Conceptos y Técnicas de Biotecnología I, CTBT VACUNAS
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- Lorenzo Vázquez Alarcón
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1 Conceptos y Técnicas de Biotecnología I, CTBT VACUNAS SANDRA RUZAL Departamento de Química Biológica FCEN-UBA IQUIBICEN-CONICET sandra@qb.fcen.uba.ar 1
2 Vacuna Estímulo antigénico capaz de inducir una respuesta inmune adaptativa que puede ser recordada cuando se adquiere la infección natural. 2
3 VACUNAS origen siglo XVIII, exposición voluntaria a agente infeccioso era beneficiosa. Generaba Protección a reinfección Inmunidad: respuesta del sistema inmunológico especificidad y memoria inmunológica Edward Jenner (médico británico) inventó en 1796 la primera vacuna contra la viruela. inyecto a un niño de 8 años el contenido de una pústula del brazo de una ordeñadora (contagiada x VACA) a través de dos cortes superficiales en el brazo, consiguiendo inmunizar al niño ante la viruela humana. 3
4 Aparición principales vacunas de uso humano: : Vacunación contra la viruela : Vacuna contra la rabia Pasteur µorg atenuados : Toxoide diftérico, Toxoide tetánico y tos combulsa : Vacuna contra la fiebre amarilla : Vacuna contra influenza : Vacuna inactivada contra virus polio : Vacuna viva atenuada contra virus polio : Vacuna contra el sarampión : Vacuna contra la rubeóla : Vacuna contra hepatitis B subunidades : Viruela erradicada : Primera vacuna recombinante (hepatitis B) : Vacuna contra H. influenzae B conjugada cultivo celular y desarrollo de virus humanos fuera del organismo vivo Edad de oro 4
5 Hitos en descubrimiento de antigenos. La finalización de la primera secuencia del genoma bacteriano en 1995 sentó las bases para una nueva era de desarrollo de una vacuna basada en la información genómica. Genome- and proteome-wide screening strategies for antigen discovery and immunogen design Biotechnology Advances, Volume 32, Issue 2, 2014,
6 esperanza media de vida al nacer en el mundo es de 69 años en las mujeres y 65 años en los varones. Vacunas A excepción del agua limpia, ningún otro factor, ni siquiera los antibióticos, ha ejercido un efecto tan importante en la reducción de la mortalidad... Nivel más bajo de mortalidad de niños menores de 5 años. 6
7 Incidencia pre- y post- vacunación 7
8 Nuevas vacunas que protegeran contra tres organismos: el neumococo, el rotavirus y el VPH. Las vacunas evitan más de 2,5 millones de muertes de niños al año. Las nuevas vacunas disponibles podrían evitar otros dos millones de muertes al año entre niños menores de cinco años. Aún así, hay 24 millones de niños que quedan sin vacunar: más del 10% de los niños menores de un año de los países en desarrollo no recibieron ni siquiera una dosis de DTP, frente al 2% en los países industrializados En 2000, el costo medio de inmunizar a un niño nacido vivo era de US$ 6 y aumenta hasta US$ 18 en Para 2015 sería de US$ 30 Merece la pena la inversión? Los datos sobre la costo-eficacia de la inmunización muestran que por ejemplo, la erradicación mundial de la viruela, que costó US$ 100 millones a lo largo de 10 años hasta 1977, ha permitido ahorrar US$ 1300 millones al año sólo en costos de tratamiento y prevención 8
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10 Qué son las vacunas Un preparado complejo Formado por microorganismos completos atenuado o inactivado o bien parte o fracción del mismo Capaz de inducir una respuesta inmune Protectora especifica y duradera frente al mismo microorganismo virulento u otros patógenos, previniendo la infección y enfermedad que estos causan Antígeno: molécula Inmunogénica Inmunogénica: molécula capaz de despertar una respuesta en el sistema inmune y producir memoria inmunológica Objetivo: PROTECCIÓN POR PREVENCIÓN más efectivo y menos costoso 10
11 Que características debe tener? - Segura - Evita la enfermedad - Protege a una proporción alta de quienes la reciben - Induce protección duradera - Carece de efectos secundarios - Estable - Bajo costo por dosis 11
12 Tipos de inmunidad ACTIVA Inducción de respuesta Natural Artificial Sí Natural PASIVA Artificial Sueroterapia o Inmunoglobulina No Inicio Tardío Inmediato Duración Larga Transitoria Memoria Sí No 12
13 Respuestas inmunes que confieren protección: Microorganismos extracelulares con una fase en sangre crucial para la patogénesis (viremia o bacteriemia): Respuesta Humoral Microorganismos que ingresan por mucosas: Producción de IgA secretoria neutralizante Microorganismo intracelulares: Respuesta celular y humoral. 13
14 Tejidos y barreras intersticiales para las vacunas y la migración de células dendríticas de los ganglios linfáticos. Mucosa y la piel representan importantes barreras a la vacuna (partícula) la captación y el transporte Engineering vaccines and niches for immune modulation Acta Biomaterialia, Volume 10, Issue 4, 2014,
15 Respuesta primaria 5-10 días Menor Intensidad IgM>IgG expansión clonal de células T y/o B específicas, dan lugar a formación de población de células de memoria. Respuesta secundaria 1-3 días Mayor Intensidad IgG, IgA, IgE Mayor Afinidad de los Ac 15
16 Que tipos de vacunas existen? modificados para que no puedan generar enfermedad Patógenos muertos o inactivados Sólo componentes subunidades Las vacunas inactivadas, de subunidades y las de DNA se consideran seguras, debido a que no involucran la inoculación de microorganismos vivos que pudieran ser peligroso en mujeres embarazadas e individuos inmunocomprometidos o incluso en individuos sanos debido a la posibilidad de reversión a la forma virulenta del microorganismo 16
17 VACUNAS Atenuadas: Microorganismos vivos que multiplican con reducida patogenicidad (infección leve) inmunidad humoral y celular Formas de atenuación de virus: Aislamiento de virus patógenos de una especie pero que no lo son para otra (viruela bovina, rotavirus bovino). Pasajes sucesivos en cultivo celular o en embriones de pollo (sarampión, rubéola) Pasajes en otro hospedador (Sabin se hace en células de mono) Por mutagénesis química o térmica o manipulación por técnicas de ingeniería genética Recombinación entre cepas virales 17
18 Bacillus Calmette Guerin BCG Una gran cantidad de estudios demuestran que NO induce Ac pero sí una respuesta T CD4+ productora de IFN-. También CD8+ y CD1. 18
19 VACUNAS Inactivadas o Muertas: Microorganismos enteros muertos no multiplican tratamientos físicos o químicos eliminan infectividad, manteniendo capacidad inmunogénica Timerosal, mercurial, no muy efectivo, es tóxico, prohibido en humanos. Betapropionolactona, efectiva en bajas concentraciones, alto costo. Bromoetileimida (BEI), cancerígeno. Inmunidad generada es sólo humoral, requieren adyuvantes Ventajas: Son más estables que las vacunas vivas Desventajas: Requiere grandes cantidades del Ag y/o mayor número de dosis, pueden alterar epítopes 19
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21 Vacunas atenuadas: Pasajes sucesivos en hospedadores no naturales dosis inyectada de poliovirus inactivados o muertos Respuesta inmune en la vacunación contra polio vacuna oral poliovirus atenuados 21
22 Subunidades procedimientos de fermentación y purificación que han permitido la producción de vacunas a base de subunidades o antígenos purificadas Pertussis acelular, subcomponentes proteicos purificados, Salmonella typhi, polisacárido capsular Vi, N. meningitidis grupos A y C, polisacáridos capsulares, Streptococcus pneumoniae (23-valente), polisacáridos capsulares, Haemophilus influenzae tipo b conjugada, inmunogenicidad polisacárido incrementada unida a proteína transportadora, N. meningitidis grupos A y C conjugadas Polisacáridos capsulares conjugados con proteínas antigénicas (meningococo, neumococo) TOXOIDES: toxinas inactivadas con formol (tetánica, difterica) 22
23 Vacunas conjugadas 23
24 Ventajas vacunas vivas atenuadas vs. muertos o subunidades? imitan a la infección natural, son baratos de producir y administrar vía oral, menor número de dosis requeridas asemeja in vivo vacunación primaria a secundaria. Desventajas: costos de almacenamiento y conservación, deben mantener a 4 C, riesgo afecte al personal, riesgo potencial que revierta 24
25 BACTERIANAS Vivas Atenuadas Células enteras Inactivadas Células enteras Toxoides Polisacáridos capsulares BCG(*), Anticolérica (oral)(**), Antitifoidea (oral). Antipertussis de células enteras (Pw), Anticolérica (parenteral)(**), Antitifoidea (parenteral). Antitetánica, Antidiftérica. Antimeningocócica A-C, Antineumocócica 23 valente, Polisacáridos capsulares conjugadas Anti Haemophilus influenzae b, Antimeningocócica C, Antineumocócica 7 valente Acelulares Antipertussis acelular (Pa) VÍRICAS Vivas atenuadas Virus enteros Inactivadas Virus enteros Subunidades Antisarampión, Antirrubéola, Antipolio oral (Sabin) Antiparotiditis, Antivaricela, Antifiebre amarilla (**), Antigripal, Antipolio parenteral (Salk), Antirrábica (**), Antihepatitis A, Antiencefalitis centroeuropea (**) Antiencefalitis japonesa (**) Antigripal (virus fraccionado) Antihepatitis B (plasma o recombinación genética) 25
26 Componentes de una vacuna Antígeno: molécula capaz de inducir una respuesta inmune (virus, parte de virus, células infectadas). Adyuvante: Sustancias que potencian la reacción inmune, presentan el antígeno en forma gradual y más eficiente, pero de manera inespecífica. Particulados Sales de Al Emulsiones W/O Liposomas Sales de Ca Micropartículas<10 um Solubles Copolímeros no-iónicos Saponinas Citoquinas Toxinas Vitamina D3 Estabilizantes: Sustancias que confieren protección frente a factores que degradan el antígenos. Diluyente: Soluciones a base de buffers que ajustan la concentración antigénica a la dosis de uso o sirven para la reconstitución de liofilizados. 26
27 Vacunas acelulares, vacunas con toxoides y vacunas conjugadas, son débilmente inmunogénicas Requieren Adyuvantes Potencian la reacción inmune, presentan el antígeno en forma gradual y más eficiente, pero de manera inespecífica, estimulan la producción de citoquinas. 27
28 Inmunógeno Adyuvante Inmunidad Adaptativa (linfocitos) Inmunidad Innata (macrófagos) especificidad Respuesta vacunal intensidad duración orientación 28
29 Combinadas: varias especies Doble bacteriana (dt): difteria + tétanos. Triple bacteriana celular y acelular (DTP/Pa): difteria + tétanos +pertussis. Cuádruple celular y acelular (DTP/Pa + Hib): difteria + tétanos + pertussis + Haemophilus influenzae b. Quíntuple celular y acelular (cuádruple + IPV): DTP/Pa + Hib + poliomelitis inactivada. Quíntuple celular (cuádruple + HB): DTP + Hib + hepatitis B. En vacunas multi-componentes (más de un antígeno) se debe probar que no existe interferencia entre los componentes. Otra interferencia común son los agentes inactivantes de vacunas de virus inactivados cuando se aplican con otras vacunas que poseen antígenos vivos Monovalentes: una única especie un antígeno Polivalentes: única especie de distintos antígenos 29
30 Vías: practicidad + eficacia + inocuidad oral: cebos o agua intranasal: Gotas o aerosoles parenterales: Intradérmica subcutánea intramuscular endovenosa 30
31 PRODUCCIÓN DE VACUNAS Requisitos generales: pura, segura, potente y efectiva Instalaciones adecuadas con personal capacitado GMP (buenas prácticas de manufactura) uniformidad y consistencia Registro del producto y control lote a lote. Factores a considerar: Diseño del producto (tipo de vacuna, modo de producción, eficiencia, control) Registro, Semilla, banco maestro Materias primas, medios y soluciones, calidad del agua, suero y aditivos de origen biológico. Sistemas de cultivo celular, Infección, Cosecha Concentración y/o purificación Inactivación Formulación Envase y acondicionado: Presentaciones Almacenamiento Control de calidad y cadena de frío Presentación ante organismos oficiales 31 Seguimiento de la conformidad del cliente
32 Instalaciones de producción 1) Diseñadas para garantizar la pureza del producto en todas las etapas de producción como también proteger la salud del personal. 2) Fácil limpieza siguiendo normas bioseguridad y contención de patógenos para evitar contaminaciones cruzadas y prevenir la contaminación del personal y los equipos. 3) Cada proceso limitado a un área definida 4) Con adecuada ventilación y aire filtrado, temperatura y suministro de agua.y drenaje 5) vestuarios y otras instalaciones para el personal accesibles sin pasar a través de áreas preparación de productos biológicos. 5) Diseño que evita contaminación ambiental. Material utilizado en producción tiene que hacerse seguro antes de salir de la instalación. 32
33 inoculo semilla biorreactor centrifugación estabilizador liofilizada molienda encapsulado 33
34 Los virus se cultivan tanto en las células primarias, como huevos de gallina embrionados (x ej influenza, rabia, sarampión), Producidas en órganos: Producidas en organismos Cerebro de cordero (rabia), recombinantes: bacterias, Cerebro de ratón (encefalitis levaduras. japonesa) Producidas en cultivos celulares: primarios, secundarios o líneas celulares continuas, tales como cultivos de células humanas (x ej hepatitis A).. 34
35 Disposición ANMAT 705/2005 Requisitos para la inscripción de vacunas. 1. Investigación pre-clínica se prueban pureza y seguridad en animales 2. Estudios clínicos en humanos: Fase I: pequeño grupo de voluntarios que habitan fuera del área endémica. evalúa la seguridad y potencia de la vacuna. Fase II: análisis de la respuesta inmune de los voluntarios. Fase III: son pruebas de campo, se realizan con comunidades que habitan en áreas endémicas. Seguimiento clínico de los individuos vacunados. 3. Período de licencia procedimientos legales y administrativos a partir de los resultados obtenidos en las etapas anteriores para la aprobación (licencia) y registro de la vacuna. 4. Relevamiento post-licencia evalúa la vacuna durante algunos años. Se estudian los cambios en la incidencia de la enfermedad y en la transmisión y se registran los casos de reacciones indeseables. Sólo después de esta etapa se considera o no la inclusión de la vacuna en los planes de vacunación de la región. 35
36 Bondades de una vacuna ideal Precio competitivo. De fácil producción y económica Ser inocua y segura, pocos o ningún efecto adverso. Estabilidad física y genética. Ideal a temperatura ambiente Posible inmunización simultánea contra múltiples componentes protectores de diversos patógenos. Protección de larga duración con 1 sola dosis Vía Oral Disparar una respuesta inmune de memoria. Inducción de inmunidad mucosas en máximo 2 semanas. Estimulación de respuesta inmune humoral y celular a nivel sistémico. 36
37 El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas Problemas i) no todos los agentes infecciosos son fáciles de crecer en las condiciones normales de cultivo ii) el trabajar con los agentes infecciosos requiere de medidas de bioseguridad muy elevadas iii) no todas las enfermedades infecciosas son prevenibles por este tipo de vacunas; iv) los agentes infecciosos usados en la producción de la vacuna pueden estar insuficientemente atenuados o muertos y por lo tanto pueden introducir la virulencia a la vacuna; v) componentes tóxicos de los agentes pueden no estar completamente inactivados y mantener la toxicidad en la vacuna final 37
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39 El papel de la biotecnología en el desarrollo de vacunas Soluciones a) identificar genes de virulencia y por lo tanto facilitar su deleción en los agentes infecciosos creando clones avirulentos pero que mantienen su habilidad de estimular la respuesta inmune; b) crear sistemas vivos no-patogénicos que acarreen los determinantes antigénicos de un patógeno específico o de varios; c) para aquellos agentes de difícil crecimiento, se pueden aislar los genes de las proteínas que contienen los determinantes antigénicos críticos para la inmunidad y expresarlos en otro huésped de mas fácil crecimiento (bacteria o levadura) 39
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41 vacunas recombinantes 41
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44 La vacunología reversa consiste en una búsqueda de secuencias de genoma para la identificación de putativos antígenos proteicos de superficie que podrían utilizarse como candidatos para vacunas 44
45 Genome- and proteome-wide screening strategies for antigen discovery and immunogen design Biotechnology Advances, Volume 32, Issue 2, 2014,
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47 Recombinantes: Se utiliza la manipulación genética para producir alguno de los componentes del patógeno El primer antígeno recombinante comercial para humanos es el de la proteína de la cápside del virus de la hepatitis B (HBsAg). Se produce en Pichia pastori y se purifica con técnicas de precipitación de proteínas y columnas de afinidad con Anticuerpos monoclonales, también el antígeno L1 de HPV 4 subtipos 47
48 Las vacunas recombinantes de tipo subunidad producto del gen expresado en bacteria, es cosechado, purificado y administrado como una vacuna Antígenos recombinantes producidas en bacterias o levaduras, cultivos celulares en plantas. 48
49 VLPs, virus-like particles, tipo-virus Se utilizan las proteínas de la cápside viral que se ensamblan en cubiertas virales vacías (sin ácido nucleico) Segunda generación proteínas L1 (capside mayor) recombinantes forman partículas carentes del genoma viral, y por lo tanto no infectivas Papiloma humano 49
50 Las vacunas recombinantes de gen deletado vacunas con genes deletados asociados con la virulencia o patogenicidad de una bacteria patógeno; 50
51 Las vacunas recombinantes vectoriales consisten de organismos no patogénicos o de gen deletado en el que se inserta un material genético específico de otro patógeno Utilizan virus o bacterias vivos como vectores 51
52 Cumplir normativa sobre ecotoxicidad (Directiva 2001/82/CE y 2001/18/EC -Annex II- ): Estudio de virulencia en situaciones de riesgo en diferentes especies Estudio de posible transmisión horizontal y recombinación potencial del vector vacunal o de parte de él. Estudio de especificidad de especie Estudio de la posible instalación en el ambiente. Método validado para poder distinguir entre vacuna y microorganismo salvaje, especialmente en situaciones de planes de control y erradicación de la enfermedad. Utilización de datos obtenidos de ensayos realizados con el mismo vector pero acompañado de otras secuencias. 52
53 Differentiating Infected From Vaccinated Animals Marker vaccines Se deletean genes no esenciales inmunogénicos permiten diferenciar la respuesta a la vacuna de aquellos de animales infectados Problema: Recombinantes 53
54 Artificial antigen-presenting cells (APCs). Confocal imaging of aapc (green) conjugate formation to CD8+ T cells (red)
55 Vacunas de ADN desnudo: El gen que codifica para el antígeno es introducido en el organismo a ser vacunado y él mismo produce el antígeno a partir de ese gen inyectado directamente en las célula muscular, in vivo, donde luego es traducido y expresado induciendo la respuesta inmune Efecto adyuvante 5 -purina-purina-cgpirimidina-pirimidina-3 > Frecuencia en bacterias Metilados en C vertebrados 55
56 Inmunización intradérmica intramuscular Gene-gun Vacunas ADN son plásmidos altamente purificados producidos en alta cantidad (g/l) liofilizado y luego inyectados codifican para antígenos que se expresan in situ El plásmido se mantiene por un tiempo como episoma en citoplasma. 56
57 Existen beneficios asociados: Existen riesgos asociados: Efectivas en modelos animales sin necesidad de adyuvantes o sistemas de administración. estimulación de la respuesta humoral y celular. Solo expresan genes que inducen inmunidad. Las produce el mismo animal, siguiendo las instrucciones del gen insertado en el plásmido de expresión en la forma nativa. Menor dependencia de la cadena de frío que las vacunas con proteínas. Bajo Costo y menor tiempo de preparación Integración potencial del plásmido en el genoma de las células hospedadoras. Inducción potencial de anticuerpos contra ADN del plásmido inyectado. Problema de conformación no nativa de proteínas bacterianas en vacunas con ADN inoculadas en animales. Liberación accidental de las construcciones de ADN desnudo pueden favorecer transferencia horizontal de genes 57
58 Vacunas comestibles. a partir de plantas modificadas genéticamente que actúan como bioreactores de antígenos Experimental 58
59 Experimental 59
60 VACUNAS COMESTIBLES Vacunas orales Vehículos: células enteras LAB o esporas Bacillus sobrevivir aparato gastrointestinal retención de 2 a 3 días Vehículo de baja inmunogenicidad Experimental propiedades adyuvantes Sistemas genéticos (Food-Grade) No necesita aislamiento y purificación del antígeno producción IgA administración fácil, evita uso agujas 60
61 Por qué aún no es posible? 61
62 Por qué aún no es posible? Transferencia Horizontal con bacterias intestinales Alternativas??? Status GRAS como carrier no recombinante 62
63 Altas inversiones en I+D resultan en altos precios Existencia de vacunas huérfanas Diferencia genética de patógenos puede resultar en efectividad relativa Las vacunas tradicionales baratas están comenzando a escasear Vacunas tradicionales: disponibilidad vs. demanda Fuente: GAVI Immunization Focus 63
64 Qué tipo de vacuna emplearía para proteger un animal contra: -una enfermedad ocasionada por una bacteria de vida intracelular? Ej: Brucella, Mycobacterium tuberculosis y Lysteria monocytogenes, malaria, infección por VIH, u otros virus. deben ser capaces de generar respuestas citotóxicas celulares -una bacteria toxigénica. Ej: Clostridium. una respuesta humoral mediada por linfocitos B vigorosa puede neutralizar las toxinas de algunos gérmenes (difteria y tétanos) o neutralizar virus circulantes, como los enterovirus. 64
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