Sistema de Procesamiento de Imágenes Microscópicas: Espermiograma Digital y Patología por Internet

Transcripción

1 vvv Sistema de Procesamiento de Imágenes Microscópicas: Espermiograma Digital y Patología por Internet Steffen Härtel Laboratory of Scientific Image Analysis (SCIAN-Lab) Biomedical Neuroscience Institute (BNI) Anatomy and Developmental Biology Program, ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile Montevideo 02 del Abril del 2013

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3 vvv Joaquín Torres Garcia UNIVERSALISMO CONSTRUCTIVO morfología topología y patrones tiempo

4 vvv Partial differential equations 2D Morpho-topology in lipid monolayers 2010 BBA 2009 Biophysical Journal 2007 Cell Biochemistry and Biophysics 2005 Biophysical Journal 3D Morpho-topology 2012 European Biophysics Journal 2011 J Microbiol Methods 2010 J of Struct Biol 2010 Development 2010 Biological research 2009 BBA 2007 Computational Modelling IPOL Motion estimation and tracking 2013 IPOL 2012 Machine Vision and Applications 2012 PLosOne 2011 Revista Médica de Chile Cross correlation functions Colocalization 2012 PLosOne 2011 JBC 2011 Arthritis & Rheumatism 2011 Biol Research 2011 Antioxid Redox Signal 2010 Journal of Microscopy 2009 JBC I 2009 JBC II 2008 Cardiovasc Res I + 2

5 vvv SCIAN-Lab Basic Science R&D Human Capital Formation Medical Informatics Basic Science FONDECYT CONICYT FONDEF CONICYT DAAD / DFG ICM Redes: Red de Investigación de Cancer de Estados Unidos y America Latina US LA CRN Fibra de 10 GB entre Medicina y NLHPC VID, U-Chile, BNI, F-Med, ICBM, NLHPC, National Cancer Institute EEUU: NCI

6 vvv SCIAN-Lab PI Biophysics PostDocs Biology / Computer Sc / Electrical Engineer PhD - students Computer Sc / Electrical Engineer Master - students Medical Technology / Electrical Engineer Undergraduate Computer Sc Research Assistants Medicine / Computer Sc / Electrical Engineer Technicians Biotechnology / Labtechnician / Administration

7 vvv SCIAN-Lab

8 vvv SCIAN-Lab <-> BNI

9 vvv SCIAN-Lab <-> BNI Perkin Elmer Spinning Disk Leica TCS LSI: Super Zoom Confocal + SOFI NanoZoomer: Tissue Imaging

10 vvv SCIAN-Lab <-> BNI Pulgar, Concha, Keller 2012 unpublished Keller et al, Science 322, 2008

11 vvv Light Microscopy in LA Ernst Abbe Resolution ~ / 2 ~ Full Width at Halft Maximum (FWHM) FWHM

12 vvv Light Microscopy outside LA M Goeppert-Mayer M Gustafson S Hell E Betzig MPI Göttingen Janelia Farm BIOQUANT Hdg FWHM(xy) ~ /2 ~ /4 ~ / ~ /4 ~ /100 2-photon SIM STED 4- PALM

13 vvv Superresolution optical fluctuation imaging (SOFI) Fluctuating light source: Quantum dots (Cd/Se) (ZnS) (2º antibody) Joerg Enderlein, Göttingen

14 Image formation with SOFI Dertinger T., Colyer R.; Iyer G.; Weiss. S.; Enderlein J., PNAS, 2009

15 SOFI higher order cumulants 1 st 2 nd 4 th 16 th 25 th Scale bar: 250 nm Dertinger T., Colyer R.; Iyer G.; Weiss. S.; Enderlein J., PNAS, 2009

16 2nd order SOFI applied to a neuronal ER image KDEL

17 Two channel 2nd order SOFI Wide-field KDEL/GABABR1 SOFI 2nd order 5 µm

18 vvv Transgenic flh::gfp LEO-Lab/SCIAN-Lab (Härtel et al Computational Modelling of Objects Represented in Images. Fundamentals, Methods and Applications) Morpho-genetic mechanisms interplay of form and function..

19 vvv Original Data Deconvolved Data ( Hand drawn contour Snakes Kass M. et al (1988) Int. J. Comp. Vis. 1: Xu & Prince (1998) Signal Processing 71: D 3D

20 vvv

21 vvv box model time (hpf) box length box hight box width box elongation box flatness box entropy

22 vvv 26 hpf 32 hpf 38 hpf ZO-1 apical basolateral Similar for -tubulin, γ-tubulin, Phalloidin,

23 vvv 26hpf

24 E C( s) s E E E ext n f [ C( s)] ds [ C( s), C 2 i 2 C( s) 2 s ( s)] ds [ C( s), C( s, t 1), C( s, t 1)] ds 2 internal energy contour dependent (Kass et al 1988) external energy image dependent (GGVF Xu&Price 1988) distance energy neighbour dependent (us ) CLG-3D optical flow energy time dependent ++ multi-grid (Bruhn et al. 2003/2005) ++ subjective surfaces (Sarti et al 2000)

25 vvv COS-7 cell with fusion protein EB3-GFP (end binding protein) at growing microtube tips (cito skeleton)

26 vvv - Speed of growing microtube tips, correlation with ER dynamics with cytoskeleton,

27 number vvv OF for fronts, blebs, tips, OF-fields determine motion, velocities, and improve object tracking Biology Front Model Growing microtube tips, EB3-GFP (end binding protein) Bleb Microtube Tips N = mean vel = [nm/s] sd = 56,68 [nm/s] se = 0,28 [nm/s] velocity [nm/s]

28 vvv Optical Flow (OF) I(x,y,t) = I(x+ x, y+ y, t+ t) OF vector field v = [u,v] meets I x u + I y v + I t = JJ Gibson, psychologist, The Perception of the Visual World 1981 Horn and Schunck (HS) apparent velocities of movement of brightness patterns in images two basic assumptions: gray value constancy and smooth flow of the intensity values between two images Bruhn et al Combined Local Global Methods (CLG) generalize global HS and local Lucas and Kanade (LK, 1981) approaches

29 vvv OF - equations

30 vvv OF vector fields 1 pixel jump 3 pj 6 pj 12 pj 20 pj Lukas - Kanade, LK Horn - Schunck, HS Combined Global Local, CLG

31 flow prediction vvv OF prediction LK-HS-CLG Lukas Kanade, LK ground trouth LK HS CLG Horn - Schunck, HS Combined Global Local, CLG pixel jump UUUps, only small jumps, max 6 pixels!!! -> but Nyquist in time 2012 Machine Vision and Applications

32 vvv Multi Scale Optical Flow Scale 0 ti+1 Gaussian Pyramid ti... OF (0) + Scale 1 ti ti+1 OF(N-1) ti+1 ti+1 OF(N-1) OF(N-1) OF(N-1) Scale 2... ti ti+1 v OF(N-1) warping w ti ti+1 Scale N OF(N)

33 vvv OF vector fields 1 pixel jump 3 pj 6 pj 12 pj 20 pj Lukas - Kanade, LK Multi-Scale HS (4) Horn - Schunck, HS Multi-Scale CLG (4) Combined Global Local, CLG

34 flow prediction vvv OF prediction LK-HS-CLG-MS Lukas Kanade, LK Horn - Schunck, HS Combined Global Local, CLG ground trouth LK HS CLG HS MS(4) CLG MS(4) Multi-Scale 4 HS MS(4) 5 Multi-Scale 4 CLG MS(4) pixel jump

35 vvv... Image Processing Online, IPOL publishes image processing algorithms as precise and comprehensive as possible. The publication of each algorithm includes: - detailed description, bibliography, commented examples and a failure case analysis - on line demo site for testing of user data - downloadable program in C or C++ - discussion forum on the algorithm

36 vvv... Image Processing Online: Combined Local Global Optical Flow Jara J, Delpiano J, and S Härtel IPOL-LA, Montevideo, Uruguay, in revision Performance of optical flow techniques for motion analysis of fluorescent point signals in confocal microscopy Delpiano J, Jara J, Scheer J, Ramírez O, Ruiz-del-Solar J and S Härtel Machine Vision and Applications, Volume 23, Issue 4, pp: Nicolas LIMARE: Reproducible Research in Computational Sciences Montevideo 04 o 05 de Abril Details will appear very soon on and Thanks for the promotion.

37 distancia costo ignorancia factor 2-3 : 1 400? numero vecino

38 Espermiograma a Distancia Implementación Clínica de Espermiogramas Digitales Potenciando isalud en América Latina

39 Problema Escenario Actual Infertilidad es un problema creciente que afecta el 15% de las parejas. En Chile, ~6000 parejas generan una demanda de ~8.000 espermiogramas por año. Espermiograma mide parámetros claves de una muestra seminal y determina el tratamiento clínico de la pareja. Existe falta de estandarización, precisión y objetividad analisis visual induce errores importantes con implicancias (graves) para el tratamiento de la pareja.

40 Problema Esperiograma Convencional

41 Problema Esperiograma Convencional

42 CEDAI Esperiograma por Internet

43 Solución CED AI SAAS Software As A Service, menor costo ( 10 MM CLP ) manejo simple soporte y respaldo almacenamiento en cloud

44 Solución CED AI SAAS Software As A Service, Concentración Movilidad Células Redondas Vitalidad 3-4 Imágenes Fragmentación ADN 3-4 Imágenes

45 Metodología Movilidad

46 Metodología Movilidad

47 Metodología Movilidad N t t y y x x VCL final t i i i i i i i _ ) ( ) ( Velocidad curvilínea 0 _ 2 0 _ 2 0 _ ) ( ) ( t t y y x x VSL final t final t final t Velocidad lineal N t t Ys Ys Xs Xs VAP final t i i i i i i i _ ) ( ) ( Velocidad promedio

48 Metodología Movilidad y Concentración. Objetivo 10x ph1, 650,138 x 483,436µm

49 Metodología Movilidad y Concentración. Identificación de cabezas por tamaño.

50 Metodología Movilidad y Concentración. Identificación de colas de espermatozoides

51 Metodología Movilidad y Concentración. Identificación de cabezas de espermatozoides con colas.

52 Comparación CASA versus ED AI CASA CED AI total=68 total=57 Cabezas sin cola: 11 Espermatozoides no encontrados: 4 2 2

53 Concentracion [10E6]/ml] Verificación / Calibración Concentración: Cuantificación de espermatozoides sólo con colas Ob 1 Ob 2 Ob 3 EDAI 1 EDAI 2 EDAI Muestra Debido al conteo de un mayor número de objetos en el análisis digital los valores son más cercanos al valor real. SE = 10.5 % (Expertos) contra SE = 8 % (ED AI)

54 movilidad [%] Verificación / Calibración Movilidad Movilidad (%) 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Observador 1 Tipo A Movilidad Tipo A Observador 2 Observador 3 ED-AI 1 ED-AI 2 ED-AI Número de numero la muestra de No existen diferencias significativas entre expertos y el método digital.

55 Inmovil [%] Progresivos (PR) [%] No Progresivos [%] Verificación / Calibración Movilidad Ob1 Ob2 Ob3 EDAI 1 EDAI 2 EDAI Ob1 Ob2 Ob3 EDAI 1 EDAI 2 EDAI Ob1 Ob2 Ob3 Muestra EDAI 1 EDAI 2 EDAI Muestra Método digital produce resultados sin diferencias estadisticas a los resultados de los tres expertos Ventajas: mayor N <-> menor SE [%] ~ N Muestra

56 Comparación CASA versus ED AI CASA ED AI Intersección de trayectorias: - Error de Fusión y Fisión Colisión con detritus celular: - Error de velocidad

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59 Validación ED AI con expertos nacionales Muestras Manual Expertos Luis Sarabia (U-Chile) Marcia Madariaga (IDIMI) Adolfo Acosta (Clínica Las Condes) Digital ED AI Espermiogramas Asistidos por Internet (CED AI, U-Chile) Movilidad (OMS 2010) Grupos: Progresivo No progresivo Inmóvil Concentración millones/ml Recuento de células redondas millones/ml Vitalidad % en base de >400 espermios Fragmentación ADN % en base de >400 espermios

60 Vitalidad - integridad de la mitocondria espermática - integridad del ADN espermático - integridad de membrana espermática - SYBR-14 / IP LIVE / DEAD Sperm Viability Kit - Eosina Y / Nigrosina (al frotis) (OMS) - Eosina Y (al fresco) - Eosina Y (al frotis)

61 Vitalidad Eosina Y (al fresco) campo claro (OMS) objetos tamaños colas objetos de un tamaño definido con cola

62 Vitalidad rojicidad Rojicidad : R/G o R/B

63 Vitalidad rojicidad R/G:

64 Vitalidad plano focal Eosina Y (al fresco) Eosina Y (al frotis)

65 Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios refringentes (muertos) familia de espermios no refringentes (vivos)

66 Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios refringentes (muertos) familia de espermios no refringentes (vivos)

67 espermios vivos experto frotis (%) espermios vivos experto frotis (%) espermios vivos CED AI (%) Vitalidad fresco vs frotis vs CEDAI Linear Fit of Data7_MANUAL Upper 95% Confidence Limit Lower 95% Confidence Limit espermios vivos experto fresco (%) Linear Fit of Data2_MANUAL Upper 95% Confidence Limit Lower 95% Confidence Limit

68 Fragmentación del ADN - determiado por: - TUNEL (terminal deoxinucleotide transferase dutp nick end labeling) FITC/IP via fluorescencia - SCSA (sperm chromatine structure assay) via fluorescencia - COMET (single cell gel electrophoresis) via fluorescencia - SCD (sperm chromatine dispersion) -> Halosperm -> en casa Fernandez et al 2003 J Andrology

69 Fragmentación del ADN Fabrizzio Horta: Validación de la metodología de dispersión de la cromatina para cuantificar daño en el DNA espermático en pacientes que consultan por infertilidad. Tutora: Dra. Rosita Smith. Horta F, Madariaga M, Garcia A, Härtel S & Smith R 2011 Association of age with sperm DNA fragmentation Aumento del daño en el DNA espermatico en varones mayores de 40 años. Revista Médica de Chile, 139: > publications El ensayo SCD permite medir la fragmentación del ADN espermático de manera sencilla, costo efectiva, rápida y con instrumentos de laboratorio de fácil acceso.

70 ADN intacto / con HALO (%) ADN intacto / con HALO (%) Fragmentación del ADN 100 CED AI 20x Experts m1 m2 m3 m4 m5 m6 m CED AI 10x Expert m1 m3 m8

71 Calibración Morfología Expertos Internacionales vía www

72 Resumen CED AI vs CASAs CED AI SCA Barcelona, Esp SAS Hamilton, USA SVP Minitüb, Ger CASA medealab, Ger Costo Instalación Concentración / Motilidad $ $$$ $$$ $$$ $$$ Vitalidad + (+) fluorescencia (+) fluorescencia - (+) fluorescencia Fragmentación ADN + (+) Halo-Kit (+) fluorescencia - (+) fluorescencia Acceso Online + servicio de analisis Reporte Automatico (+) analisis remoto sin servicio Cloud-Storage

73 Equipo Expertos CED AI está en fase piloto con Instituciones que abarcan ~30 % del volumen nacional Unidad de Medicina Reproductiva Instituto de Investigaciones Materno-Infantil J. Crosby Laboratorio de Espermiograma R. Smith L. Sarabia

74 EQUIPO Medicina Telecomunicación Imágenes Alejandra García Dr. Steffen Härtel Tecnóloga Médica Coordinadora de CED AI Rodrigo Rojas Director del Laboratorio de Procesamiento de Imágenes Científicas Investigador Principal Fondecyt/Fondef/Instituto Milenio Ing. Civil Informàtico Fundador de Xperts Ltda.

75 EQUIPO Medicina Telecomunicación Imágenes Susana Vargas López Tecnólogo Médico, Magister en Biofísica Médica, U-Chile. - Motilidad y Vitalidad Martín Pinuer Administrador Contable CEDAI SpA Victor Castañeda Zeman Ingeniero Civil Eléctrico, Universidad de Chile / PhD. Ciencias de la Computación, TU München, Alemania. - Morfología Violeta Chang Camacho Ingeniero Civil Informático, Universidad Nacional de Trujillo, Perú. - Morfología Fabrizzio Horta Tecnologo Medico, U-Chile Carolina Figueroa Amenábar UMReproductiva Clínica Las Condes Licenciado en Biología, Universidad de Chile. - Fragmentación ADN espermático

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77 vvv Premios Iberoamericanos a la Innovación y el Emprendimiento, 15 de noviembre 2012

78 vvv

79 vvv Homo faber, locución latina que significa "el hombre que hace". Contraposición a homo sapiens, la denominación biológica de la especie humana, que significa "el hombre que sabe". Contraposición a homo ludens, el hombre que juega.

80 Factor de Población Modelo Negocio Internacional y nuevos mercados 25 Licenciamiento Nuevos Nichos: 5 0 Chile Arg/Uru Peru Col Mexico Brazil EEUU - Equino - Porcino - Bovino - Muchas Gracias!

81 Proyecto D11I1096 I+D precompetitivo CENTRO DE PATOLOGÍA DIGITAL ASISTIDA POR INTERNET XIX Concurso de Proyectos FONDEF de I+D 2011

82 (a) (b)

83 problema La biopsia es el examen de una muestra de tejido que entrega un diagnóstico clave para muchas enfermedades graves o frecuentes. Ejemplos importantes son linfomas y leucemias, patologías orales o el carcinoma mamario. Aunque el desarrollo de nuevos procedimientos, tratamientos y técnicas ha generado grandes avances en los exámenes de biopsias, en Chile y Latinoamérica existen importantes limitaciones debido a: - falta de recursos para efectuar estudios complementarios. microscopios, reactivos para fluorescencia, geografía compleja - falta de herramientas para realizar análisis cuantitativo. programas analíticos, digitalización de muestras - falta de acceso a tecnología para realizar interconsultas. servicios que conecten datos para interconsulta por Internet

84 problema

85 estado del arte En EEUU y Europa, existen empresas e iniciativas en la interfase I&D que ofrecen equipos y sistemas para la digitalización de biopsias y su posterior distribución por Internet: Los servicios incluyen escaneo en campo claro y fluorescencia, almacenamiento, herramientas de cuantificación, generación de repositorios, elementos educativos, posibilidad de interconsulta. En Chile y Latinoamérica el examen de biopsias se realiza en forma visual (semicuantitativo) con variabilidades intra- e inter-observador, sin acceso a herramientas de cuantificación o posibilidad de interconsulta. El envío de material histológico para una interconsulta o una segunda opinión es lenta, costoso sin alternativas digitales atractivas. El desarrollo de herramientas de cuantificación morfo-topológica de biopsias presenta un campo muy dinámico en el ámbito del procesamiento de imágenes.

86 oportunidad La oportunidad consiste en la creación de un Centro de Patología Digital Asistida por Internet (CPD), apuntando a la generación de un nuevo servicio tele médico tele analítico que garantice el más alto nivel de interconsulta y análisis cuantitativo para el diagnóstico de patologías en los centros solicitantes, independiente de su localización geográfica. La constitución del CPD depende de la investigación, desarrollo y aplicación de rutinas matemáticas en el campo de análisis de imágenes a gran escala, que cuantifican por primera vez fenómenos morfo-topológicos con el propósito de precisar diagnósticos con implicancias pronosticas y terapéuticas en la región. El CPD fomenta la investigación, desarrollo y aplicación de rutinas de tele-comunicación y tele-interconsulta por internet en el campo del manejo, anotación y distribución de imágenes microscópicas, ofreciendo el primer servicio de vanguardia a hospitales, clínicas y centros privados que componen el creciente mercado de patología a distancia dentro de Latinoamérica.

87 CPD Patología Asistida por Internet

88 metodología I&D I&D evolutivo para plataforma de tele-interconsulta. Desarrollo de Plataforma Software Cuantificación linfocitos en regiones focales en patología oral. Desarrollo y validación clínica de algoritmos imagenológicos con técnicas HE. Cuantificación receptor de estrógeno en tejido mamario humano. Desarrollo y validación clínica de algoritmos imagenológicos con técnicas IHQ. Cuantificación expresión de Cerb2 (IHQ) en tejido mamario. Desarrollo y validación clínica de algoritmos imagenológicos con técnicas IHQ. Cuantificación gránulos en tejido renal. Desarrollo y validación clínica de algoritmos imagenológicos con técnicas IF.

89 usuarios y beneficiarios Los principales usuarios son patólogos de Centros Médicos (públicos y privados). Los beneficiarios son pacientes que requieren diagnósticos certeros a través de biopsias. Biopsias en Chile son exámenes de alta demanda, anualmente el SAP-HCUCH registra biopsias con Hematoxilina-Eosina (HE), casos requieren al menos un estudio inmunohistoquímico (IHQ). el Hospital Barros Luco-Trudeau efectúa alrededor de biopsias con HE, requieren IHQ. la Clínica Las Condes efectúa alrededor de biopsias con HE, requieren IHQ. Por otro lado, existe un campo adicional en Facultades de Salud y Biología de diversas Universidades y Colegios que requieren material digital de calidad para clases de anatomía, histología y especialidad médica. Los beneficiarios son académicos, estudiantes, profesores y alumnos.

90 rol de empresas y entidades asociadas Reúne expertise e infraestructura en microscopía y procesamiento de imágenes únicos en Chile. Interés en desarrollar temas de ciencia e I&D en CPD. Empresa Telecomunicaciones y Software. Interés en diseñar e implementar la plataforma de gestión, almacenamiento y consulta en el campo de la microscopía virtual. Empresa Consultora en e-salud. Interés en implementar y desarrollar su plataforma de software en los servidores de CPD para teleinterconsulta y segunda opinión en histopatología. Servicio Anatomía Patológica, Hospital Clínico, U-Chile. Interés en ejecutar la fase piloto de CPD y participar en la integración de los algoritmos y servicios de vanguardia en la práctica clínica. Servicio Anatomía Patológica Oral, Facultad Odontología, U-Chile. Recibe biopsias orales de todo Chile. Interés en contribuir y beneficiarse de los algoritmos y servicios de vanguardia generados. TIGA-Center, BIOQUANT, U-Heidelberg. Líder mundial en imagenología de tejidos. Desarrolla plataforma bioinformática dedicada al estudio cuantitativo y modelamiento de tejidos con relevancia clínica. Interés en colaborar y potenciarse en el desarrollo de algoritmos versátiles.

91 equipo Dr. Steffen Härtel, Director, Jefe de SCIAN-Lab, científico con Fondecyt, Aniillo, Núcleo y Instituto Milenio, DAAD, DFG, Director Académico del Programa de Informática Médica en conjunto con la U-Heidelberg, Director de FONDEF D07I1019 y socio de spinoff CEDAI SpA. Dra. Eugenia Díaz, Subdirectora, Académico de Histología de la F-Med U-Chile. Línea de investigación en aspectos histológicos, citoarquitectónicos e inmunohistoquímicos de la habénula humana. Directora científica cursos de extensión para el Magisterio. Paula Segura: Médico Cirujano, Anátomo Patólogo del HCUCH, con entrenamiento especializado en patología renal. Ha participado en proyectos de investigación clínica y clínica básica. Gonzalo Rojas: Cirujano-Dentista, Magister Patología Oral y Diplomado Medicina Oral. Jefe Servicio Anatomía Patológica Oral. Investigador asistente en Fondecyt. Alejandra García: Tecnólogo Médico. Experiencia en técnicas de microscopía óptica, fluorescencia y procesamiento de imágenes. Gestión de actividades I&D de proyecto FONDEF D07I1019. Jan Scheer: Ingeniero Biomédico. Tesis en sistemas de salud en el Tissue Imaging and Analysis (TIGA) Center bajo la tutela de Dr. Niels Grabe. Roberto Pino, NOVOS, Incubadora de Negocios, U-Chile. Experiencia en desarrollo de negocios de base tecnológica y en diseño de modelos de negocios que faciliten la explotación comercial de los resultados de investigación y desarrollo.

92 morfology topology lots work muchas of ahead gracias