Rev Biomed 1995; 6: Alfredo Dájer-Abimerhi, Edwin J. Gutiérrez-Ruiz, Delfina Zapata-Villalobos, Nicholas Honhold, Sandra L. Villegas-Pérez.

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1 84 Rev Biomed 1995; 6: Comparación de cinco pruebas serológicas para la detección de anticuerpos contra Brucella abortus y reporte preliminar del porcentaje de reactores positivos en hatos bovinos en Yucatán, México. Alfredo Dájer-Abimerhi, Edwin J. Gutiérrez-Ruiz, Delfina Zapata-Villalobos, Nicholas Honhold, Sandra L. Villegas-Pérez. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, Yucatán, México. RESUMEN. Introducción. En México las pérdidas por brucelosis se estiman en US$ 133 millones al año y se reportaron 4155 casos en humanos en La prueba de Fijación de Complemento (FC) ha demostrado ser la que mejor identifica animales infectados, sin embargo es compleja, cara y difícil de estandarizar por lo que queda fuera del alcance de muchos laboratorios. El objetivo del trabajo es comparar las pruebas de Rosa de Bengala (RB), Rivanol (RIV), 2-Mercaptoetanol (2-ME) yensayo Inmunoenzimático (ELISA) con FC para conocer su utilidad en el diagnóstico de brucelosis bovina en Yucatán. Se reporta el porcentaje de reactores positivos de la enfermedad en el estado. Materiales y Métodos. Para comparar las pruebas serológicas 175 sueros se seleccionaron de nuestro banco de sueros y se clasificaron en tres grupos: vacunados, no vacunados y sin historia de vacunación sueros remitidos al laboratorio para el diagnóstico de brucelosis se corrieron con RB y 2-ME. Resultados. La sensibilidad y especificidad relativas (SR y ER) de las cuatro pruebas comparadas con FC fueron como sigue: RB, 100% Solicitud de sobretiros: Q.F.B. MC. Delfina Zapata-Villalobos. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán, Apdo. Postal 4-116, Mérida, Yucatán, México. Recibido el17/nov./94. Aceptado para publicación el 25/Abril/95.

2 85 A Dájer-Abimerhi y col. y 38%; 2-ME, 90% y 99%; RIV, 86% y 100%; ELISA, 97% y 99%. El porcentaje de reactores positivos encontrado fue de 2.5% Discusión. La prueba de RB demostró ser buena como tamiz al tener una SR del 100% sin embargo por su baja ER (38%) debe ser confirmada ya sea con la prueba de FC o ELISA, ya que el 2-ME y RIV mostraron baja SR (90 y 86%), lo que aumenta el riesgo de obtener falsos negativos. Palabras Clave: Brucelosis, Rosa de Bengala, Ridanol, 2-Mercaptoetanol, ELISA, fijación de complemento. follows:rb, 100% and 38%; 2-ME, 90% and 99%; RIV, 86% and 100%; ELISA, 97% and 99%. The percentage of positive reactors found was 2.5%. Discussion. The RB demonstrated to be a good screening test with a SR of 100%, however, due to its low ER (38%) it must be confirmed either by FC or ELISA. The 2-ME and the RIV tests showed low SR (90% and 86%) which increases the risk of obtaining false negative results. Key Words: Brucellosis, Bengal Rose Test, Rivanol, 2-Mercaptoethanol, ELISA, Complement fixation. SUMMARY. COMPARISON OF FIVE SERUM TESTS FOR ANTIBODIES AGAINST BRUCELLA ABORTUS. PRELIMINAR REPORT OF PREVALENCE AMONG BOVINE HERDS IN YUCATAN, MEXICO. Introduction. In Mexico losses due to brucellosis are estimated at U.S. $133 million annually and 4155 human cases were reported in The Complement Fixation Test (FC) has been shown to classify infected animals better than any other serological test, however it is complex, expensive and hard to standardize therefore it is not available to many labs. The objective of this work is to compare the Rose Bengal (RB), 2- Mercaptoethanol (2-ME), Rivanol (RIV) and ELISA tests to FC to assess their utility in the diagnosis of bovine brucellosis in Yucatan. The percentage of positive reactors is reported. Materials and Methods. For the comparison of the serological tests, 175 samples were selected from our serum bank and classified in three groups: vaccinated, non vaccinated and with no certain vaccination history available sera submitted for routine testing were run with RB and 2-ME. Results. Relative sensitivity and specificity (SR and ER) for all the tests compared to FC were as INTRODUCCION. En América Latina, Argentina, México y Perú son los tres países en los que la mayoría de los casos de brucelosis se reportan. En Latino América, las pérdidas debidas a brucelosis se calculan en unos 600 millones de dólares al año (1). En México, se estimaron pérdidas por 133 millones de dólares durante 1979 (2). Un aspecto importante de la brucelosis es su elevado potencial zoonótico. En 1983, se reportaron en México 4300 casos de brucelosis en humanos y 4155 en 1987 (3). La enfermedad se considera endémica en todo el país y existe un programa oficial de control que cubre toda la nación. Este incluye la cuarentena de importaciones, control de movilización, muestreos voluntarios y vacunación (3). En 1970 la prevalencia de brucelosis bovina se calculó en 14% en México. Después de una campaña nacional de vacunación usando la vacuna con cepa 19, la prevalencia en 1982 disminuyó a un 2% en ganado de carne y a un 4% en ganado lechero. Esto se mantuvo estable hasta 1984 (2). En 1978, el 6% de 2310 muestras de ganado bovino en Yucatán resultaron positivas serológicamente usando las pruebas de Rosa de Bengala (RB) y Aglutinación lenta y rápida (4). Revista Biomédica

3 86 Anticuerpos contra Brucella abortus. El Laboratorio de Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Yucatán usó la prueba de RB como tamiz para la detección de anticuerpos contra Brucella abortus (Br. abortus) con todos los positivos siendo confirmados mediante la prueba de 2-Mercaptoetanol (2-ME). Debido a sus posibles características mutagénicas y desagradable olor, se decidió evaluar la prueba de Rivanol (RIV). Una prueba de Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) indirecto también fue evaluado en condiciones donde la vacunación es una práctica común. La prueba de Fijación de Complemento (FC) se usó como referencia contra la cual las demás pruebas fueron comparadas. Mientras que el aislamiento bacteriológico es la única manera segura de definir un animal infectado, tiene varias desventajas. Primero, para aislar Br. abortus de potadores, los ganglios linfáticos supramamario e ilíaco son los tejidos de elección y por lo tanto esto solo puede efectuarse post-mortem. También es posible que la bacteria no sea aislada de animales infectados, lo cual guiaría a la obtención de falsos posivos en reactores positivos por serología. Otro problema en un área como la nuestra en la cual la vacuna con cepa 19 es una práctica común, es que la Brucella aislada debe ser tipificada para asegurar que no es una cepa vacunal. Correlaciones entre animales infectados y resultados serológicos positivos han sido previamente publicados (5,6). Ambos estudios encontraron que la prueba de FC es la mejor prueba serológica para identificar animales infectados. La prueba de FC es también conocida por ser capaz de diferenciar entre los títulos de animales infectados y vacunados (7). MATERIALES Y METODOS. Para la comparación de las pruebas serológicas en la detección de anticuerpos contra Br. abortus, 175 muestras de hembras bovinas adultas (1 gestación mínimo) fueron seleccionadas de nuestro banco de sueros para obtener una buena cobertura tanto de animales positivos como negativos, se formaron tres grupos de animales: vacunados, no vacunados y sin historia de vacunación disponible. Dentro de cada grupo la selección se hizo al azar. Durante 1989 y 1990, 2323 sueros bovinos, procedentes de 66 hatos del estado de Yucatán, fueron remitidos a nuestro laboratorio para la detección de anticuerpos contra Br. abortus; estos se evaluaron con las pruebas de RB y 2-ME. Las muestras remitidas para diagnóstico rutinario provinieron de todo el estado y a petición de los propietarios. Para la prueba de RB el método usado es el descrito por Alton et al (8) y Morgan et al (7). El antígeno fue provisto por el Laboratorio Central Veterinario (CVL), Weybridge, Inglaterra. Para 2-ME, la técnica usada es la descrita por Morilla y Bautista (9) y Morgan et al (7). El antígeno fue provisto por la Productora Nacional de Biológicos Veterinarios (PRONABIVE), México. Las diluciones de suero usadas fueron: 1:25, 1:50, 1:100 y 1:200. Para la prueba de RIV, el método usado es el descrito por Morilla y Bautista (9). El antígeno fue proporcionado por PRONABIVE, México, y es específico para esta prueba. Las mismas diluciones usadas para 2-ME se usaron para RIV. La prueba de ELISA indirecta se realizó con un kit proporcionado por el CVL, Weybridge, el cual contenía todos los reactivos necesarios. El antígeno fue un extracto lipopolisacárido (LPS) de Br. abortus. El cromógeno fue [2,2'-azino bis (ácido 3-etil-benzitiazolino sulfónico)] (ABTS). La densidad óptica (DO) de cada pozo fue medida con un lector Dynatech Minireader II (Manual) (Dynatech Corporation). Una dilución del suero única de 1:200 fue usada. La prueba de FC fue el método de microtitulación usado en el CVL, Weybridge, excepto que se encontraron problemas cuando las muestras se corrieron al principio a una dilución 1:2 como recomienda el CVL y se rechazaban si resultaban negativas, debido a un

4 87 A Dájer-Abimerhi y col. fuerte efecto de prozona. Por esto todas las muestras se corrieron con diluciones dobles hasta la dilución final y se derivaron las unidades internacionales (UI) a partir de cuadros estándar. Los controles positivo y negativo así como el antígeno fueron proporcionados por el CVL, Wrybridge. La base para la interpretación de cada prueba se muestra en el cuadro 1. Para las pruebas de RB, 2-ME y RIV, se utilizó el criterio proporcionado en las referencias. Para la prueba de FC, los niveles usados se tomaron de un cuadro proporcionado por en Centro de Medicina Veterinaria Tropical (CTVM), Edimburgo. La derivación de las DO Cuadro 1 Niveles usados para la interpretación de las pruebas serológicas empleadas para el diagnóstico de Brucella abortus. Vacunados No vacunados Desconocido RB Reacción Reacción Reacción 2-ME 1:50 1:25 1:25 RIV 1:50 1:25 1:25 ELISA DO* 30% 20% 20% FC 50 UI 20 UI 20 UI * Expresado como porcentaje de la densidad óptica del control positivo de cada placa. UI = Unidades internacionales. consideradas como positivas para la prueba de ELISA se describe en la sección de resultados. RESULTADOS. En los cuadros 2, 3, 4 y 5 se muestran los resultados para las pruebas de RB, 2-ME, RIV y ELISA comparados con aquellosde FC en animales vacunados, no vacunados, sin historia de vacuna y total. La sensibilidad y especificidad relativas comparadas con FC también se muestran, con los resultados entre paréntesis cuando el número reducido de muestras nos llevan a tener poca Cuadro 2 Sensibilidad y especificidad relativas de la prueba de Rosa de Bengala comparada con la prueba de fijación de complemento para la detección de anticuerpos contra Brucella abortus (n=167). NO-VAC RB (100) 83 RB VAC RB (100) 13 RB- 0 9 DESC RB RB- 0 0 TOTAL RB RB RB = Rosa de Bengala; FC = Fijación de Complemento; SR = Sensibilidad Relativa; ER = Especificidad Relativa; VAC = Vacunados; NO VAC = No vacunados. DESC = Sin historia de vacunación disponible. Cuadro 3 Sensibilidad y especificidad de la prueba de 2-Mercaptoetanol comparada con la fijación de complemento para la detección de anticuerpos contra Brucella abortus (n=174). NO-VAC (80) ME VAC + (1) 2 (33) 97 2-ME DESC ME TOTAL ME ME = 2-Mercaptoetanol; FC = Fijación de Complemento; SR = Sensibilidad Relativa; ER = Especificidad Relativa; VAC = Vacunados; NO VAC = No vacunados; DESC = Sin historia de vacunación disponible. Revista Biomédica

5 88 Anticuerpos contra Brucella abortus. Cuadro 4 Sensibilidad y especificidad de la prueba de Rivanol comparada con la fijación de complemento para la detección de anticuerpos contra Brucella abortus (n=175). NO-VAC (86) 100 RIV VAC (67) 100 RIV DESC (100) RIV TOTAL RIV RIV = Rivanol; FC = Fijación de Complemento; SR = Sensibilidad Relativa; ER = Especificidad Relativa; VAC = Vacunados; NO VAC = No vacunados; DESC = Sin historia de vacunación disponible. Cuadro 5 Sensibilidad y especificidad de la prueba de ELISA comparada con la fijación para la detección de anticuerpos contra Brucella abortus (n=173). NO-VAC (93) 100 ELISA VAC (100) 99 ELISA DESC (100) ELISA TOTAL ELISA FC = Fijación de Complemento; SR = Sensibilidad Relativa; ER = Especificidad Relativa. VAC = Vacunados; NO VAC = No vacunados; DESC = Sin historia de vacunación disponible. confianza en los resultados. La DO a la cual una muestra fue clasificada como positiva en la prueba de ELISA se derivó de obtener la mejor concordancia con los resultados de FC (ver cuadro 1). El nivel sugerido por los fabricantes del equipo era 10% de la DO del pozo control positivo. En nuestras condiciones, esto produjo algunos falsos positivos en comparación con FC en animales no vacunados y muchos en animales vacunados. Se determinó que un nivel del 20% del pozo control positivo en animales no vacunados y animales sin historia de vacunación disponible y 30% en animales vacunados produjo óptima concordancia con la prueba de FC. Usando un nivel del 10% del control positivo, la SR se mantuvo igual pero la ER cayó a un 70%, principalmente debido a cambios en la interpretación de resultados de muestras provenientes de animales vacunados, pero también en animales no vacunados. Un mayor incremento en el punto de corte condujo a una caida de la SR. Se intentó definir el punto de corte en términos de la media de las muestras negativas más 3 desviaciones estándar, pero debido a que los datos no están normalmente distribuidos no se consideró adecuado. De 2323 sueros de bovinos remitidos al laboratorio, provenientes de 66 hatos para serología rutinaria contra Br. abortus, 355 (15.3%) fueron positivos a RB, y de estos 57 (16.1%) fueron positivos a 2-ME, dando como resultado un total de 2.5% de reactores positivos con 2- ME. DISCUSION. En el cuadro 2 puede observarse que la prueba de RB es una buena prueba tamiz ya que muestra una SR del 100%. Aunque su ER es baja, particularmente en animales vacunados, no rechaza ninguna muestra clasificada como positiva mediante FC.Esto concuerda con hallazgos previos

6 89 A Dájer-Abimerhi y col. (7). El 2-ME y el RIV han sido propuestos como métodos que pueden diferenciar entre títulos por vacuna y por infección (7, 10). Aunque esto parece ser el caso a partir de nuestros resultados, surgió el problema de que en ambas pruebas la SR total fue baja comparada con FC. Esto puede llevar a la retención de animales infectados (falsos negativos) en el hato si estas pruebas fueran usadas en campañas de control. Este hallazgo ha sido reportado previamente para 2-ME (11). Un análisis de los resultados a FC y las DO de ELISA para los tres grupos de animales se usaron para derivar un punto de corte para la prueba de ELISA. Usando esta aproximación empírica, se produjeron resultados comparables a FC en animales vacunados, no vacunados y ambos. Aunque el antígeno extracto LPS usado en la prueba de ELISA ha sido reconocido por no diferenciar entre títulos por vacuna o infección en comparación con FC (12,13), los niveles definidos en estos estudios para una DO positiva no fueron equivalentes a las concentraciones de U.I. de FC utilizadas para indicar infección presente. De hecho esta fue mucho menor, definiéndose en términos de la DO de las muestras para las cuales hubo una ausencia de reacción en FC a una dilución 1:2. El nivel de positividad para FC se definió como la presencia de reacción a un título 1:8 o mayor. Una mayor SR y por lo tanto menor ER para la prueba de ELISA comparada con la de FC podría esperarse bajo estas condiciones. Como las DO de la prueba de ELISA pueden relacionarse directamente con la concentración de anticuerpos, sólo un pozo se requiere por muestra aun si se necesitan los títulos, lo cual hace la prueba de ELISA más barata y rápida. También los reactivos son menos y más fáciles de manejar que aquellos de FC. Sin embargo las pruebas de ELISA proporcionadas en forma de equipos requieren un elevado número de muestras o agrupar las muestras en el tiempo si los reactivos han de usarse eficientemente; pero esto también es aplicable a FC. Aunque el número de muestras utilizado en este estudio es bajo y los intervalos de confianza de algunos de los porcentajes mencionados pueden ser altos, las siguientes recomendaciones pueden hacerse. A partir de los resultados presentados aquí, se recomienda que cuando sea posible se utilice la prueba de FC para la identificación de reactores positivos después de utilizar la prueba de RB como tamiz. La prueba de ELISA utilizada en el trabajo demostró un gran potencial al dar resultados muy similares a los de FC usando los puntos de corte mencionados con anterioridad para identificar los reactores positivos y podría ser utilizada como una alternativa para la prueba de FC. Las pruebas de 2-ME y RIV parecen tener altas ER pero baja SR comparadas con FC y pueden por lo tanto fallar en la identificación de reactores positivos a FC. Debido a lo anterior un programa de control y/o erradicación o un estudio de seroprevalencia no debe basarse en estas pruebas. Estudios más completos son necesarios para confirmar estos hallazgos. Los resultados de las muestras de rutina presentan un porcentaje total bajo de reactores positivos usando la prueba de 2-ME. De la comparación hecha con la prueba de FC, se piensa que la cifra de 2.5% queda por debajo de la cifra real y que con FC, esta cifra estaría alrededor de 2.8%. Un estudio debidamente diseñado es necesario para determinar los niveles de seroprevalencia. REFERENCIAS. 1.- Acha PN, Szyfres B. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales. 2a edición. Washington:OPS/OMS, 1988: García Carrillo C. La brucelosis de los animales en América Latina y su relación con la infección humana. París: OIE, 1987: Revista Biomédica

7 90 Anticuerpos contra Brucella abortus. 3.- FAO/WHO/OIE. Animal health yearbook. París: FAO/WHO/OIE, 1988: Martínez EML. Estudio serológico sobre brucelosis en bovinos en el Estado de Yucatán. Aspectos zoonóticos de la misma. Tesis de licenciatura, FMVZ-UADY, Mérida: 1978: Alton GG, Maw J, Rogerson BA, McPherson GG. The serological diagnosis of bovine brucellosis: an evaluation of the complement fixation, serum agglutination an rose bengal tests. Aus Vet J 1975; 51: Sutherland SS, Evans RJ, Bathgate J. Application of an Enzyme-linked Immunosorbent Assay in the final stages of a bovine brucellosis eradication program. Aus Vet J 1986; 63: Stemshorn BW, Forbes LB, Eaglesome MD, Nielsen KH, Robertson FJ, Samagh BS. A comparison of standard serological tests for the diagnosis of bovine brucellosis in Canada. Can J Com Med 1985; 49: Sutherland SS. Evaluation of the Enzimelinked Immunosorbent Assay in the detection of cattle infected with Brucella abortus. Vet Microb 1985; 10: Cargill C, Lee K, Clarke I. Use of an Enzimelinked Immunosorbent Assay in a bovine brucellosis eradication program. Aus Vet J 1985; 62: Morgan BWJ, MacKinnon DJ, Gill KPW, Gower SGM, Norris PIW. Brucellosis diagnosis: standard laboratory techniques. London: MAFF/ HMSO, 1987: Alton GG, Jones LM, Pietz DE. Laboratory techniques in brucellosis. 2nd edition. Geneva: WHO, Monograph series No. 55, 1975: Morilla GA, Bautista CR. Manual de inmunología. México: Diana, 1986: Metcalf HE. Control of bovine brucellosis in the United States En: Woods GT, ed. Practices in Veterinary Public Health and Preventive Medicine in the United States. Iowa: Iowa State University Press, 1986: