TITLE. Development of radioimmunoassay techniques for the measurement of protein hormones FINAL REPORT FOR THÜ PERIOD. 1 Nov October 1972

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1 BEPOHT NO. IAEA-H-814-F TITLE Development of radioimmunoassay techniques for the measurement of protein hormones FINAL REPORT FOR THÜ PERIOD 1 Nov October 1972 AUTHOri'(s) Aldo E.A.Mitta INSTITUTE Comisión Nacional de Energía Atómica Departamento de Química Buenos Aires Argentina INTERNATIONAL ATOMIC EKEHGY AGENCY DATE December 1972 I

2 PREPARACIÓN PH HORMONA LUTEINIZANTE (L.U) ' Iy DB ALTA ACTIVIDAD ESPECIFICA *> I.L.Dujovne, J.C.Cresto, H.Albani, G.N.de Nuñez, O.J,I)ogrosr.i 2 y A.E.A.Mitta RESUMEN Se describe -la marcación con radioyodo de hormona lutoinizante humana de alta actividad especifica para ser aplicada al radioinmunoensayo y a pruebas dinámicas "in vivo". SUMMARY The preparation of high specific activity L.H.JTon.iono 13Í I and ita application to radioinmunoassays and "in vivo' 1 testa are described..1 Hospital de Pediatría Pedro Elif.alde 2 Gerencia Investigaciones CN2A Ente trabajo se realizó con la ayuda del Contrato 814/P.I) del Organismo Internacional de Energía Atómica. <.

3 -2- INTKODUCCION' ] La técnica de radionmunoensayo para insulina, fue puesta a punto por Yallow y Berson a Pines del año 1959 (í). Siguieron otras hormonas tales como hormona del crecimiento humano (2), paratohormona (3), AGTII (3), etc; en distintos líquidos biológicos. Siguiendo el plan trazado por nosotros en 1969, on la Divi- ; si6n Moléculas Marcadas, Departamento de Química, Gerencia de Investigaciones de 3a Comisión Nacional de Energía Atómica, nos he-, mos ocupado de insulina (4), hormona del crecimiento humano (5),, hormona tiroestimulanto (6), hormona coriónica gonadotrófica (7) [ y hormona luteinizanto.. ; ] Bsto hormona (L.H. humana o de rata) Corma parte del grupo \ \ de gonadotrófinas y se marca con rad.ioyodo, con una actividad es-i peclfica de mci/mg. Para su preparación utilizamos la t6c-! nica de Greenwood y Hunter (8), y para la purificación sephadex. G 75. La hormona (L.H) fue cedida por el NIAMD (National Institute of Arthritis and Metabolicic Deseases, National Institute of Health). ' ' KBACTIVOS INa, libre de portador y reductor en solución 0.1 Pí de HONa, ph 8, concentración de actividad G00 mci/ml, 125 * 2.- ' IKa, libre de portador y reductor en solución 0.1 N de HONa, ph 8, concentración de actividad 300 mgi/ml, 3.- Solución reguladora de fosfato ile sodio (PO^jHgNa), 0.5 ajustada a pti ,- Solución de cloramina T (25 mg/10 mi de fosfato do 0,05 M, plí 7,5 ]recientemente preparada. 1

4 Solución de metabisulfito de sodio {25 mg/10 ml tíe fosfato de sodio 0.05 SI, ph 7.5) al igual que la anterior recientemente preparada. 6,- Hormona luteinizante (L.IÍ. humana o rata) provista por gentileza del NIAMD. 7,~ Albúmina humana Bohringwer&e 20%, MÉTODO DE MARCACIÓN Bn un tubo cónico do vidrio de 3 mi de capacidad cubierto 1 31 con ParaPilm, se introduce 1-2 mci INa o bien 700 a 900 uci 125 de I; Be añade 25 ul de solución reguladora de fosfp.to de sodio 0.5 M, pll 7,5 y 25 ul (5 ug) de hormona luteinizante (L.FI) di suelta en solución reguladora de fosfato de sodio 0,01 A, 0,15 M de ClKa y ph 7,5; 20 ul (50 us) de cloramina T, se agita segundos y se detiene la reacción por el agregado de 1 rol (125ug) de metasulfito de sodio, y finalmente se agregan 0.5 mi de albnr.iina humana al 1% PURIFICACIÓN Se realiza en una columna de vidrio de 50 cm de largo por 1,8 cm de diámetro, empaquetada con 8 gramos de Sophadex G 75, previamente lavada con solución reguladora de elución con albflmina al 1% y luego con la solución,.reguladora de elución, 'je introduce con cuidado el contenido del tubo de marcación, del que pvo-i! viarnente se ha sacado muestra para determinar el rendimiento de marcación, y se eluye con una solución reguladora do Posfato 0,05 \í, 0.15 M ClNa ph 7,5; la velocidad de elución es aproximndemente de 1 ni/ 3 minutos, la fracción activa fttil coiticnxn a s>alir a partir del tubo 35.

5 -4- CALCULO DEL RBNDIMIBNTO PS REACCIÓN Se realizó: a) Cromatoeloctroforesis: Se toma una alícuota de aproximadamente 5 ttl del tubo de reacción y se le agregan 5 ul de una solución de albúmina al 0.5% disuelta en veronal-acetato de sodio pit 8,6 que contiene además una pizca de azul de bromofeno.1 y azida sódica 0.04 %. Se siembra sobre una tira de papel Whatman 3 no cromatografico de 50 cm x 2 cm y se corre.durante 60 minutos en veronal sódico 0.05 M - acetato de sodio 0.15 M, ph S.C a no más de 300 Voltios, b) Por ITLC (placa delgada instantánea) Gelman SG, solvente: HC1 1 N, tiempo de corrida: 10 minutos, Rf II 131 I: 0,0; RP 131 I~: 1.0 CONTROL DB LOS ELUIDOS DB LA COLUMNA Se realiza sobre cada uno de los eluidos que se suponen fltiles (eluido 16 al 23 inclusive} y consiste en hacer una cromatoelectroforesis, en iguales condiciones que para el cálculo de ren dimiento. FRACCIONAMIENTO Y DISTRIBUCIÓN La hormona luteinizante se separa y envia congelada para su * uso dentro de las 24 horas de marcación, en alícuotas de uo i en solución de fosfato 0,05 M, 0.15 ftí de CINa y albúmina al l?s'corf azida sódica 0,04%, en un frasco de 15 mi de capacidad, colocado en un recipiente que contenga nieve carbónica para evitar el descongelamiento. Los especipicaciones bajo las cuales se onvia son:

6 -5- Actividad Especifica: mci/mg para L.H. I mci/mg para L.H. I Volumen: 2 3 ml Daño: 5-10 % Actividad Total: uci DETERMINACIÓN PS L.H. POR RADIOINMUNOEKSAYO Se comenzaron los ensayos para la determinación radioinmunologica de hormona luteinizante humana. Para ello se empleo la técnica del doble anticuerpo adaptándose, con ciertas inodificacio nes, el método original de Morgan y Lázaro» para valoración de insulina (9). Los reactivos y soluciones empleados fueron los siguientes: Solución reguladora de Albúmina: Solución reguladora de borato ph con í% de albúmina bovina. 131 L.H. I: Se empleó para marcar el LBR 960 (provisto por N.I.A.M.D.). Suero anti-l.h,: Se empleó suero de cobayo anti-l.h, provisto por el N.I.A.M.D. Suero anti-gamma globulina de cobayo: Se utilizó suero de conejo ant.i gamma globulina de cobayo para provocar la reacción precipitante. Resultados obtenidos *' En la figr 1 se ilustran los resultados obtenidos en el estudio de la velocidad de reacción del suero anti~l.ii, en nuestro sistema de determinación. Se empleó una dilución Pija do suero 131 anti-l.h. (1/ ) y 50 uag de I.H. ' I como trazador.

7 -6- En todos loa tubos so completó el volumen final a 1 mi y se incubó a 4 C durante 1, 2, 3, 4, 5 y 6 dias, Al cabo de la incubación se agregó el segundo anticuerpo (O»2 ml/tubo). 8e incubó 48 horas mas y luego se centrifugó 20 minutos a 3000 rpm para separar la fracción precipitada y sobrenadante. Para calcular el porcentaje de precipitación en cada muestra se sustrajo el valor del blanco (sin suero nnti-l.u.). En la fig. 1 se observa que el equilibrio de reacción se alcanza a los tres dias de incubación y permanece prácticamente "sin variaciones hasta el sexto día. En una segunda experiencia se efectuó la titulación del suero anti-l.h. ensayando diluciones crecientes desde 1/20000 a 1/320CC La incubación con el primer anticuerpo se hizo durante cinco dias a 4 G y con el segundo 48 horas. Los resultados obtenidos se ilustran en la figura 2,

8 -7- BIBLIOGRAFIA 1 R.S.YALLOW y S.A.BERSON - Nature 184, 1648 (1959) 2 R.D. UTIGBR., M.L.PARKER y L.ü.DAUGHADAY - J. Clin. Invest. 40, 1086 (1961) 3 S.A.BERSON, R.S.YALLOW, G.D.AURBACH y J.T.POTTS (Jr.) - Proc. Sat. Acad. Sc. 4, 613 (1963) 4 II.ALBANI, J.C.CRBSTO, G.N.de NUNEZ y A.E.A.MITTA, presentado al III o Congreso de ALASBIMN - México 1970.* 5 J.C.CRESTO, H.ALBANI, O.J.DEGROSSI y A.E.A.MITTA - presentado a la Sociedad Argentina de Biología y Medicina Nuclear,para optar al Premio J.Várela {1971} 6 M.BARMASCH, G.N.de NUÍÍE2, N.ALTCHULER y A.E.A.MITTA,- a publicar. (1971) 7 A.TEMPONE, L.B.QUIIIILLALT, L.ARRIDHI y A.B.A.MITTA - presentado al II o Congreso de la Sociedad Argentina de Biología y (Medicina Nuclear - San Martin do los Andes - Octubre F.C.GREENHOVD, W.M.HUNTER y J.S.GLOVER - Biochem. J, 9, 114 (1963) 9 J.C.CRBSTO, I.L.DUJOVNB, H.ALBANI, O.J.DBGROSSI y A.E.A.MITTA o publicar (1971).

9 ... t. t..., *--. } I ~r"*{ * ;-'-- =rf-;:r.-=ns - : "^á :, j- : :-., / -r- Í ;:.;! t^,:>>ftj^ es?qr=?=,75, : : -: i air^^lziti::! : "! : : :. ; jt;. : z 0 ü i F a: O lü D W :;.; I- -:- -r '.. m r ;:^^i:^^r r ^ i - J ^ j ^ i ^ ; : 1 " ".-,.,..-; j T

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11 PREPARACIÓN DE EUC.G. (HORMONA CORIONICA GONADOTKOFIC CON 131 I PB ALTA ACTIVIDAD ESPECIFICA PARA SU APLICACIÓN EXPERIMENTAL Y CLÍNICA A.Tempone, L.E.Quihillalt, L.Arrighi y A.B.A. Mitta RESUMEN Se describe la preparación de hormona coriónica gonado- 131 trófica, marcada con I, de alta actividad especifica, mci/mg, y los ensayos tendientes a demostrar la integridad de la misma. SUMMARY The preparation of high specific activity corionic 131 gonadotrophin hormone I ( mci/mg) is described. Tests for determination of purity are accomplished. INTRODUCCIÓN La obtención de hormonas de estructura polipeptídica,marcadas con radioyodo con alta actividad especifico,sin alterar eus propiedades bioinmunológicas, permitió el desarrollo de la valoración de concentraciones hormonales en líquidos biológicos. De esta manera se desarrolló la metodología para determinar insulina, glucagón, paratohormona, hormona del crecimiento " humano, etc. (1,2,3,4). Para el empleo de hormonas proteicas mediante el método radiointnunológico e6 condición indispensable, que luego de la marcación y purificación, estas conserven su comportamiento inmunológico inalterado. 1 Facultad de Medicina -. 2 Gerencia de Investigaciones - CNGA vv- del O.I.B.A. Este trabajo se realizó con ayuda del Convenio 814/RB,-t

12 '? la hormona coriónica gonadotr6fica *I (5), so obtiene con una actividud especifica entre mci/mg, de acuerdo con la técnica de Greenwood y Hunter {6 y 7). La purificación de la hormona marcada se realiza utilizando una columna de sephadex G-75, La H.C.G. (Hormona Coriónica Gonadotrófica) y el antisuero correspondiente fueron provistos por el Profesor Piero Donini Eabq-ratorios. Serono-IJoma Italia. PARTS EXPERIMENTAL Técnica de Marcación En una celda de reacción protegida con papel Para film', se han colocado 20 ul (5 úg) de hormona coriónica gonadotrófica (H.G.G) disuelta en solución tampon fosfato 0.05 M a ph,7,5; 131 7,ul (2 mci) de INa sin portador ni reductor de alta concentra cifin de actividad (300 mci/ml) prpvistfo por.. New England Nuclear, 25 til de 6oluci6n tampon de fosfato, 0,5 M, ph 7,4 para tamponear el medio. Luego se agrega como agente oxidante 20 ul (40,ug) de Cloramina T en solución tampon de fosfato O.05 M a ph 7,.5, La reacción se detiene por agregado de 100 ul (120 ug) de metabisul '' : fito de sodio disuelto en la misma solución tampon* Ambas soluciones deben ser recientemente preparadas. Se agregan luego 200 ul de ipduro de-, potasio al 1%, Bl 'volumen final es aproximadamente de 400 ul y la actividad total se mide en una cámara de ionización Mediae mod, 6362., de Nuclear Chicago. Purificación El contenido del tubo, se coloca sobre una columna de Sephadex G-75 de 20 cm de largo por 1 cm de diámetro previamente saturada con solución de albúmina al 1# en solución de veronal* veronal sódico 0 l M,a ph,8,6._ Luego de la elución con dicha solución tampon, pero sin albúmina, se obtienen dos "pico6 de actividad».

13 La fracción quo contieno la hormona marcada comienza a salir de la columna a partir <lel tercer tubo cuando se colecta 1 mi por tubo, siempre que se halla cumplido con un correcto empaquetamiento de la misma y cuyo flujo es aproximadamente de 15 ml/h. Calculo de la actividad especifica El calculo de la actividad especifica puede hacerse por diferentes métodos: a) Medición de la radiactividad de*'las fracciones y material utilizado, b) Croinatoe1.eetroforesis; se hace según el método de Yallow y Tierson (3). Una alícuota de la mezcla do reacción en albúmina humana al 1%, se coloca sobre tiras de papel Wathman 3 MM, de 4 cm de ancho y 50 cm do largo, embebidas en solución tarnpón 'veronal-veronal sódico a pt! 8,6; se corren durante 1 h 3O min, usan do un gradiente de 10 V/cm, Las tiras fueron valoradas por planimetría de los registros. obtenidos en un.radioscnnner Packard, modelo Comportamiento dg la II.C«G. 1^ 1.- Químico: La pureza de la hormona obtenida, se controla mediante cromatoelectroforesis de una alícuota de las fracciones de elución, 2.- Inmunológico: Frente a un a-ntisuero (Anti^II.C.G) se colocó H.C.G. X, obteniéndose un 5?% de unión entre ambos, detectadomediante el sistema de doble anticuerpo.(10).

14 -,-\ ' * ~4 Comportamiento del An ti-h.c.o. Se realizó inmunoelectroforesis de H.C.G. altamente purificada fronte al antisuoro utilizado en el presento trabajo. Se observó una sola banda do precipitación, comprobándose asi su especificidad, ya que frente a otras hormonas proteicas, salvo la hormona luteinizante (L.II), no se Pormó banda do precipitación. 1 ícf»#j ( Elección de dilución óptima dol antisuero Se realizó frente a la hormona colocando diluciones crecientes desde 1/^000 hasta 1/ La zonn óptima de''trabajo se encontró entre 1/12000 y 1/lfiOOO. Curva competitiva radioinmunojógica Se usó el método del doble anticuerpo (9 y 10); para ello 333 se requiero H.C.G I, euero de conejo Anti-H.C.G y como agente precipitante suero de oveja anti-gama globulina de conejo. Dadas las condicones y trabajando con el mismo antisuero,j.a magnitud de 131 la reacción Anti-H.C.G; H.C.G y H.C.G I, dependerá del antiduero y de la concentración del antlgeno. I.a cantidad de antigeno en todos los ensayos fue de 25 nanogratnos como concentración inicial de curva standard. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos, permiten utilizar esta hormona para aplicarla en estudios "in vivo" «."in vitro".. t

15 " O " " RIRI.TOGKAFIA 1 - R.íi.YALLOW y S.A.BERSON - J.Clin. Invest. jj9, (1960), R.H.UNGES, A.M.EIS3NTEAUT, M.S.MC CALL y L.L.MADISON - J.Clin. Invest. 40, (1<K»3), S.A.BEKSON, R.^.YALLOW, G.D.ALTRBACH y J.P.POTS ( r) - Proc. Nat.Acad.Sc. 49, (19GS), fi] R.D.UTIGER,,M.L.PARKER y W.H.DAUGUADAY - J.Clin. Invest. 40, (3903), W.R.BUTT - Acta Bndocrinológica Suppl, 14$, (19fi9), W.M.HUNTER y F.C.GREENWOOD - Nature 194, (1962), F.C.GREENWOOD, W.M.HUNTER y J.S.GLOVER - Biochem.J. 89, (1963) R.S.YOLLOW y S.A.BER30N - J.Clin,Invest. 40, (1961), K.S.KIRKHAM y W.H.HUNTER - Radioinmunoassay Methods; od. Churchill Livingstone, Edinburgh and London (1971) íí.dcntni, I.D'ALE.^.TIO y P.DONINI - Gonadotropina.cl968, ed. B. Rosemhorg Geron - Los Altos-California, pag. 263.