas), injertos óseos y de tejidos, catéteres, suturas, jeringas, agujas y bisturies. - antibióticos, vacunas, hormonas - Las radiaciones gamma se usan en la Industria alimentaría RADIACIONES UV - desinfección de superficies en CBS: disminución de la contaminación de cultivos y de operarios. - desinfección de aire (quirófanos, sala de quemados, de inmunodeprimidos, de animales de experimentación) - desinfección de agua - No penetra superficies sólidas, opacas, vidrios, plásticos, líquidos turbios y materiales empaquetados

56 CONTROL DE ESTERILIZACIÓN: SE REALIZA PARA COMPROBAR SI SE CUMPLIERON LAS CONDICIONES DEL PROCEDIMIENTO EMPLEADO. CONTROL DE ESTERILIDAD: SE REALIZA SOBRE LAS MUESTRAS O ALÍCUOTAS DEL MATERIAL ESTERILIZADO CON EL OBJETO DE COMPROBAR LA AUSENCIA TOTAL DE MICROORGANISMOS.

57 CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN BIOLÓGICO FÍSICO QUÍMICO CONTROL DE ESTERILIDAD BIOLÓGICO A) Control biológico: esporas bacterianas en algún soporte (papel), es el mas confiable. Microorganismos esporulados: - Bacillus stearothermophilus: esterilizadores de vapor - Bacillus subtilis vr. niger: esterilización por óxido de etileno - Bacillussubtilis vr. nigero Clostridiumtetani: esterilización por calor seco - Bacilluispumiluso Streptococcusfaccium: esterilización por radiaciones - ionizantes

58 Para esterilización con gas

59 B) Control físico: método directo y sin demora que registra la temperatura y el tiempo en que se mantuvo la misma. Termógrafos C) Control químico: Sustancias químicas en tubo que funden a temperatura de esterilización. Están mezcladas con un colorante y al fundir indican si se alcanzó la temperatura óptima de esterilización. Desventajas: no dan información sobre la relación temperatura/tiempo como tampoco miden la penetración del vapor. Para tratamientos a 121º C anhídrido succínico (PF: 120º C) o ácido benzoico (PF: 121º C) y para tratamientos a 115º C es apropiado el azufre (PF: 115º C). Método mas confiable: control biológico

60 Integradores de esterilización mediante un cambio cromático progresivo integran todas las variables críticas del proceso. - para calor seco (cambian de color del amarillo al marrón: ciclo correcto) - para vapor (cambian de color amarillo al azul: ciclo correcto). Para esterilización con calor seco

61 - Medios de cultivo se toman los de la zona central y se incuban a 37 C, 24h. - Sustancia termolábil se toma una alícuota se coloca en medio d cultivo adecuado se incuban a 37 C, 24h.

62 Mecanismo de acción: ÓXIDO DE ETILENO - por alquilación, modifica la estructura molecular de las proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos a través de reacciones irreversibles que alteran los procesos de reproducción y metabólicos de las células. Aplicaciones: -material que no puede ser esterilizado por vapor o calor seco: aparatos termolábiles y ópticos, fibras artificiales, accesorios de respiradores, hilos de sutura, etc.

63 VENTAJAS DESVENTAJAS - Bactericida, esporicida y virucida - Explosivo e inflamable - Coeficiente de difusión muy favorable - Tendencia a polimezarse - Requiere humedades relativas > 50% - Puede ser incompatible con algunos plásticos - Puede usarse para material - Es muy tóxico para el - operador termosensible o muy delicado - Acción lenta (3-4 h) (cuero, libros, etc) Los hospitales tienen cámaras de óxido de etileno para esterilizar el material hospitalario. Esterilizador con óxido de etileno

64 Formaldehído: puede resultar tan efectivo como el óxido de etileno bajo poder penetrante tiende a polimerizarse a una forma inactiva a bajas temperaturas es afectado por materia orgánica como suero, esputo, pus. Los artículos esterilizados mediante formaldehído deben estar perfectamente limpios, en envases abiertos. la humedad relativa debe ser mantenida entre el 80 y 90%, la temperatura por encima de 60º C, y la concentración al mayor nivel posible. El tiempo de exposición debería ser lo más prolongado posible y no menor de 4 h. Mecanismo de acción: alquilación

65 Glutaraldehído: soluciones alcalinas resultan esporicidas (esterilización de superficies). se necesitan concentraciones del 2% en solución acuosa a ph 7,5 y 8,5 (0,3% de bicarbonato de sodio) pero reduce la estabilidad de la solución, porque puede ocurrir una polimerización inactiva. Se pueden esterilizar por este método todo tipo de instrumental que no pueda esterilizarse por calor (inoxidables, lentes, sintéticos flexibles, etc.) efectuando inmersiones en cubas apropiadas. El material que va a ser esterilizado o desinfectado por este método debe lavarse previamente con abundante agua para reducir la presencia de sustancias orgánicas comunes (sangre, suero, pus, etc.). Deben utilizarse guantes de goma y antiparras durante su empleo porque es irritante de mucosas, piel y membranas. El material tratado debe enjuagarse muy bien con agua destilada estéril y secar con nitrógeno o se puede lograr un secado rápido con una mezcla de alcohol y agua (50%). Se debe trabajar en lugares que se pueden airear ya que el glutaraldehído es muy irritante y volátil. El mecanismo de acción es por alquilación.

66 Es un método de esterilización a baja temperatura. El vapor de peróxido de hidrógeno o de ácido peracético es convertido en plasma sometiéndolo a energía de frecuencia radial. MECANISMO DE ACCIÓN El plasma consiste en partículas altamente cargadas y radicales libres esterilizantes.

67 VENTAJAS Productos finales no tóxicos (vapor de agua y oxígeno) Baja temperatura Material esterilizado puede ser usado inmediatamente debidamente empaquetados Se utiliza en hospitales USOS Se puede esterilizar material metálico y no metálico e instrumental médico para microcirugíasensible al calor Se puede esterilizar material quirúrgico No se pueden esterilizar productos de celulosa, algodón, papel, agua, materiales orgánicos

68 Agentes desinfectantes (o germicidas) son agentes químicos capaces de matar los microorganismos patógenos de un material inanimado. Pueden presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se suelen usar sólo para materiales inertes. Agentes antisépticos son sustancias químicas que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos y pueden aplicarse en tejidos vivos dada su escasa toxicidad para los tejidos.

69 Amplio espectro de actividad Bajo costo Inocuo para tejidos vivos No tóxico Rapidez y eficacia en materia orgánica Baja capacidad de generar resistencia No irritante ni sensibilizante No teñir tejidos No poseer olor desagradable Compatible químicamente con otras sustancias

70 - Germicida de amplio espectro - Bajo costo - No corrosivo, no alterar tejidos - Baja toxicidad - Amplia acción - No generar resistencia - Soluble en agua - Sin olor desagradable - Alta estabilidad

71 FACTORES QUE AFECTAN LA POTENCIA DE UN DESINFECTANTE: - ph - Temperatura - Presencia de materiales orgánicos - Concentración del agente y tiempo de actuación

72 Prueba del coeficiente fenólico Prueba de la utilidad de la dilución Método de difusión con disco

73 Fuente: Introducción a la Microbiología. Tortora y Col

74 CLASIFICACIÓN DE ACUERDO A SU MECANISMO DE ACCIÓN: Agentes que dañan la membrana citoplasmática 1) Detergentes: catiónicos, aniónicos y no iónicos 2) Compuestos fenólicos; fenol, cresoles, bisfenol (triclosan) 3) Alcoholes: etanol, isopropanol Agentes desnaturalizantes de proteínas 1) Ácidos y bases fuerte 2) Ácidos orgánicos no disociables Agentes modificadores de grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos 1)Metales pesados: mercuriales, de plata, de cobre 2)Agentes oxidantes: agua oxigenada, halógenos, permanganato de potasio, acido peracético 3)Colorantes: derivados de anilina, acridina 4)Agentes alquilantes: formaldehído, glutaraldehído, óxido de etileno

75 Fenoles: -lesionen las membranas ricas en lípidos -No se utilizan (irritante)

76 Agentes Químicos

77 B) Agentes desnaturalizantes de proteínas Ácidos y bases fuertes. Son activamente bactericidas debido a sus grupos H+ y OH- Mycobacterium tuberculosis es resistente a la acción de bases fuertes. Ácidos orgánicos no disociables. El ácido benzoico y el benzoato de sodio se usa como conservante de alimentos. Los ácidos cítrico y láctico se adicionan a alimentos para prolongar la vida útil. C) Agentes modificantes de grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos Metales pesados. Las sales de Hg y Ag son los más efectivos (1 ppm). Compuestos mercuriales orgánicos (merthiolate) se usan como antisépticos no irritantes Compuestos de cobre sólo se aplican en agricultura para control de algas y hongos.

78 Agentes alquilantes. Son agentes esterilizantes activos sobre células vegetativas, esporas y ejercen su efecto letal por alquilación de proteínas y ácidos nucleicos. La alquilación se produce reemplazando hidrógenos libre de NH2 y OH en proteínas y ácidos nucleicos y de COOH y SH en proteínas por grupos alquilos. -Formalina: se usa para preservar tejidos y en la preparación de vacunas. -Oxido de etileno: para esterilizar materiales termolábiles. - Glutaraldehído: es menos tóxico y más potente que el formaldehído. Cada vez se emplea más como esterilizante de instrumental quirúrgico. Es recomendado para esterilizar equipamiento de terapia respiratoria.

79 AGENTES QUÍMICOS Tintura de yodo: es una mezcla de I 2 + IK en alcohol 70%, es un antiséptico de piel. Alcohol iodado: tintura de yodo al 10% en etanol de 96º C. Los iodóforos (combinación de yodo y una molécula orgánica, a partir de la cual el yodo se libera lentamente) son antisépticos. El cloro como gas o en combinación con otras sustancias químicas, se lo utiliza como desinfectante. El ácido hipocloroso y el hipoclorito de sodio se usa para desinfectar superficies El peróxido de hidrógeno es un antiséptico. No es un buen antiséptico para las heridas abiertas, porque el H 2 O 2 es degrado la catalasa tisular.

80

81 COMPARACIÓN DE LA EFICIENCIA DE DIVERSOS ANTISÉPTICOS

82 MÁS RESISTENTES PRIONES ENDOSPORAS DE BACTERIAS MICOBACTERIAS QUISTES DE PROTOZOOS FORMAS VEGETATIVAS DE PROTOZOOS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS HONGOS Y ESPORAS DE HONGOS VIRUS SIN ENVOLTURA BACTERIAS GRAM POSITIVAS VIRUS CON ENVOLTURA LIPÍDICA MENOS RESISTENTES