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2 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades Laboratorio de habilidades N 4 Antimicrobianos Durante el ciclo diagnóstico estudiamos los distintos procesos de diagnóstico directos e indirectos del examen microbiológico. Comenzamos con el diagnóstico directo y la investigación del microorganismo causal del proceso infeccioso que incluye la toma de muestra, el aumento de la biomasa microbiana por medio de distintos cultivos y conocimos las distintas formas de identificarlos en familia, género, especie, etc. En la práctica médica Qué hacemos una vez identificado el microorganismo? Sabemos que nuestro organismo está preparado con un complejo sistema inmunológico que nos protege contra diversas noxas. Pero qué sucede cuando esas defensas no son suficientes para frenar un proceso infeccioso? Nos introducimos así al concepto de antimicrobianos (AMB) Reseña histórica Si bien la historia de los AMB comienza formalmente en el siglo XX, existen registros de culturas antiguas que utilizaban compuestos para combatir enfermedades infecciosas, como el extracto de plantas o algunos mohos. En 1910 comienza a comercializarse un producto derivado de compuestos orgánicos del arsénico llamado arsfenamina (Salvarsan), conocido como bala mágica, que parecía tener cierta efectividad en el tratamiento de la sífilis. En 1935 aparece la primera sulfonamida, el prontosil. Este era utilizado originariamente como método de tinción en laboratorios pero pronto se observó que protegía a las ratas de laboratorio frente diversas infecciones estreptocócicas. Funcionaba como una prodroga, ya que el fármaco se metabolizaba en el organismo para convertirse en sulfanilamida, así, se considera a las sulfas dentro de los primeros AMB de amplio espectro. Años antes, en 1928 se produce un acontecimiento que revolucionaria la historia de la medicina. Un científico llamado Fleming descubre en su laboratorio que sus placas de cultivo bacteriano habían sido contaminadas por unas colonias de un hongo llamado Penicillium y podía observarse que en la periferia de esta colonia fúngica el crecimiento bacteriano estaba inhibido. Sin embargo no fue sino hasta 1945 que dos científicos, Florey y Chain logran producir extractos purificados para producir la Penicilina. Fue el primer AMB descubierto y a partir del cual se comenzará a invertir recursos en el desarrollo de estas sustancias. Fleming, Florey y Chain ganan en 1945 el Premio Nobel de Medicina. De allí en más se sucedieron varios descubrimientos de AMB tanto de origen natural como sintéticos. Definición y clasificación Los AMB son sustancias de distinto origen (natural o sintéticas) utilizadas para dar muerte (bactericida) a los microorganismos o inhibir su crecimiento (bacteriostático). Se intenta lograr que el ATM sea lo más selectivo posible con las células microbianas causando la mínima expresión de toxicidad sobre las células del hospedero. Según el origen de su estructura química podemos hablar de 3 tipos de sustancias Antibióticos (anti-vida) Son sustancias naturales desarrolladas por seres vivos que suprimen o inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Por ejemplo la penicilina es una sustancia producida por hongos del genero Penicillium. Quimioantibióticos: Son antibióticos modificados en el laboratorio con la finalidad de expandir su espectro. Por ejemplo las aminopenicilinas. Quimioterápicos: Son sustancias completamente sintéticas elaboradas por el hombre. Por ejemplo las sulfamidas. 1

3 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades Según la diana sobre la que se dirigen los agentes microbianos pueden ser Antibacterianos Antivirales Antifúngicos Antiparasitarios Para entender cómo actúan los antimicrobianos es imprescindible conocer la estructura de los microorganismos. Podemos resumirlo en el siguiente cuadro: Clasificación según mecanismo de acción Inhibición de la pared bacteriana Betalactámicos Otros grupos Inhibición de la síntesis proteica Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos Antimetabolitos Unión a ribosoma 30S Unión a ribosoma 50S Inhiben la replicación de ADN Inhiben la síntesis de ARN Inhiben la síntesis de ácido fólico Penicilinas Cefalosporinas Carbapenems Vancomicina Daptomicina Isoniacida Etambutol Aminoglucósidos Tetraciclinas Macrólidos Lincosamidas Estreptograminas Quinolonas Metronidazol Rifampicina Sulfonamidas Trimetoprima 2

4 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades La elección de un AMB debe estar basada en las propiedades farmacocinéticas, toxicidad, enfermedad clínica, enfermedad de base, vías de administración, etc. Se recomienda utilizar combinaciones de AMB en el caso de ampliar empíricamente el tratamiento polimicrobiano de una infección, prevenir emergencia de organismos multirresistentes durante la terapia y producir un efecto bactericida sinérgico. Mecanismos de resistencia antimicrobianos La Resistencia (R) a los AMB es la capacidad natural o adquirida por parte de una bacteria de permanecer refractaria a los efectos bactericidas o bacteriostáticos de un AMB. Esto obliga al profesional médico a utilizar otros AMB. Cuando se lanza al mercado un nuevo fármaco se debe especificar el espectro de acción sobre el cual es eficaz. Este va cambiando a medida que la droga es utilizada clínicamente llegando un momento que es inutilizada y cae en desuso. Miremos en la figura de abajo la línea de tiempo. En la parte superior el año en que el AMB comenzó a utilizarse en los tratamientos infecciosos y abajo los años en que se detectaron las primeras resistencias, que como podemos observar no fueron mucho tiempo después. Esto pudo deberse a: - Presencia de mecanismos de resistencia (R) - Uso indiscriminado de ellos - Uso de AMB de amplio espectro - Tratamiento inútiles prolongados - Tratamientos incompletos ó no adecuados para el aislamiento microbiano causante de la infección. - Falta de exámenes microbiológicos antes del tratamiento. 3

5 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades Tipos de resistencia Natural ó intrínseca Son propias del microorganismo. Se demostró con el aislamiento de bacterias estimadas en 2000 años atrás (en las profundidades de los glaciares) con R a AMB de esta era. Todas las bacterias de la misma especie son R a alguna familia de AMB. Adquirida Se produce a través de: - Mutaciones Cambios en la secuencia de bases del cromosoma que codifican el modo de acción del AMB y se trasmite de generación en generación. Ejemplo: Enterobacterias resistentes a las fluorquinolonas por modificación de la ADN girasa - Transmisión de material genético extracromosómico (de otras bacterias) - Plásmidos - Integrones - Transposones Mecanismos de resistencia Eflujo Un AMB penetra en la bacteria y es expulsado de la misma por un transporte activo, una especie de bomba expulsora que utilizan las bacterias para la excreción de productos residuales o tóxicos. Ejemplo: Staphylococcus aureus resistentes a las tetraciclinas Disminución de la permeabilidad de la pared bacteriana Puede realizarla la bacteria por pérdida o modificación de los canales de entrada (porinas) Ejemplo: Pseudomonas aeruginosa resistente a imipenem (carbapenem) Modificación del sitio de acción Hay AMB que se unen a proteínas que son esenciales para la sobrevida de la bacteria. La R de éstas radica en que ella modifica la proteína diana y cambia su función. Ejemplo: Staphylococcus aureus resistente a la meticilina por alteración de las PBP (Penicillin Binding Proteins) Producción de enzimas inactivantes del AMB Las bacterias producen enzimas que inactivan o destruyen los AMB. Es oportuno citar las enzimas cloranfenicol acetil transferasa sobre el cloranfenicol y las betalactamasas que tiene la función de destruir el anillo beta-lactámico de los AMB de ese grupo. No hace mucho tiempo fueron creadas en la industria farmacéutica moléculas de antibetalactamasa (ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam) para proteger a los AMB del efecto destructor de la enzima. Citaremos ejemplos: - AmpC cromosómicas inducibles: Se producen a bajos niveles de manera natural y aumentan su síntesis en presencia de inductores (betalactámicos). Como se mencionó anteriormente, pueden derreprimirse, perdiendo así la característica de inducción. Ejemplos: Enterobacter spp., M. morganii, Providencia spp. P. aeruginosa - AmpC cromosómicas no inducibles (constitutivas): Su expresión es a niveles muy bajos sin mostrar resistencia. Cuando se encuentran hiperproducidas pueden conferir resistencia a todos los betalactámicos a excepción de cefalosporinas de 4ta generación y carbapenémicos. Ejemplo: Escherichia coli. 4

6 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades AmpC plasmídicas inducibles y AmpC plasmídicas constitutivas: La evidencia molecular sugiere que los genes que codifican a estas enzimas, derivan de los genes ampc cromosómicos que naturalmente poseen las enterobacterias arriba mencionadas. Estos genes han sido integrados en elementos genéticos transferibles facilitando la diseminación a diferentes microorganismos. Ejemplo: Los genes ampc mediados por plásmidos han sido encontrados en bacterias como Salmonella spp., K. pneumoniae y Proteus mirabilis que naturalmente no poseen estos genes. Hasta el presente se han descrito más de 20 familias de AmpC plasmídicas. Al igual que las betalactamasas AmpC cromosómicas hiperproductoras, las enzimas AmpC plasmídicas confieren resistencia a un amplio espectro de betalactámicos incluyendo penicilinas, oxyminocefalosporinas, cefamicinas, etc. - Betalactamasa de espectro extendido - Carbapenemasa Control de la resistencia (según el CDC) - Uso prudente de los AMB - Educación a los agentes de salud - Involucrarlos en el problema - Rápida identificación de los microorganismos multiresistentes o productores de resistencia plasmídica transferible - Estricto aislamiento de contacto - Lavados de manos!!!!! Aspectos que no deben olvidarse: - Trabajar en equipo - Realizar exámenes microbiológicos confiables - Tener toda la información sobre el paciente 5

7 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades Pruebas de sensibilidad antimicrobiana (PSA) Objetivos Que el alumno sea capaz de: Distinguir las distintas técnicas que permiten establecer el perfil de sensibilidad antimicrobiana de los microorganismos involucrados en procesos infecciosos Comprender las distintas pruebas in Vitro para obtener el perfil de sensibilidad Interpretar los resultados y resolver situaciones practicas Justificar la utilización de cada técnica en particular Estas pruebas son de particular importancia para instaurar un correcto tratamiento antimicrobiano individual, monitorear la evolución de la resistencia antimicrobiana (epidemiología local, nacional, etc.) y/o actualizar estrategias para el tratamiento empírico de la infecciones. Se realizan a fin de orientar al profesional médico a formular un adecuado y oportuno tratamiento antimicrobiano (AMB). Según cuál fuera el microorganismo en cuestión (bacterias, hongos, parásitos o virus), la metodología y necesidad de realización varían. Mapa conceptual Punto de partida Estas pruebas se basan en la disminución o inhibición del crecimiento de un microorganismo en un medio en presencia de cantidades conocidas de AMB. Se efectúan desafiando una suspensión de microorganismos estandarizada con una o diferentes concentraciones o tipos de AMB, comprobando si tiene lugar o no la inhibición del crecimiento bacteriano. 6

8 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades Todas son técnicas rigurosamente controladas y estandarizadas. Por ejemplo: en pureza y densidad del inóculo, composición del medio, reactivos, condiciones de incubación, métodos de lectura, criterios clínicos e interpretación de resultados. El microbiólogo clínico se ajusta a las recomendaciones emanadas por la Sección antimicrobianos del Instituto de epidemiología Dr. Carlos Malbrán y el CLSI (Status Clinical and Laboratory Standards Institute) que llegan en forma de guías metodológicas y tablas de interpretación. La rápida evolución de la adquisición de los mecanismos de resistencia por las bacterias clínicamente significativas justifica sobremanera la realización de estos análisis de expresión fenotípica y nos induce a la realización de otros adicionales en la mayoría de los casos. La sensibilidad (S) in Vitro es un prerrequisito para inferir la eficacia de un tratamiento AMB, o sea que orienta para la decisión del AMB a utilizar en el tratamiento adaptado a cada paciente. En algunas bacterias a veces su resistencia (R) a los AMB puede ser predicha porque tienen un espectro natural de actividad o de R natural y la mayoría de las veces nos orientan en su tipificación. Ejemplos: Proteus mirabilis R natural a colistin, Klebsiella pneumoniae a ampicilina, Pseudomonas aeruginosa a nitrofuranos, cefalosporinas de 1ª y 2ª generación, etc. También hay algunas que son naturalmente S pero adquieren R o sea que su antibiotipo ha sido modificado por mutación o adquisición de genes. Esta evolución de la R esta íntimamente ligada al uso de AMB. Es por esto que la detección de la S por pruebas fenotípicas o genotípicas es esencial. R natural : predecible R adquirida: impredecible ( justifica necesidad de PSA) Técnicas para determinar la sensibilidad antimicrobiana in vitro Bacterias Cabe aclarar que estas pruebas son para bacterias de rápido crecimiento, no son tampoco exigentes en cuanto a requerimientos nutricionales por cultivo, aerobias o anaerobias facultativas, ph óptimo alrededor de 7 y temperatura de crecimiento ºC. Es por esta razón que en el laboratorio de microbiología, no se realiza habitualmente la investigación de la sensibilidad a los AMB de las bacterias anaerobias, (aparente patrón estable de sensibilidad). Esto mismo se aplica también para espiroquetas, micoplasmas, clamidias y rickettsias. En el caso de las micobacterias, las pruebas de sensibilidad AMB se realizan en laboratorios especializados y por técnicas diferentes (feno y genotípicas). Existen distintas técnicas para realizar las PSA, estas pueden ser por DILUCION y/o DIFUSION, o bien técnicas que combinan ambos métodos. SIEMPRE deben realizarse con cultivo bacteriano puro, y que no sea parte de la microbiota colonizante habitual en el sitio infeccioso o un contaminante. - Cuáles y cuántos AMB ensayamos? En las PSA lo conveniente es probar varios AMB pero NO todos los existentes en el mercado sino: - Uno de cada grupo y que su actividad sea equivalente al ensayado. In vivo tendrá la misma actividad que él. Ejemplo: Se ensaya cefalotina y su actividad in vitro se hace extensiva para todas las cefalosporinas de 1º generación (cefadroxilo, cefalexina, cefazolina, etc). - Todo aquel AMB de interés terapéutico, que llegue activo y en concentración necesaria en el sitio de la infección. 7

9 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades Aquellos AMB que se constituyen en marcadores terapéuticos. Son más amigables para la detección de los mecanismos de R. Ejemplo: Se ensaya cefoxitina como marcador de la meticilino resistencia en Staphylococcus aureus y predice la actividad a todos los betalactámicos. - Espectro clínico de los AMB Esta integrado por la R natural del microorganismo, frecuencia de adquisición de la R, farmacocinética y datos clínicos. El espectro clínico es regularmente revisado. La eficacia clínica no solo es suficiente con una correcta realización de las PSA sino de una apropiada indicación clínica profesional. - Categorización de los microorganismos frente a la actividad de los AMB S (sensibles): los AMB inhiben la multiplicación bacteriana ocasionando su muerte o inhibición de su multiplicación. I (S intermedia-moderada actividad in Vitro): Puede no haber respuesta clínica satisfactoria, se utilizan en situaciones donde el AMB concentra en el sitio de infección. Ejemplo: cefalotina ó fluorquinolonas de S intermedia en infección urinaria). R (resistentes): Los AMB son inhibibles por los microorganismos y la eficacia clínica no ha sido segura en estudios. Ejemplo: Klebsiella pneumoniae productora de betalactamasa de espectro extendido. Esta enzima rompe el anillo betalactámico de los AMB de este grupo invalidando su actividad. a) Técnicas de dilución Se realiza la técnica en macrodilución con una serie de tubos que poseen la misma cantidad de un caldo de cultivo adecuado para el crecimiento de la bacteria que estamos estudiando; en cada uno de ellos se coloca una cantidad decreciente de un AMB (la mitad que en el tubo anterior), dejando siempre un tubo control sin antibiótico. Finalmente se colocan en todos los tubos la misma cantidad de una suspensión estandarizada de las bacterias en cuestión. Estos tubos se incuban por hs. en estufa a ºC. Pasado ese lapso de tiempo se observa en cuáles tubos hubo crecimiento bacteriano y en cuáles no. Se identifican por la turbidez que adquiere el medio. El tubo con menor cantidad de AMB de los que no presentan crecimiento (el medio permanece transparente como lo era originalmente) es el que indica la mínima concentración de antimicrobiano o CIM, (expresada en microgramos por mililitro) que se requiere para inhibir el crecimiento de la bacteria que estamos estudiando. De esto se deduce que cuanto menor es la cantidad que se necesita de un AMB para que este inhiba a un microorganismo, mayor es la actividad de él frente al microorganismo y viceversa. Esta técnica también puede realizarse en pequeños pocillos contenidos en placas de poliestireno fondo en U, técnica denominada MICRODILUCION, en la cual el crecimiento bacteriano se observa como un botón turbio en el fondo del pocillo. 8

10 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades La desventaja de las técnicas de dilución es que sólo permite probar un antibiótico por vez, lo cual resulta un tanto engorroso y costoso. Esta desventaja puede solucionarse en parte con las técnicas de microdilución, ya que las placas (de 96 pocillos en U) permiten probar diferentes AMB en cada columna. 9

11 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades b) Técnica de difusión (Método de Kirby-Bauer) Se basa en la utilización de una placa de Petri que posee un medio de cultivo sólido (Agar Mueller-Hinton) en la cual se siembra una suspensión de la bacteria que estamos estudiando en solución fisiológica (correspondiente a una concentración igual a la turbiedad del tubo 0.5 de la escala de Mc Farland). Esta siembra se realiza en tres direcciones diferentes con el fin de que se consiga una distribución lo más homogénea posible de las bacterias sobre el medio de la placa. Posteriormente se colocan sobre la misma una serie de monodiscos de papel o tabletas impregnados con una cantidad determinada de AMB. Estos difunden radialmente desde el disco al agar sembrado con bacterias, estableciéndose un gradiente de concentración a su alrededor (la mayor concentración de antibiótico está a su alrededor del monodisco y va disminuyendo hacia la periferia). Estas placas se dejan incubando en la estufa por hs. a ºC. Al cabo de este tiempo se puede observar un crecimiento homogéneo en la superficie, con halos de inhibición alrededor de los discos que tengan antibióticos activos frente a la bacteria sembrada. El diámetro de estos halos expresados en mm se mide con un calibre o regla. Los mm que resultan de la lectura de la ausencia de crecimiento se comparan con una tabla que expresa, para cada AMB el diámetro que indica S, I ó R. El diámetro de S se aproxima a la CIM de la bacteria para ese AMB. c) Técnica mixta (método epsilométrico ó por gradiente de concentración AMB) Años atrás se la conocía como E-Test. Combina las técnicas de difusión y dilución. Se realiza de igual forma que para la técnica de difusión pero en vez de colocar los monodiscos o tabletas se colocan tiras plásticas que poseen a su largo una concentración decreciente de un determinado AMB. Tras la incubación de la placa durante hs. a 37 ºC, podemos observar un halo de inhibición elipsoidal alrededor de la tira. El punto de la tira en la cual termina este halo, es decir, donde comienza el crecimiento bacteriano, corresponde a la CIM de ese AMB. d) Detección de mecanismos de resistencia a los AMB. Tanto con el método de Kirby-Bauer o el epsilométrico, se pueden detectar mecanismos de resistencia a determinados AMB. Citaremos algunos ejemplos: 10

12 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades Producción de enzimas betalactamasa de espectro - Amp C. extendido (BLEE) - Disminución de la sensibilidad de fluoroquinolonas - Meticilino resistencia de Staphylococcus aureus - Resistencia inducible de lincosaminas - Resistencia a glucopéptidos, etc - Portación de microorganismos multiresistentes para evitar su difusión e) Interacción antimicrobiana: sinergia Indiferencia antagonismo El uso de AMB combinados en un mismo tratamiento infeccioso en la actualidad es habitual empleándose con mayor frecuencia de lo que se justifica. La aparición de nuevos AMB, conjuntamente con las especificidades del hospedero y la resistencia que desarrollan las bacterias, han obligado a modificar la estrategia a seguir en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Es importante reconocer que este proceder por parte de los profesionales médicos puede aumentar en grado significativo la incidencia de efectos adversos, incrementar el costo del tratamiento y, en ocasiones, disminuir la eficacia clínica por obstaculizar la actividad de un fármaco con la presencia de un segundo. Cuando empleamos 2 AMB en un tratamiento podemos lograr entre ellos: Sinergia: se refiere a la propiedad de ciertas combinaciones de AMB capaces de producir un efecto bactericida superior al ejercido por cada uno de ellos por separado. Antagonismo: propiedad de ciertas combinaciones de AMB de ejercer un efecto bactericida inferior al de cada uno de ellos por separado Indiferencia: propiedad de ciertas combinaciones de AMB de ejercer un efecto bactericida igual al de sólo uno de ellos. Antagonismo Indiferencia Sinergia 11

13 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades Bacterias especiales: Micobacterias La sensibilidad a los fármacos antituberculosos en Mycobacterium tuberculosis y otras de crecimiento lento se realiza por: a) Método de las proporciones En un medio sólido (Lowenstein Jensen) sin antimicobacteriano se siembra un inóculo de micobacterias determinado correspondiente al 100% del crecimiento y luego se siembran otros tubos conteniendo el mismo medio con diferentes fármacos a ensayar. Se incuba en aerobiosis a 37 ºC y al cabo de 4 a 6 semanas se cuentan las colonias en todos los tubos y se evalúa la proporción de desarrollo obtenida frente a la control (100%). También se puede realizar en medio líquido (Middlebrook) incubándose en estufas que registran la gráfica de la curva de crecimiento. Si las curvas del control con las de los frascos que tienen antimicobacterianos son similares, implica que hay 1% o más de micobacterias resistentes. Es un sistema automatizado cuyos resultados se pueden leer entre 4 a 14 días (media 6 días). b) Diagnóstico molecular genómico La resistencia a la rifampicina está asociada a resistencia a otros fármacos antituberculosos. Se investiga simultáneamente por técnicas genéticas directamente de muestras clínicas la presencia de micobacterias y mutaciones en el gen rpob (RNA polimerasa subunidad B) asociada a la resistencia a la rifampicina. Los resultados pueden informarse a las 2 hs. La presencia del gen de resistencia a la rifampicina implica la necesidad del estudio de sensibilidad a todas las drogas de 1era. y 2da. línea de tratamiento. 12

14 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades Colomb. Med. [online]. 2006, vol.37, n.4, pp Hongos NO se realizan de rutina en la práctica diaria del laboratorio de micología clínica. Se denomina ANTIFUNGIGRAMA. El patrón de sensibilidad es estable en la mayoría de las infecciones fúngicas. Debido al aumento de las infecciones micóticas fundamentalmente en inmunodeprimidos y al aumento de los tratamientos empíricos que se realizan, han aparecido aislamientos R que hacen que a veces sea necesario el estudio de sensibilidad antifúngica. Para las levaduras las técnicas son similares a las de bacterias: dilución, microdilución, difusión y por gradiente de concentración. Para los hongos filamentosos son muy complejas y difíciles de estandarizar. Se efectúan en centros especializados de micología. Parásitos Las pruebas de sensibilidad antiparasitarias de protozoos y helmintos son muy complejas y NO se realizan de rutina en la práctica diaria del laboratorio de parasitología clínica humana. Poseen patrón de sensibilidad constante frente a los antiparasitarios. En ciertas ocasiones en los laboratorios de microbiología clínica veterinaria se emplean para los enteroparásitos, por ejemplo: el test de disminución de conteo de huevos (TRCH) o test de eficacia en las heces de los animales. Virus NO se realiza de rutina en el laboratorio de virología clínica humana. Los tratamientos se realizan en forma empírica y pueden necesitarse estas pruebas ante fallas en los tratamientos antirretrovirales (ARV). Fundamentalmente estas pruebas de sensibilidad se practican a los fines de investigación y epidemiológicos. Los estudios de sensibilidad pueden efectuarse al virus herpes simple, varicela zoster, hepatitis B e inmunodeficiencia humana (VIH). 13

15 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades En el VIH la resistencia aparece cuando este es capaz de cambiar lo suficiente en sus genes y así evitar la acción de los ARV que llevaría al profesional médico a replantear el tratamiento. Este virus muta fácilmente y se reproduce muy rápido, por tanto una persona puede tener circulando varias cepas (cuasiespecies) en su organismo al cabo de un tiempo de la infección. En los pacientes que tienen una adecuada adherencia al tratamiento, las mutaciones tardan algunos años en aparecer. Existen dos grandes grupos de técnicas para la detección de resistencias del VIH al tratamiento antirretroviral: genotípicas y fenotípicas. Las pruebas de resistencia a los ARV se realizan con sangre entera del paciente como muestra biológica. Las pruebas genotípicas se basan en el análisis del genoma y por tanto detectan la presencia de mutaciones) número y lugar donde se encuentran). Pueden realizarse por secuenciación directa del ARN retroviral o hibridación. Son las más difundidas por su menor costo. Las pruebas fenotípicas miden la cantidad de ARV necesario para impedir la replicación viral in vitro. Un virus resistente necesitará mayor cantidad de ARV para detener su multiplicación. Esta técnica es más simple pero requiere más tiempo y por tanto son más costosas. Fueron suplantadas por las técnicas de virus recombinantes que determinan la concentración de ARV que inhibe el 50% de la infectividad Para tener en cuenta Cualquier prueba de sensibilidad antimicrobiana correctamente realizada e interpretada indica en la mayoría de los casos que ese microorganismo in vitro es sensible a un AMB y, si se lo administra habrá un 90% de respuesta clínica eficaz al tratamiento. Si por el contrario se lo informa como resistente puede haber 50 60% de respuesta clínica. Esta paradoja puede deberse a diversos factores propio del: Paciente: estado inmunitario, adherencia al tratamiento, localización de la infección, presencia de catéteres, sonda vesical, respiradores, gravedad de la infección, etc. Microorganismo: CIM, mecanismos de resistencia, formación de biopelículas, concentración microbiana en el sitio de infección, etc. Antimicrobiano: farmacocinética, farmacodinamia, dosis suministrada, actividad microbicida o microstático, interacciones con otros fármacos, etc. Los antimicrobianos por sí solos no hacen milagros ni son mágicos, simplemente son COLABORADORES en el tratamiento de un proceso infeccioso. PUEDEN DEJAR DE CURAR!!! Actividad práctica El docente le entregará a cada grupo: - 1 gradilla - 1 suspensión de microorganismos con una concentración 0.5 según la escala McFarland - 1 hisopo estéril - 1 Placa de Müeller Hinton elaboradas según normas de la CLSI pinza - 1 juego de monodiscos de AMB - 1 recipiente bolsa roja para descartar hisopo - 1 placa ya desarrollada con hs de incubación a 37 ºC - 1 regla milimetrada - 1 tabla de interpretación de halos 14

16 Área Injuria - Laboratorio de Habilidades a) Realice una prueba de sensibilidad antimicrobiana por la técnica de difusión en agar con monodiscos según la metodología de Kirby Bauer. b) Efectúe la lectura de los halos de inhibición c) Interprete dichos halos y elabore el informe con los datos aportados por el docente. Apellido /Nombre: Fecha: DNI: Material: Ubicación: Pruebas de sensibilidad antimicrobiana (Método Kirby Bauer) Microorganismo ensayado: Amicacina Clindamicina Nitrofurantoina Amoxicilina/Clauvulánico Cloranfenicol Norfloxacina Ampicilina Colistina/Polimixina Ofloxacina Ampicilina/Sulbactama Eritromicina Meticilina Cefalotina Ertapenem Penicilina G Cefepime Estreptomicina (alta carga) Piperacilina Ceftazidina Fosfomicina Piperacilina + Tazobactama Cefotaxima Gentamicina Quinupristin -Dalfopristin Cefoxitina Gentamicina (alta carga) Rifampicina Ceftriaxona Imipenem Teicoplanina Cefuroxima Levofloxacina Tetraciclinas Ciprofloxacina Linezolid Tigeciclina Meropenem Minociclina Trimetoprima/Sulfametoxazol Vancomicina 15