Validación Clínica sistema CEDAI: Centro de Espermiogramas Asistidos por Internet

Transcripción

1 Validación Clínica sistema CEDAI: Centro de Espermiogramas Asistidos por Internet Alejandra García. MSc, Carolina Figueroa, Fabrizzio Horta. MClinEmb, Susana Vargas. MC, Victor Castañeda. PhD y Steffen Härtel. PhD Proyecto 14SSAF Innova-CORFO

2 Introducción Infertilidad problema creciente de salud pública mundial, afecta alrededor del 15% de las parejas (Program for Appropriate Technology in Health, 2002). En Chile, ~6000 parejas consultan por infertilidad al año. Espermiograma provee información fundamental para definir la severidad del factor masculino que determina la estrategia del tratamiento clínico de la pareja. Existen grandes diferencias entre laboratorios, debido a: - subjetividad, - falta de estandarización, - falta de controles de calidad, - falta de entrenamiento profesional.

3 Propuesta CED AI Centro de Espermiogramas Digitales Asistidos por Internet, UChile Optimizar, estandarizar y validar espermiogramas en relación a la concentración, movilidad, vitalidad, morfología estricta y fragmentación del ADN de los espermatozoides. Mediante la integración de biomarcadores de funciones espermáticas, imágenes microscópicas digitales, herramientas matemáticas para el análisis de imágenes, y telecomunicación vía Internet,

4 Espermiograma Manual Muestras Análisis Visual Normal Anormales Concentración Movilidad Recuento de Células Redondas Vitalidad Diferenciación Células Redondas Morfología Estricta Kruger Fragmentación ADN

5 Espermiograma Digital Muestras Análisis Digital vía Internet Normal Anormales Concentración Movilidad Recuento de Células Redondas Vitalidad Morfología Estricta Kruger Diferenciación Células Redondas Fragmentación ADN

6 Solución CED AI SAAS Software As A Service, menor costo manejo simple soporte y respaldo almacenamiento en cloud

7 Solución CED AI SAAS Software As A Service, Concentración Movilidad Células Redondas Vitalidad 3-4 Imágenes Fragmentación ADN 3-4 Imágenes

8 Computer aided sperm analysis (CASA) - Desde Por que CASA? - Precision y confiabilidad - Facil de realizar - Resultados reproducibles y consistentes - Disminución de variabilidad entre laboratorios Microptic SCA 6, España Hamilton Thorne CASA-II, USA

9 Computer aided sperm analysis (CASA) - Éxito en la medición de características seminales en laboratorios de producción de animales domesticados y toxicología reproductiva - Excelentes resultados en análisis de separaciones espermáticas Pobre resultados en semen humano: Agregaciones espermáticas Alta presencia de debris de fondo Alto costo en Vitalidad (Fluoroforos) Morfología espermática solo en cabeza Microptic SCA 6, España No existen sistema CASA validados para la evaluación clínica automatizada del espermiograma Hamilton Thorne CASA-II, USA

10 Espermiograma Digital Muestras Análisis Digital vía Internet Normal Anormales Concentración Vitalidad Morfología Estricta Kruger Fragmentación ADN Captura de Motilidad Recuento de Células Redondas Diferenciación Células Redondas imágenes Muestra seminal + Eosina Y 1:1 Laminas Teñidas Morfología Kruger Laminas HALOSPERM

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12 Validación ED AI con expertos nacionales Muestras Manual Expertos Luis Sarabia (U-Chile) Marcia Madariaga (IDIMI) Adolfo Acosta (Clínica Las Condes) Digital ED AI Espermiogramas Asistidos por Internet (CED AI, U-Chile) Movilidad (OMS 2010) Grupos: Progresivo No progresivo Inmóvil Concentración millones/ml Recuento de células redondas millones/ml Vitalidad % en base de >400 espermios Fragmentación ADN % en base de >400 espermios

13 Variabilidad entre laboratorios Concentración Motilidad 41% 55,5% Coeficiente de variación interobservador Rango del coeficiente de 2,8% - 57% 3,5% - 51,2% variación intra- observador Auger., et al (2000), Human Reproduction; 15 (11), Jørgensen., et al (2001), Human Reproduction; 16 (5), Leushuis., et al (2010), Fertil Steril;94(7):2631-5

14 Motilidad (al fresco contraste fases) Movilidad y Concentración Espermáticas Recuento de Células Redondas

15 Vitalidad Eosina Y (al fresco) campo claro (OMS) objetos tamaños colas objetos de un tamaño definido con cola

16 Vitalidad rojicidad Rojicidad : R/G o R/B

17 Vitalidad rojicidad R/G:

18 Vitalidad plano focal Eosina Y (al fresco) Eosina Y (al frotis)

19 Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios refringentes (muertos) familia de espermios no refringentes (vivos)

20 Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios no refringentes (vivos)

21 Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios refringentes (muertos) familia de espermios no refringentes (vivos)

22 Vitalidad Eosina Y (al frotis) familia de espermios refringentes (muertos) familia de espermios no refringentes (vivos)

23 Espermiograma Digital Muestras Análisis Digital vía Internet Normal Anormales Concentración Vitalidad Morfología Estricta Kruger Fragmentación ADN Captura de Motilidad Recuento de Células Redondas Diferenciación Células Redondas imágenes Muestra seminal + Eosina Y 1:1 Laminas Teñidas Morfología Kruger Laminas HALOSPERM

24 Calibración Motilidad

25 Método Manual Movilidad y Concentración Espermática Recuento de Células Redondas Carga de Muestra en cámara de recuento Lectura Movilidad (OMS 1999): al menos 200 espermatozoides son clasificados (SE=14rcto = 7.1%) en los Grupos A, B, C o D ; contar solamente espermatozoides completos, es decir, con cabeza y cola. Concentración [millones/ml], contar al menos 200 espermatozoides Recuento de células redondas [millones/ml]: Células germinales y/o leucocitos

26 Validación 20 Muestras Manual Expertos Luis Sarabia (U-Chile) Marcia Madariaga (IDIMI) Adolfo Acosta (Clínica Las Condes) Digital ED AI Espermiogramas Asistidos por Internet (SCIAN-Lab, U-Chile) Movilidad (OMS 1999) Grupos: A, B, C, D Concentración millones/ml Recuento de células redondas millones/ml

27 Metodología Movilidad - Video

28 Metodología Movilidad

29 Metodología Movilidad N t t y y x x VCL final t i i i i i i i _ ) ( ) ( Velocidad curvilínea 0 _ 2 0 _ 2 0 _ ) ( ) ( t t y y x x VSL final t final t final t Velocidad lineal N t t Ys Ys Xs Xs VAP final t i i i i i i i _ ) ( ) ( Velocidad promedio

30 Metodología Movilidad Diferentes sistemas digitales utilizan diferentes algoritmos matemáticos para: - identificar espermatozoides, - perseguir trayectorias, - calcular movilidad.

31 Metodología Movilidad y Concentración. Objetivo 10x ph1, 650,138 x 483,436µm

32 Metodología Movilidad y Concentración.. Identificación de cabezas por tamaño (4 a 15 pixeles).

33 Metodología Movilidad y Concentración. Cluster de Colas Identificación de colas de espermatozoides

34 Metodología Movilidad y Concentración. Cluster de Colas BorderDivCenterPix Para separar estructuras redondeadas

35 Metodología Movilidad y Concentración. Cluster de Colas Identificación de colas de espermatozoides

36 Metodología Movilidad y Concentración. Cluster de Cabezas c/ Colas Identificación de cabezas de espermatozoides con colas.

37 Concentracion [10E6]/ml] Verificación / Estandarización Concentración: Cuantificación de espermatozoides con cola Ob 1 Ob 2 Ob 3 EDAI 1 EDAI 2 EDAI Muestra Debido al conteo de un mayor número de objetos en el análisis digital los valores son más cercanos al valor real. SE = 10.5 % (Expertos) contra SE = 8 % (ED AI)

38 Calibración Motilidad

39 Comparación SCA versus ED AI CASA CED AI total=68 total=57 Cabezas sin cola: 11 2 Espermatozoides no encontrados: 4 2 Sobreestimación de la concentración y motilidad

40 Comparación SCA versus ED AI CASA CEDAI Intersección de trayectorias: - Error de Fusión y Fisión Colisión con detritus celular: - Error de velocidad

41 Vitalidad Eosina Y (al frotis) Familia de espermios refringentes (muertos) Familia de espermios no refringentes (vivos)

42 Vitalidad Eosina Y (al frotis) Familia de espermios refringentes (muertos) Familia de espermios no refringentes (vivos)

43 Fragmentación del ADN espermático Imagen Raw

44 Segmentación del Halo Detección de Cabezas

45 Generación del Halo

46 Clasificación Halos

47 Morfología Identificación de zona de cabezas por color (K-Means) Eliminación según tamaño y forma Detección de orientación de espermatozoides Crecimiento de máscara y relleno de cabeza Eliminación según tamaño y forma Después de Clustering Mascara de detección Después de separación por color Máscara resultante Segmentación de cabeza Filtro por umbralización Eliminación de bordes Acrosoma Detección de Orientación Núcleo Crecimiento de máscara Segmentación final Segmentación final Objetivo 63x / 0,63x, 163,028 x 121,226 µm

48 Morfología

49 Proyecto 14SSAF Innova-CORFO Validación Clínica sistema CEDAI: Centro de Espermiogramas Asistidos por Internet en el Laboratorio de Andrología de Clínica Las Condes

50 Hipótesis La utilización del sistema CEDAI para la realización de espermiogramas digitales, presenta resultados preliminares altamente correlacionados con los valores entregados por personal de laboratorio de Clínica las Condes, eliminando la subjetividad y error de operador. OBJETIVO GENERAL Evaluar el análisis del espermiograma digital, conjuntamente con el Laboratorio de Andrología de Clínica Las Condes.

51 Metodología

52 Análisis de los resultados Bland Altman:grafica la diferencia entre 2 ensayos Coeficiente Krippendorff-alpha: mide grado de concordancia entre 2 variables Coeficiente de spearman: Coeficiente correlación para muestras no paramétricas

53 Resultados

54 Concentración espermática 54

55 Concentración espermática Obtención de muestras 95 pacientes firmaron consentimiento informado 11 muestras diluidas (concentración alta). 7 pacientes oligozoospermico severos 2 pacientes con azoospermia 19 muestras con concentración superior a 100 [millón/ml] según experto.

56 Concentración espermática K-alpha= 0,92 Casi perfecta concordancia

57 Concentración espermática < 100 [millones/ml] 76 muestras < 15 [millones/ml] 21 muestras K-alpha= 0,93 Casi perfecta concordancia K-alpha= 0,95 Casi perfecta concordancia

58 Motilidad Progresiva 58

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60 Motilidad Progresiva Obtención de muestras 95 pacientes firmaron consentimiento informado 11 muestras diluidas (concentración alta). 7 pacientes oligo severos

61 % CEDAI Motilidad Progresiva Coef. Spearman: y = 1,1496x - 5,9546 R² = 0,7203 K-alpha= 0,78 Fuerte concordancia % Experto

62 Motilidad Progresiva <32% 32% K-alpha= 0,9 Casi perfecta concordancia K-alpha= 0,68 Fuerte concordancia % %

63 Conclusión Concentración espermática - Existe una alta correlación y concordancia casi perfecta entre el análisis del experto y CEDAI. Motilidad - Existe una fuerte concordancia entre el análisis del experto y CEDAI tanto en motilidad progresiva 32% como <32%.

64 Vitalidad espermática 64

65 Vitalidad espermática Obtención de muestras 95 pacientes firmaron consentimiento informado 11 muestras diluidas (concentración alta). 9 pacientes fueron oligozoospermicos severo o azoospermicos, a los cuales no se les realizó análisis digital.

66 Vitalidad espermática K-alpha= 0,38 Aceptable concordancia

67 Vitalidad espermática Grafica Bland-Altman Promedio Promedio Diferencia: 3.05 Desviación Estándar : 9.25 = 82% = 79%

68 Conclusión Vitalidad - No es posible realizar un análisis de correlación, debido a la distribución de los datos. - Concordancia aceptable entre Experto y CEDAI - Solo 2 pacientes bajo el criterio OMS 2010 (58% según Experto). - Diferencia Promedio entre expertos y CEDAI es de 3.04.

69 Conclusión Vitalidad - Dificultad en el análisis de vitalidad en pacientes oligozoospermicos (< 15mill/ml), especialmente en casos severos (<5mill/ml). - 9 muestras no pudieron ser procesadas por bajo recuento - Se requiere ampliar el estudio, en el cual la vitalidad se distribuya en un amplio rango (Bajo y sobre 58%)

70 Fragmentación del ADN espermático 88 muestras totales

71 Fragmentación del ADN espermático Obtención de muestras 88 muestras entraron al estudio. Halo Sperm Kit

72 Fragmentación del ADN espermático K-alpha= 0,64 Fuerte concordancia

73 Fragmentación del ADN espermático Grafica Bland-Altman Promedio Diferencia Promedio: Desviación Estándar : = 14% = 17%

74 Conclusión Fragmentación - Existe una fuerte concordancia entre análisis por CEDAI y Expertos. - Diferencias entre en expertos y CEDAI es de -2.98,y una SD de 4.34

75 Resumen conclusiones estudio Concordancia entre el análisis del experto y CEDAI: o Concentración espermática: casi perfecta o Motilidad: casi perfecta <32%, y fuerte 32% o Vitalidad: aceptable o Fragmentación del ADN espermático: Fuerte concordancia Concentración Casi perfecta Motilidad Casi perfecta 32% Fuerte > 32% Vitalidad Fragmentation del ADN Aceptable Fuerte concordancia

76 Conclusiones A [100 millón/ml] CEDAI tendría una mayor precision debido a que cuantifica un mayor número de eventos, por lo tanto, el error es más bajo (SD/ n). Sería de gran utilidad optimizar el sistema con diferentes cámaras de recuento, ya que existen diferencias en recomendación (WHO) y características entre ellas (2X-CEL, Cell- VU) La toma de imágenes es un proceso más rápido para parámetros de concentración, motilidad y fragmentación ADN. La captura correcta de imágenes es fundamental para la obtención de resultados apropiados. Se necesita una persona capacitada para tomar imágenes y análisis seminal Los algoritmos para morfología se encuentran optimización (Chang., et al 2014, 2015).

77 Equipo Alejandra García MSc Tecnólogo Médico MSc en Reproducción Dip. Admistración Empresas Gerente General Fabrizzio Horta MSc Tecnólogo Médico MSc en Embriología Clínica y Andrología Asesor científico Susana Vargas MSc Andrea Rodriguez MSc Bióloga M.Cs en Reproducción Humana Validación Clínica Marcia Madariaga Tecnólogo Médico 20 años de experiencia en Andrología Victor Castañeda PhD Ingeniero Eléctrico. Subdirección Sistema Informática Responsable Red Alta Velocidad Tecnólogo Médico MSc en Biofísica Médica Espermiograma convencional Procesamiento de imágenes y algoritmos Steffen Härtel PhD Biofísico Investigador FONDECYT/MILENIO/FONDEF Director CIMyT Asesor I&D

78 Muchas» todos