UNIVERSIDAD MAYOR FACULTAD DE MEDICINA. LABORATORIO DE Bioquímica

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1 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA UNIVERSIDAD MAYR arrera de Enfermería LABRATRI DE Bioquímica 2010 Profesora: Maribel Arnes.

2 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Laboratorio N 1 PRPIEDADES FÍSIAS Y QUÍMIAS DE LS IDRATS DE ARBN I.- Introducción A) Solubilidad Es indudable que las propiedades físicas (el estado físico, viscosidad, conductividad térmica y eléctrica, solubilidad, etc.) de los diversos tipos de sustancia es consecuencia de su estructura. La experiencia indica que son numerosos los procesos químicos que tienen lugar en solución. Incluso las reacciones bioquímicas de gran importancia tienen lugar en solución, siendo el agua el disolvente por excelencia. Una solución es un sistema homogéneo, constituido por dos o más componentes. Se entenderá por un sistema homogéneo, aquel en que las propiedades y la composición son idénticas en todo el sistema. omo esta definición no restringe en modo alguno la naturaleza de las sustancias requeridas, se pueden considerar seis tipos fundamentales de solución, dependiendo del estado (sólido, líquido, gaseoso) de los componentes de la disolución (tabla Nº1). Siendo, las soluciones más interesantes las sólido-líquido y líquido-líquido. Tabla Nº1: Tipos de soluciones omponente 1 omponente 2 Ejemplo Gas Gas Aire Gas Líquido Agua mineral Gas Sólido 2 en paladio Líquido Líquido Etanol en agua Sólido Líquido Suero fisiológico Sólido Sólido Soldadura (Estaño-plomo) ay tres factores básicos que afectan la solubilidad, y estos son: La presión La temperatura La naturaleza del soluto y del solvente. La Ley de enry establece que la solubilidad de los gases en líquidos aumenta a medida que se incrementa la presión a temperatura constante. Del mismo modo, al aumentar la temperatura y mantener la presión constante la solubilidad de un gas disminuye. Las soluciones líquido-líquido y sólido-líquido no se ven afectadas por la presión, sin embargo, la temperatura es un factor relevante en estas soluciones, debido a que si la reacción es endotérmica la solubilidad aumenta al ascender la temperatura, en caso contrario, cuando el proceso es exotérmico la solubilidad disminuye al ascender la temperatura. onocer la naturaleza química del soluto y del solvente es fundamental, pues le permite predecir la solubilidad de una sustancia. uando la naturaleza del soluto y del solvente es de polaridad similar (sus estructuras son semejantes), se dice que las sustancias son solubles, en caso contrario son insolubles. Por ejemplo, etanol y agua son completamente solubles en toda proporción (miscibles), ambos son polares; benceno y agua son insolubles en toda proporción (inmiscibles), el benceno es apolar y el agua es polar.

3 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Para conocer la polaridad de un compuesto se prueba su solubilidad en diferentes solventes tales como agua (polar), acetona (polaridad intermedia) y éter de petróleo (apolar). Una vez establecido su grado de solubilidad, mediante la regla lo semejante disuelve lo semejante se puede a través de la siguiente tabla obtener la polaridad de una determinada sustancia. ompuesto Solubilidad en agua (polar) Solubilidad en acetona (polaridad intermedia) Solubilidad en éter de petróleo (apolar) Polaridad del compuesto A Soluble Insoluble Insoluble Polar B Insoluble Insoluble Soluble Apolar Soluble Soluble Insoluble Medianamente polar D Insoluble Soluble Soluble Medianamente apolar E Soluble Soluble Soluble Intermedia F Insoluble Insoluble Insoluble Indeterminada Algunas reglas para la solubilidad de compuestos orgánicos en agua. 1. La presencia de más de una unidad polar en un compuesto incrementa su solubilidad. 2. Los compuestos orgánicos con cadenas ramificadas tienen mayor solubilidad que su contra parte de cadena lineal. 3. ualquier grupo funcional capaz de formar puente de hidrógeno con el agua, si constituye la interacción intermolecular predominante del sistema, tiende a ser soluble en agua. 4. La presencia de cloro, aunque le da un carácter levemente polar al enlace -l, no le otorga solubilidad en agua al compuesto. Así, compuestos como el diclorometano ( 2 l 2 ), cloroformo (l 3 ) y tetracloruro de carbono (l 4 ) son solventes apolares típicos para la extracción de compuestos orgánicos. B) idratos de arbono Los hidratos de carbono se conocen comúnmente como azúcares o sacáridos por su sabor dulce. Químicamente, se trata de aldehídos o cetonas polihidroxilados, cuya fórmula empírica general puede expresarse como ( 2 ) n. Por ejemplo, cuando n=6 la fórmula molecular es Los hidratos de carbono, constituyen uno de los grupos más importantes de sustancias orgánicas de origen natural. Figuran entre los compuestos más abundantes de plantas y animales, en los que desempeñan variadas funciones: i) constituyen una fuente importante de energía. ii) forman parte de los tejidos de sostén de las plantas y de algunos animales, por ejemplo la madera, el almidón, el algodón, el esqueleto estructural de los ácidos nucleicos ARN y ADN, el azúcar de mesa, etc. Existen varios conceptos que permiten clasificar a los hidratos de carbono. Una clasificación clásica se basa en el número de unidades simples de azúcares que lleva una molécula, así tenemos:

4 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Monosacáridos: son los hidratos de carbono que no pueden hidrolizarse para dar moléculas más pequeñas, es decir, no se encuentran enlazados a otros hidratos de carbono y por lo tanto, son los azúcares más simples Glucosa Fructosa ligosacáridos: Uno de los oligosacáridos más importantes son los disacáridos, debido a su abundancia en la naturaleza. Los oligosacáridos son aquellos hidratos de carbono que por hidrólisis dan como resultado entre 2 a 10 unidades simples de azúcares o monosacáridos. Los monosacáridos se encuentran unidos por un enlace glicosídico, es decir, un puente de oxígeno. 2 2 Sacarosa 2 2 Maltosa 2 (,) Polisacáridos: Son hidratos de carbono que por hidrólisis se obtienen como producto más de 10 unidades de monosacáridos. 2 2 n Amilosa en: Los monosacáridos pueden clasificarse según el número de átomos de carbono que contenga * Triosas: son aquellos hidratos de carbono que poseen 3 átomos de carbono. * Tetrosas: son aquellos hidratos de carbono que poseen 4 átomos de carbono. * Pentosas: son aquellos hidratos de carbono que poseen 5 átomos de carbono. * exosas: son aquellos hidratos de carbono que poseen 6 átomos de carbono.

5 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Además si los monosacáridos contienen un grupo funcional aldehído, se conocen como aldosas y si contienen un grupo funcional cetónico se conocen como cetosas. Así un monosacárido puede, tomar cualquiera de los siguientes nombres: aldopentosa, aldohexosa, cetopentosas, cetohexosa, etc Aldohexosa etohexosa La D-glucosa, es el monosacárido más importante, se llama en ocasiones azúcar sanguíneo (porque se encuentra en la sangre y en otros fluidos corporales) o azúcar de uva, porque se encuentra presente en esta fruta. Es el componente principal de muchos oligosacáridos y polisacáridos. El monosacárido D-fructosa, es fácilmente convertida a D-glucosa en el cuerpo, es un compuesto de sabor más dulce entre todas las azúcares. Se encuentra en las frutas y en la miel, así como en la sacarosa. La sacarosa, el azúcar de mesa, es un disacárido compuesto de D-glucosa y D-fructosa, se obtiene de la remolacha y de la caña de azúcar, siendo uno de los principales productos orgánicos industriales. La lactosa, es el azúcar de la leche, es un disacárido compuesto de D-galactosa y D- glucosa, es utilizado en alimentos infantiles y en la leche malteada. La celulosa es el compuesto orgánico más abundante de la tierra. Las hojas secas contienen 10 a 20 % de celulosa, la madera un 50% y el algodón un 90%. La celulosa es un polisacárido de hasta unidades de D-glucosa, que se agrupan en haces torcionados, a modo de lazos, sujetos por puentes de hidrógeno. El almidón es el segundo polisacárido más abundante, está constituido por unidades de D- glucosa, al ser triturado y tratado con agua caliente, se divide en dos fracciones principales según su solubilidad : amilosa (soluble), que constituye el 20% y la amilopectina (insoluble) que forma el 80% restante. El glucógeno es un polisacárido utilizado como reserva de glucosa, sobre todo en el hígado y en los músculos de los mamíferos. Los monosacáridos y disacáridos son sólidos o líquidos con aspecto de jarabe, de sabor dulce, son solubles en agua e insolubles solventes no polares o apolares. Los polisacáridos poseen propiedades similares, pero generalmente son insolubles en agua debido a su alto peso molecular. La química de estos compuestos esta relacionada directamente con los grupos carbonilos e hidroxilos presentes en estas moléculas. Pudiendo ocurrir reacciones intramoleculares como intermoleculares. En solución acuosa, el grupo carbonilo en el carbono uno y los grupos hidroxilos en los carbonos cuatro y cinco de los monosacáridos reaccionan en forma intramolecular para dar hemiacetales o hemicetales cíclicos, que justifica muchas propiedades interesantes de estos compuestos. La forma hemiacetálica o hemicetálica con anillo de 5 miembros se llama furanosa, por analogía con el furano. De modo similar, la forma hemiacetálica o hemicetálica de seis miembros se denomina piranosa, por analogía con el pirano.

6 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Furano Furanosa Pirano Piranosa Ejemplos: Fructosa Glucosa 1 La estereoquímica de la forma cíclica de los azúcares se representa por la estructura de aworth. 2 α-d-glucopiranosa Estructura aworth 2 Glucosa Estructura Fischer 2 β-d-glucopiranosa Estructuraaworth 2 2 α-d-fructofuranosa Estructura aworth 2 2 Fructosa EstructuraFischer 2 2 β-d-fructofuranosa Estructura aworth De la figura anterior se puede observar que hay dos formas posibles para cada uno de los azúcares (D-glucosa y D-fructosa) que se denominan α y β. Esto se debe a que al pasar de la forma de cadena abierta a la cadena cerrada se introduce un nuevo carbono asimétrico ( 1 de las aldosas y 2 de las cetosas), llamado carbono anomérico. Los anómeros son azúcares que sólo se diferencian en su estereoquímica del carbono hemiacetálico y carbono hemicetálico (carbono anomérico). Muchos azúcares, al igual que los aldehídos simples, reaccionan frente a los reactivos de Tollens, Benedict o Fehling (agentes oxidantes en medio básico). Los azúcares susceptibles de ser oxidados por estos reactivos se denominan azúcares reductores. Las formas hemiacetálicas y hemicetálicas cíclicas de todas las aldosas y cetosas, respectivamente se oxidan con gran facilidad porque están en equilibrio con la forma de cadena abierta. A diferencia de los hemiacetales o hemicetales, un acetal o cetal es estable en soluciones básicas, por lo tanto, no son susceptibles de ser oxidados, porque las formas acetálicas o cetálicas cíclicas no están en equilibrio con su cadena abierta.

7 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Las formas hemiacetálicas y hemicetálicas de cadena cerrada de los azúcares pueden reaccionar con los alcoholes para formar acetales o cetales. En la química de los azúcares, estos acetales o cetales se llaman glicósidos β-d-glucopiranosa Metanol Metil-β-D-glucopiranósido 2 El enlace éter entre el hidroxilo del azúcar y el alcohol es un enlace glicosídico Enlace glicosídico arbono acetálico (carbono anomérico) Los monosacáridos componentes de los disacáridos y polisacáridos están unidos mediante enlaces glicosídicos (enlace éter o puente de oxígeno). uando los carbonos anoméricos forman un enlace glicosídico, es decir, no existe carbono hemiacetálico o hemicetálico, el azúcar es no reductor. Pero cuando, a lo menos uno de los carbonos anoméricos queda libre, es decir, en su forma hemiacetálica o hemicetálica, es un azúcar reductor Sacarosa 2 Maltosa (,) Enlaces Glicosídicos Una vez que el grupo hidroxilo del carbono anomérico de un azúcar se ha unido para formar un acetal o cetal, no está libre para pasar de la forma de cadena cerrada a cadena abierta y, por lo tanto, el azúcar es no reductor. Por ejemplo, la sacarosa es un azúcar no reductor porque ambos carbonos anoméricos forman un acetal y cetal respectivamente.

8 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Acetal (arbono anomérico) Sacarosa etal (arbono anomérico) Mientras que la maltosa es un azúcar reductor porque tiene a lo menos uno de sus carbonos anoméricos libre Acetal (arbono anomérico) Maltosa arbono anomérico libre El enlace glicosídico puede romperse por reacciones de hidrólisis (ruptura de una molécula por acción del agua). La hidrólisis química de los azúcares se puede realizar calentando la solución acuosa del azúcar usando como catalizador un ácido. En los sistemas biológicos las enzimas actúan como catalizadores Sacarosa Glucosa Fructosa La sacarosa es un disacárido formado por una unidad de glucosa y una unidad de fructosa. La unidad de glucosa es un acetal cíclico y la unidad de fructosa es un cetal cíclico. Ninguna de estas unidades puede estar en equilibrio con su cadena abierta, por lo tanto, la sacarosa es un azúcar no reductor que no reacciona con el reactivo de Fehling. Sin embargo, al realizar la hidrólisis de este azúcar se obtienen las dos unidades de monosacáridos con sus respectivos carbonos anoméricos libres, los cuales pueden ser susceptibles de ser oxidados y darán respuesta positiva frente al reactivo de Fehling. 1) Test de Molisch Este test es de reconocimiento general, es decir, reconoce todos los hidratos de carbono o azúcares. Está basado en la deshidratación de estos azúcares, por ácido sulfúrico a furfural y sus derivados, los cuales son condensados con α-naftol y subsecuentemente son oxidados. uando la reacción es positiva se observa la presencia de un anillo violeta. EL α-naftl ES TÓXI Y ARINÓGEN, TRABAJE N UIDAD!!

9 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA 2) Reacción de Fehling onsiste en una solución alcalina de sulfato de cobre. Es un agente oxidante inferior al reactivo de Tollens (necesita calor), reacciona sólo con azúcares reductores. uando la reacción es positiva se observa un precipitado de color rojo ladrillo. 3) Test de Barfoed onsiste en una solución ácida de acetato de cobre (II). De acuerdo a la velocidad de reacción, permite diferenciar entre monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. uando la reacción es positiva aparece un precipitado rojo al calentar en baño de agua. Los monosacáridos dan reacción positiva entre los 2 y 5 minutos. Los disacáridos dan reacción positiva entre los 10 y los 30 minutos. Los polisacáridos no dan reacción positiva, es decir, N..R. 4) Test de Seliwanoff Es similar al reactivo de Molisch, con la diferencia que se utiliza un agente deshidratante más suave que el ácido sulfúrico (l 6 M). Las α-hidroxicetosas se convierten fácilmente a la forma furanosa deshidratada, mientras que las aldosas requieren de una β eliminación antes de la conversión a furfural o furfural sustituido. Las cetosas dan reacción positiva al calentar por 2 minutos, la aparición de un color rojo corresponde a una cetohexosa y el color verde a una cetopentosa; mientras que las aldosas requieren de horas de calentamiento para reaccionar, observándose la aparición de un color anaranjado cuando es una aldohexosa y un verde limón cuando es una aldopentosa. II.- bjetivos Reconocer propiedades físicas de los hidratos de carbono. Reconocer propiedades químicas de los hidratos de carbono. Identificar a través de reacciones sencillas la presencia de: Monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Aldosas y cetosas. Azúcares reductores. Identificar una Muestra problema, señalando las características físicas y químicas que ésta presenta.

10 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA III.- Parte Experimental 1.- Propiedades Físicas: Solubilidad a) oloque en un tubo de ensayo limpio y seco, una puntita de espátula de cada uno de los siguientes hidratos de carbono: Tubo 1: glucosa Tubo 2: fructosa Tubo 3: sacarosa Tubo 4: almidón b) Agregue a cada tubo 3,0 ml de agua destilada, agite y observe. c) Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla. d) Repita el procedimiento con los siguientes solventes: acetona y éter de petróleo idrato de carbono ( 1 puntita de espátula) glucosa Agua dest. (3,0 ml) Acetona (3,0 ml) Éter de Petróleo (3,0 ml) Polaridad de la muestra fructosa sacarosa almidón 2.- Propiedades Químicas a) Reacción de Molisch: En distintos tubos de ensayo coloque una punta de espátula de cada una de las muestras de azúcares, agregue 0,5 ml de agua destilada y agite hasta disolver. Luego adicione 2 gotas de una solución de α-naftol al 10% p/v (Reactivo de Molisch), agite nuevamente, incline el tubo en 45º y agregue por la pared del tubo 20 gotas de ácido sulfúrico concentrado, de manera que el ácido forme una capa debajo de la solución acuosa (N AGITE LA SLUIÓN). bserve inmediatamente lo que ocurre en cada caso. b) Reacción de Barfoed: En distintos tubos de ensayo coloque una punta de espátula de cada una de las muestras de azúcares, agregue 0,5 ml de agua destilada y agite hasta disolver. Agregue 1,0 ml del reactivo de Barfoed, agite, caliente en un baño de agua a ebullición y observe. c) Reacción de Seliwanoff: En distintos tubos de ensayo coloque una punta de espátula de cada una de las muestras de azúcares, agregue 0,5 ml de agua destilada y agite hasta disolver. Agregue 2,0 ml del reactivo de Seliwanoff, agite, caliente en un baño de agua a ebullición por dos minutos y observe. d) Reacción de Fehling: En distintos tubos de ensayo coloque una punta de espátula de cada una de las muestras de azúcares, agregue 0,5 ml de agua destilada y agite hasta disolver. Agregue 2,0 ml de una mezcla de iguales volúmenes de Fehling A y B, agite bien, coloque por 2 minutos en un baño de agua caliente y observe. Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla.

11 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA idrato de carbono (+ 0,5 ml de 2 ) glucosa Molisch 1 : 2 gotas de Molisch 2 : 0,5 ml de 2 S 4 Barfoed (1,0 ml) Seliwanoff (2,0 ml) Fehling (2,0 ml) Tipo de compuesto fructosa sacarosa almidón 3.- Muestra Problema Pida a su profesor una Muestra Problema y, a través de las reacciones que usted aprendió en este laboratorio, determine la naturaleza física y química de su muestra.

12 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Laboratorio N 2 PRPIEDADES QUÍMIAS DE LAS PRTEÍNAS I.- Introducción A) Proteínas Las proteínas son moléculas de gran tamaño que se encuentran en todos los organismos vivos. Existen diferentes tipos de proteínas las cuales cumplen distintas funciones biológicas. Así, por ejemplo, la queratina de la piel y las uñas la fibroína de la seda y de las telarañas, el colágeno de los tendones y de los cartílagos, son todas proteínas estructurales; la insulina que regula el metabolismo de la glucosa en el cuerpo, es una proteína hormonal; y el ADN polimerasa y la inversotranscriptasa, actúan como catalizadores biológicos de las reacciones químicas en las células son proteínas llamadas enzimas. Sin importar su aspecto o su función todas las proteínas son químicamente similares puesto que todas están constituidas por muchas unidades de aminoácidos. Los aminoácidos son moléculas bifuncionales, contienen un grupo amino (básico) y un grupo carboxílico (ácido). 2 N R Los aminoácidos se unen a través de un enlace amida o enlace peptídico. Resulta un dipéptido cuando se forma un enlace amida entre el grupo amina de un aminoácido y el grupo carboxílico de otro aminoácido; un tripéptido resulta de la unión de tres aminoácidos vía dos enlaces peptídicos, y así sucesivamente. Ejemplo: Pentapéptido 2 N N R N N R N R R R Enlaces Peptídicos Se han identificado 20 α- L-aminoácidos en las proteínas en donde la estructura de los aminoácidos sólo difieren en la naturaleza del grupo de la cadena lateral (R). Dependiendo de la naturaleza de la cadena lateral los aminoácidos se pueden clasificar en: a) aminoácidos polares b) aminoácidos apolares c) aminoácidos ácidos d) aminoácidos básicos Todos los aminoácidos son necesarios para la síntesis de proteínas, pero el ser humano sólo es capaz de sintetizar 10 de ellos, los otros 10 aminoácidos esenciales deben ser adquiridos por ingestión, es decir, como parte de la alimentación.

13 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Desde el punto de vista químico, las proteínas son polipéptidos de elevado peso molecular, cuya estructura presenta varios niveles. La más básica o estructura primaria de una proteína corresponde a la secuencia de aminoácidos de la que está constituida (enlaces peptídicos). La estructura secundaria está referida a la forma regular en que están orientados los segmentos del esqueleto peptídico en el espacio formando espirales, hojas o esferoides compactos. La estructura terciaria es la forma en la cual la molécula entera de la proteína está enrollada para asumir su configuración tridimensional global y la estructura cuaternaria describe la forma en que se agrupan varias moléculas de proteínas para formar grandes agregados estructurales. Las proteínas se clasifican como fibrosas o globulares, dependiendo de sus estructuras secundarias y terciarias. Las proteínas fibrosas son fuertes, rígidas e insolubles en agua, y en consecuencia, participan como los principales componentes estructurales de tejidos animales, por ejemplo, la α-queratina, el colágeno, la miocina, etc. Las proteínas globulares son solubles en agua, tienen forma casi esférica y son móviles dentro de las células, por lo tanto, presentan una variedad de funciones que tienen relación con la mantención y regulación del proceso de la vida, por ejemplo, la insulina, anticuerpos, albúmina, hemoglobina, etc. En ciertas condiciones y frente a ciertos reactivos químicos se puede destruir la actividad biológica y la naturaleza de una proteína, sin romper los enlaces peptídicos. Esto se conoce como denaturación. Estructuralmente, la denaturación es una desorganización de la proteína al destruirse las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias si las hay. El calor, la radiación UV, los solventes orgánicos, los ácidos y bases fuertes, los detergentes o la agitación fuerte rompen los enlaces por puentes de hidrógeno que mantienen la estructura de la proteína, y se produce la denaturación. Las sales de metales pesados (g +2, Ag +, Pb +2 ) precipitan la proteína combinándose con los grupos -S, produciendo también la denaturación. La mayoría de las denaturaciones son irreversibles, por ejemplo el huevo no recupera su forma original cuando disminuye la temperatura y la leche cuajada no vuelve a hacerse homogénea. Sin embargo, se han encontrado muchos casos en los cuales ocurre una renaturación espontánea, este es el caso de las enzimas. Existen varios test de reconocimientos para proteínas, siendo los más utilizados los que se señalan a continuación: 1) Reacción de Biuret Reconoce compuestos con dos o más uniones peptídicas y es una prueba general para identificar la presencia de proteínas. uando la reacción es positiva se observa un cambio de color celeste (color del reactivo de Biuret) a lila o morado claro. 2) Test de Azufre Reducido Este test detecta proteínas con un alto contenido de azufre. uando la reacción es positiva se observa que la solución de proteína se torna de color café. 3) Test Xantoproteíco Detecta anillos bencénicos que contienen grupos amino (N 2 ) o hidroxilo (), los cuales son fácilmente nitrados para dar compuestos de color amarillo, ácido xantoproteico.

14 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA B) Lípidos Los lípidos son moléculas orgánicas naturales, que se aíslan de células y tejidos por extracción con solventes orgánicos no polares. Los lípidos se definen por propiedades físicas (solubilidad) más que por su estructura molecular. Debido a que generalmente tienen grandes porciones de hidrocarburos en sus estructuras, los lípidos son insolubles en agua, pero solubles en solventes orgánicos apolares. Los lípidos más abundantes hallados en los organismos vivos son derivados del glicerol. Las grasas y aceites son triesteres del glicerol, es decir, triacilgliceroles (denominados a menudo triglicéridos). Las ceras son mezclas de ésteres y de ácidos carboxílicos (ácidos grasos) y alcoholes de cadena larga. Los terpenos son moléculas orgánicas relativamente pequeñas con una inmensa diversidad de estructuras; algunos son hidrocarburos, otros contienen oxígeno; algunos son de cadena abierta, otros contienen anillos. Los fosfolípidos son ésteres mixtos de glicerol en los que uno de los grupos hidroxilos del glicerol está esterificado con un resto de ácido fosfórico. Los esfingolípidos son derivados del amino glicerol, muy relacionados con los fosfolípidos. Debido a la diversidad de estructuras químicas que son incluidas en los lípidos, las funciones que ellas tienen son también múltiples. Así, por ejemplo, las ceras protegen la piel, el pelo y las plumas haciéndolas flexibles e impermeables. Un ejemplo, es la cera de abeja cuyo principal componente es el hexadecanoato de triacontilo. Los fosfolípidos se encuentran formando parte de la membrana celular de tejidos de plantas y animales. Los esteroides, constituyen otro grupo importante de lípidos, se encuentran ampliamente distribuidos en los tejidos corporales y tienen una gran variedad de actividades fisiológicas. En el cuerpo humano la mayoría de los esteroides actúan como hormonas. Los monoterpenos y sesquiterpenos se encuentran principalmente en las plantas, pero los terpenos mayores se encuentran tanto en plantas como en animales. Por ejemplo, el lanosterol es el precursor de todas las hormonas esteroidales en la naturaleza, y el β-caroteno es una importante fuente de vitamina A que abunda en algunos vegetales. Las grasa animales y los aceites vegetales son los lípidos más abundantes. Aunque parecen diferentes, las grasas animales son sólidas y los aceites vegetales son líquidos sus estructuras guardan íntima relación. Químicamente, las grasas y los aceites son triacilglicéridos, es decir, triesteres de glicerol. Los triacilgliceroles ricos en ácidos grasos insaturados como los ácidos oleicos y linoleicos, suelen ser aceites; mientras que los ricos en ácidos saturados, como los ácidos esteárico y palmítico, suelen ser grasas. La hidrogenación, adición de hidrógeno a algún doble enlace presente en la cadena carbonada del ácido graso no saturado, convierte los aceites vegetales en grasas. 2 2 R R ( 2 ) 7 ( 2 ) 7 3 2, Presión alor 2 2 R' R' ( 2 ) ( 2 ) 7 3 R R' Aceites Grasas La hidrólisis de una grasa o un aceite con hidróxido de sodio acuoso (saponificación) produce glicerol y tres sales de ácidos grasos (jabón).

15 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA 2 2 R R' R'' Na Δ Na Na Na R R' R'' Triglicérido Glicerol Jabón Los jabones son mezclas de sales de sodio y potasio de ácidos carboxílicos de cadenas largas (ácidos grasos). Estos compuestos ejercen su acción limpiadora debido a que los dos extremos de la molécula son muy diferentes. En el agua dura (agua rica en cationes de Mg +2 y a +2 ), los carboxilatos de sodio (solubles) se convierten en sales de estos cationes (insolubles), lo cual ocasiona el percudido de la ropa blanca y el conocido depósito en forma de anillo en las bañeras. Los químicos han resuelto estos problemas sintetizando una clase de detergente basado en sales de ácidos alquilbencenosulfónicos de cadena larga. El principio por el cual operan estos detergentes es idéntico al principio de los jabones, sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en el caso de los jabones, los detergentes no forman sales insolubles de metales en el agua dura y no dejan el desagradable depósito. 3 ( 2 ) 16 Jabón - Na + 3 ( 2 ) 16 S Detergente - Na + II.- bjetivos Reconocer químicamente las proteínas. bservar experimentalmente el fenómeno de denaturación de una proteína. bservar experimentalmente algunas características de los lípidos. Presencia de insaturación en grasas y aceites. Diferenciar un jabón de un detergente sintético. III.- Parte Experimental 1.- Reconocimiento de Proteínas a) Reacción de Biuret: en cada tubo de ensayo limpio y seco, coloque 2,0 ml de solución de proteínas, adicione 2,0 ml de Na 3M, agite y agregue 2 gotas de reactivo de Biuret, agite nuevamente y observe. b) Test del Azufre Reducido: en cada tubo de ensayo limpio y seco, coloque 2,0 ml de solución de proteína agregue 2,0 ml de Na 6 M, caliente cuidadosamente a la llama por 15 segundos, agregue 5 gotas de solución saturada de acetato de plomo. Si no observa cambios, caliente la mezcla suavemente por 15 segundos.

16 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA c) Reacción del Ácido Xantoproteico: en cada tubo de ensayo limpio y seco, coloque 2,0 ml de una solución de proteína adicione 0,5 ml de N 3 concentrado con mucho cuidado, agite y observe. Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla. Proteína (2,0 ml) gelatina Biuret 1 : 2,0 ml de Na 3M 2 : 2 gotas de Biuret Azufre reducido 1 : 2,0 ml de Na 6M y Δ 15 seg 2 : 5 gotas de acetato de plomo (II) Xantoproteico (0,5 ml de N 3 conc.) albúmina 2.- Denaturación de una proteína a) Acción del calor: En un tubo de ensayo adicione 2,0 ml de una solución de albúmina caliente en un mechero a fuego suave hasta que hierva y observe. b) Acción de Metales Pesados: En un tubo de ensayo adicione 2,0 ml de una solución de albúmina. Agregue 10 gotas de solución saturada de gl 2 y observe. Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla. Proteína (2,0 ml) Acción del calor Adición de gl 2 (10 gotas) albúmina 3.- Insaturación de Lípidos En tubos de ensayo secos y limpios, disuelva separadamente con diclorometano cantidades equivalentes de ácido esteárico, ácido oleico y aceite de maravilla. BAJ AMPANA agregue 3 gotas de solución de Reactivo de Bromo y observe. Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla. Lípido (1 puntita de espátula ó una porción al fondo del tubo) ácido esteárico Diclorometano (2,0 ml) Diclorometano (2,0 ml) + Bromo (3 gotas) lasificación del lípido ácido oleico aceite de maravilla

17 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA 4.- Jabones y Detergentes Sintéticos a) En un tubo de ensayo disuelva una puntita de espátula de jabón en 5,0 ml de agua destilada. b) Separe esta solución (mezcla homogénea) en dos tubos de ensayo. c) A uno de los tubos de ensayo adicione 5 gotas de l 3,0 M. Agite y observe. d) Al otro tubo agregue 5 gotas de una solución saturada de al 2. Agite y observe. e) Repita el procedimiento utilizando detergente en vez de jabón. Registre todas sus observaciones en la siguiente tabla. Muestra jabón detergente l 3,0 M (5 gotas) Solución saturada de al 2 (5 gotas)

18 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Laboratorio N 3 ENZIMLGÍA I. - INTRDUIÓN La mayoría de las reacciones químicas que ocurren en los sistemas vivos, si siguieran sus propios mecanismos, ocurrirían demasiado lentas. Se requiere de catalizadores para que estas reacciones transcurran a velocidades que realmente sean útiles para la célula. En los sistemas biológicos, los catalizadores de dichas reacciones químicas son las enzimas. Qué es catálisis? Qué es lo que hace la catálisis? Para entenderlo, consideremos una reacción química simple: A + B + D Si la reacción ocurre sin interferencia, eventualmente, parecerá como si se detuviera. Lo que sucede realmente es que tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo en el mismo grado. Esto es lo que conocemos como equilibrio químico y podemos expresar su constante de equilibrio: Keq = [ ] [ D] [ A] [ B] Esta constante es característica de la reacción. Un catalizador aumenta la velocidad a la que la reacción se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio. tra propiedad importante de los catalizadores es que son muy efectivos en cantidades muy pequeñas, con respecto a las cantidades a catalizar. La inética Enzimática, es una rama especializada de la cinética química, que está basada en la teoría cinética de la materia. En esta teoría, se ve que una solución está hecha de un grupo de moléculas y que cada una de ellas se mueve a una velocidad particular. En este movimiento, ellas chocan entre sí, cada colisión involucra una cierta cantidad de energía. Si la colisión no involucra suficiente energía, la reacción no ocurre. Si la energía es suficiente, las moléculas se combinan para formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transición. La energía mínima que se requiere para la formación de este intermediario es la Energía de Activación. Esto lo podemos representar mediante: A B* Esta reacción la podemos graficar de la siguiente manera: Energía libre... B* Donde B* es el estado de transición Sustrato A Producto Progreso de la Reacción

19 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA En una reacción catalizada por una enzima, esta actúa agregando pasos a la reacción, de manera que la energía de activación requerida sea menor:.. Energía libre Sustrato A ES Producto Donde ES es la unión de la enzima con el sustrato Progreso de la Reacción Note que en las reacciones catalizadas por enzimas, al reaccionante se le llama sustrato. El cambio de Energía libre ó ΔG, es la diferencia de energía libre que se produce entre el estado inicial (sustrato) y el producto final. Si se observa en los gráficos anteriores, el cambio de energía libre es la distancia entre el estado energético del sustrato y la del producto. Note que, con o sin enzima, los niveles de energía libre inicial y final son los mismos y el ΔG es el mismo, por lo que la termodinámica de la reacción no ha cambiado. La Actividad enzimática de una enzima se determina midiendo la cantidad de producto formado (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. La omisión de Enzimas de la Unión internacional de Bioquímíca ha definido la unidad de enzima como: la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 μmol (micro mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas

20 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA En la figura anterior se puede observar la típica evolución de una curva obtenida en un ensayo enzimático. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso. FATRES QUE AFETAN LA ATIVIDAD ENZIMATIA Para definir la actividad de una preparación enzimática se utiliza en la práctica distintas expresiones. La cantidad de enzima se indica habitualmente en unidad de actividad enzimática (U). Se define la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol de sustrato por minuto (μmol/min), bajo condiciones óptimas de temperatura y p. Normalmente, las unidades de actividad que contiene una solución se suele expresar en función del volumen de la misma, en U/mL de solución o referida a la cantidad de proteína presente en la solución, expresada en U/mg de proteína. En este último caso, la actividad enzimática se denomina Actividad específica. Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). omo 1 mol son 1x10 6 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60x10 6 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat). La actividad de una enzima puede determinarse midiendo la cantidad de producto formando (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. De esta manera existen distintos factores que pueden modificar la actividad enzimática. Los factores que modifican la actividad enzimática, entre otros, son: 1.- oncentración de enzima 2.- oncentración de sustrato 3.- Temperatura 4.- p 5.- Inhibidores A continuación se detalla el efecto de cada uno de los factores mencionados anteriormente. 1.- oncentración de enzima uando se determina la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima a distintas concentraciones de ésta, en presencia de concentraciones saturantes de sustrato y manteniendo constante los otros factores ambientales (temperatura y p) se puede establecer la relación entre cantidad de enzima y actividad. uanto mayor cantidad de enzima este presente, mayor será la velocidad que se alcanzará, debido a que necesito más cantidad de sustrato para alcanzar la saturación.

21 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA La velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de sustrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reacción es reducida también a la mitad de la original. 2.- oncentración de sustrato A medida que aumenta la cantidad de sustrato la velocidad aumenta en forma lineal (zona proporcional), luego si bien la velocidad continúa aumentando ya no lo hace en forma lineal (zona mixta) hasta que finalmente la reacción alcanza una velocidad máxima que es constante, se vuelve independiente de la cantidad de sustrato (zona de saturación). Esto ocurre debido a que los sitios activos de las enzimas se encuentran todos interactuando con las moléculas de sustrato, por lo tanto hasta que no finalice la reacción la enzima no puede unirse a otro sustrato. La cinética enzimática comienza a inicios del 1900 con la derivación de la Ecuación de Michaelis-Menten, la que describe la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración de sustrato: k 1 k 3 E + S ES E + P k 2 Se asume que la constante de velocidad de la reacción inversa para k 3 es insignificante y que lo importante son los valores de velocidad inicial. uando estamos en velocidad inicial, la cantidad de P es despreciable y, por lo tanto, la reacción inversa, E + P ES, es también despreciable. Las constantes de velocidad se combinan dando la siguiente constante: k2 + k3 Km = k 1 Donde k 1, k 2 y k 3 son constantes de velocidad Donde La velocidad de la reacción queda definida por la siguiente ecuación: V = [ S] V max [ S] + Km V = velocidad de la reacción Vmax = velocidad máxima [S] = concentración de sustrato Km= constante de Michaelis-Menten

22 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA Km es un parámetro cinético muy importante al momento de determinar la actividad de una enzima, ya que indica el grado de afinidad de la enzima por un sustrato. El valor de Km es inversamente proporcional a la fuerza de unión entre la enzima y el sustrato. Un valor alto de Km, indica baja afinidad de la enzima por el sustrato y un valor bajo, una alta afinidad. Gráfico de Velocidad de Reacción versus oncentración de sustrato (V / [S]) La magnitud de Km es un valor característico para la combinación de cada enzima con su sustrato. Al graficar V / [S] se tendrá: V V max V max Km [S] De este gráfico se desprende que la Km corresponde a la concentración de sustrato a la que se obtiene la mitad de la velocidad máxima. Además se pueden distinguir dos fases en la reacción. Una primera fase, en que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de sustrato, es decir, es de orden uno. Esto ocurre a bajas concentraciones de sustrato, por lo que la enzima no está saturada de sustrato, de manera que si aumentamos la concentración de sustrato, la velocidad aumenta. En la segunda fase, la velocidad de la reacción se vuelve independiente de la concentración de sustrato, es decir, es de orden cero. Esto ocurre cuando la enzima es saturada por el sustrato, de manera que aunque aumentemos la concentración de sustrato, la velocidad se mantiene constante. Al tipo de curva obtenido por este gráfico se le llama hipérbola rectangular. omo no es una representación lineal, es difícil trabajar con ella y obtener algunos datos. Lineaweaver-Burk, proponen un tipo de gráfico que considera los inversos de la velocidad (1/V) y de la concentración de sustrato (1/[S]), obteniéndose el siguiente tipo de gráfico 1 V La pendiente de la Recta es igual a Km / Vmax V 1 max 1 Km 1 S A este gráfico, también se le conoce como de Dobles Recíprocos.

23 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA 3.- Temperatura Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reacción hasta cierta temperatura, la temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse. Las enzimas de muchos mamíferos tienen una temperatura óptima de 37, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen. Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales y en el otro extremo ciertas bacterias árticas tienen temperaturas óptimas cercanas a p Las graficas muestran que a p extremos las proteínas se desnaturalizan, por lo tanto la actividad biológica decae. Algunas enzimas no varían su actividad con el p sino que esta se mantiene constante en un amplio rango. tra tendrá el p óptimo ácido o básico teniendo en cuenta el medio en donde actúan. 5.- Inhibidores Muchos tipos diferentes de moléculas inhiben las enzimas, y actúan de diversas formas. Estos inhibidores pueden provocar una inhibición irreversible o una inhibición reversible. Inhibidores irreversibles: estos inhibidores se enlazan con fuerza a la enzima, se unen VALENTEMENTE a algún aminoácido del sitio activo. Producen cambios permanentes en la molécula de enzima, con deterioro definitivo de su capacidad catalítica. (Ejemplos, son los compuestos organofosforados utilizados como insecticidas, el alopurinol un inhibidor utilizado en el tratamiento de la Gota, etc). Inhibidores reversibles: Los diversos modos de inhibición reversible implican todos ellos la unión N VALENTE de un inhibidor a la enzima, pero difieren en los mecanismos por medio de los cuales reducen la actividad enzimática y en la forma en que afectan la cinética de la reacción. Dentro de este grupo encontramos los inhibidores competitivos, no competitivos y incompetitivos. Sin embargo, los tipos de inhibición más frecuentes son la competitiva y la no competitiva. o Los inhibidores competitivos compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima, y si aumentamos la cantidad de sustrato, el efecto inhibidor se revierte alcanzándose la velocidad máxima.

24 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA o Los inhibidores no competitivos se enlazan a un sitio distinto del sitio activo, de manera que el inhibidor se puede unir a la enzima libre o bien al complejo enzima sustrato, pero en ninguno de los casos obtendremos productos. El efecto de estos inhibidores no se revierte por el agregado de mayor cantidad de sustrato, de manera que se llega a una velocidad máxima menor que si no tuviera el inhibidor. o Los inhibidor incompetitivo se fijan a un sitio distinto al del sustrato, con la diferencia que solamente se fija al complejo enzima-sustrato. No es raro observar algunos inhibidores a los cuales no se les puede comprobar el mecanismo exacto de inhibición, siendo en algunos casos un tipo de inhibición mixta. Método de análisis omo ya se ha visto, las enzimas son proteínas que en los sistemas vivos se encuentran mezcladas entre sí y con muchas otras especies moleculares. Sin embargo, es posible detectarlas y determinarlas con exactitud por las reacciones que catalizan, para lo cual es necesario conocer el o los sustratos que utilizan y el o los productos de sus reacciones, además de poseer los métodos analíticos para medirlos. También se deben considerar todos los controles experimentales, de manera de descartar cualquier otro artefacto experimental de la reacción que pueda hacer aparecer producto o desaparecer sustrato de forma inespecífica. Los controles más importantes son: a. Blanco Sustrato: Es una mezcla de reacción semejante a la mezcla en la que se detecta la actividad enzimática, pero en ella se reemplaza la solución que contiene al sustrato por un volumen equivalente de su solvente. Este volumen puede ser reemplazado por agua o el buffer de la reacción. b. Blanco Enzima: También corresponde a una mezcla semejante a la mezcla en la que se detecta la actividad enzimática, pero en ella se reemplaza la solución que contiene a la enzima por un volumen equivalente de su solvente. Este blanco es importante cuando el sustrato es inestable y se puede obtener producto en ausencia de la enzima. c. Tiempo ero: Este control contiene todos los componentes necesarios para la detección de la actividad enzimática. onsiste en que la reacción es detenida en el momento mismo en que se inicia (tiempo cero). Por lo general una reacción enzimática se inicia con la adición de la enzima o bien con la de su sustrato. El método analítico para determinar la cantidad de producto formado será a través de un espectrofotómetro. El espectrofotómetro permite determinar la absorción de la luz a determinadazas longitudes de onda, la cual está directamente relacionada con la concentración de los productos.

25 UNIVERSIDAD MAYR ESUELA DE ENFERMERIA II.- PARTE EXPERIMENTAL 1. Material de estudio Entre las enzimas que se han conocido desde muy antiguo, se encuentran aquellas que hidrolizan la sacarosa. En 1860, Berthelot purificó una enzima procedente de la levadura y que hidrolizaba la sacarosa, la llamó Ferment inversif. más recientemente se le ha llamado: invertasa, sucrasa, sacarasa y -fructofuranosidasa. El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos glucosa y fructosa. En esta sesión experimental, se usará el procedimiento de análisis a tiempo fijo, que consiste en detener la reacción usando el reactivo 3,5-DNS (ácido 3,5-dínitrosalicílíco) y medir el poder reductor de los productos. urva de alibración (ó urva Estándar) bjetivo: Desarrollar una curva de calibración que permita relacionar la cantidad de producto obtenido con la Absorbancia. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Reactivos Glucosa y Fructosa 0,005 M Sacarosa 0,6 M 2 destilada 3,5-DNS TUBS Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5-0,2 ml 0,4 ml 0,8 ml 1,2 ml 1,5 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 2,0 ml 1,8 ml 1,6 ml 1,2 ml 0,8 ml 0,5 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100º. 3) Enfríe los tubos. 4) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda 5) Anote las lecturas en la siguiente tabla: URVA DE ALIBRAIÓN antidad de glucosa y fructosa (μmol) Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 1,0 2,0 4,0 6,0 7,5 Absorbancia 0,006 0,013 0,024 0,038 0,047 6) Realice un gráfico (curva de calibración), Absorbancia versus concentración de producto

26 urva de Progreso. bjetivo: Determinar el progreso de la reacción en el tiempo. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo REUERDE: desde que agrega la enzima debe controlar el tiempo. Luego de cumplido, para detener la reacción agregue 2 ml de 3,5 DNS Reactivos Buffer Acetato 0,1 M p: 4,7 Sacarosa 0,6 M Invertasa ontrolar Tiempo 3,5-DNS Blanco ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml - 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml - 0 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100º. 3) Enfríe los tubos. 4) Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo blanco 5) Mida las absorbancias de los otros tubos ( del 1 al 7) y anote las lecturas en la siguiente tabla: Tiempo min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min Absorbancia 6) on los datos anteriores y con la curva de calibración, complete la siguiente tabla: Tiempo min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min antidad de producto (µmol) 7) Realice un gráfico Tiempo versus concentración de producto.

27 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica Influencia de la concentración de Sacarosa sobre la Velocidad de la Reacción. bjetivo: Determinar el efecto de la concentración de sustrato en la velocidad de una reacción enzimática. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Reactivos Blanco Buffer Acetato 0,1 M p 4,7 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 ml Sacarosa 0,005 M 1 ml Sacarosa 0,05 M - 1 ml Sacarosa 0,2 M ml Sacarosa 0,3 M ml - - Sacarosa 0,6 M ml - Invertasa 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml - 2) Incube por 5 minutos a temperatura ambiente. 3) Adicione 2 ml de 3,5 DNS a cada uno de los tubos. 4) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100º. 5) Enfríe los tubos. 6) Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo blanco 7) Mida las absorbancias de los otros tubos ( del 1 al 5) y anote las lecturas en la siguiente tabla: Absorbancia ) on los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia en la curva de calibración para obtener la concentración de producto y complete la siguiente tabla: Producto ) Determine la velocidad de reacción y complete la siguiente tabla. Luego confeccione un gráfico de [Sustrato] Versus Velocidad, para verificar si la enzima en estudio tiene un comportamiento de acuerdo a la teoría cinética de Michaelis Menten. [Sustrato] oncentración de sacarosa (μmol) Producto / 5 = Velocidad

28 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica 10) omplete la siguiente tabla y confeccione un gráfico de 1 / [Sustrato] Versus 1 / V. 1 / [Sustrato] / V El gráfico de Lineweaver Burk tiene como objetivo obtener una linealización de la tendencia obtenida en el gráfico anterior para facilitar el cálculo matemático de los parámetros cinéticos que explican el comportamiento real de la enzima en estudio. 11) A partir del gráfico anterior determine los valores de la Km y la Vmáx. Efecto del p sobre la Actividad Enzimática. bjetivo: Determinar el efecto del p sobre la actividad enzimática de la Invertasa. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Buffer Acetato Reactivos 1 1B 2 2B 3 3B 4 4B p 3,8 1 ml 2 ml ,1 M p 4, ml 2 ml p 5, ml 2 ml - - p 6, ml 2 ml Sacarosa 0,6 M 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Invertasa 1 ml - 1 ml - 1 ml - 1 ml - 2) Incube por 5 minutos a temperatura ambiente. 3) Adicione 2 ml de 3,5 DNS a cada uno de los tubos. 4) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño termorregulado a 100º. 5) Enfríe los tubos. 6) Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo blanco ( tubo 1B) 7) Mida la absorbancia del tubo 1y anote las lecturas en la siguiente tabla. 8) Repita el procedimiento 6) y 7) para los otros p Absorbancia

29 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica 9) on los datos anteriores, extrapole los valores de Absorbancia de la curva de calibración para obtener la concentración de producto y complete la siguiente tabla: p 3,8 4,7 5,2 6,2 Producto 10) Grafique p versus Producto. 11) Determine el efecto del p sobre la actividad enzimática de la Invertasa.

30 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica Laboratorio N 4 GLUGENLISIS I.- INTRDUIÓN La molécula de idrato de arbono más importante desde el punto de vista fisiológico es la Glucosa, la cual se clasifica como monosacárido del tipo polihidroxialdehido de baja masa molecular, químicamente corresponde a una aldohexosa, es decir, está formada por 6 átomos de carbono y un grupo aldehído en el carbono uno. En solución acuosa, el grupo carbonilo y los grupos hidroxilo de la glucosa reaccionan intramolecularmente para formar una estructura cíclica de 5 miembros denominada piranosa. 2 α-d-glucopiranosa Estructura aworth 2 Glucosa Estructura Fischer 2 β-d-glucopiranosa Estructura aworth La glucosa forma varios tipos de polisacáridos que se diferencian estructuralmente, lo que deriva en que cumplen diversas funciones: Forman parte de los tejidos de sostén de plantas y animales, por ejemplo: la celulosa, el almidón, el algodón, el ADN, etc. onstituyen una fuente importante de energía on respecto a está última función encontramos el glucógeno; polisacárido formado por varias cadenas que contienen de 12 a 18 unidades de D-glucosas unidas mediante enlaces glicosídicos α (1,4); uno de los extremos de esta cadena se une a la siguiente cadena mediante un enlace α (1,6). Una sola molécula de glucógeno puede contener más de moléculas de glucosa.

31 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica Los principales lugares destinados para la reserva de glucógeno en animales son el ígado que puede almacenar aproximadamente 70 g (280 Kcal) de glucógeno y los Músculos Esqueléticos que pueden contener hasta 400 g (1600 Kcal). Sin embargo, este contenido fluctúa notablemente como consecuencia de la alimentación y de los estímulos hormonales, entre otras causas. En el hígado, el glucógeno tiene como misión mantener el nivel de glucosa en la sangre (glicemia) constante. En los músculos, el glucógeno se utiliza para abastecer de energía (ATP) al proceso de contracción muscular. Debido a la estructura tan ramificada del glucógeno, permite la obtención de moléculas de glucosa libre en el momento que se necesiten; éste proceso se denomina atabolismo del Glucógeno o Glucogenólisis. Para llevar a cabo este proceso se requiere la acción combinada y secuencial de 3 enzimas: Glucógeno Fosforilasa Enzima Desramificante del Glucógeno Fosfoglucomutasa Glucógeno Fosforilasa: ataliza la denominada Escisión Fosforolítica de los enlaces glicosídicos α (1,4), que consiste en la separación secuencial de restos de glucosa desde el extremo no reductor, según la reacción siguiente n (Glucosa) +Pi n-1 (Glucosa) + Glucosa-1-P Enzima Desramificante del Glucógeno: La glucógeno fosforilasa, no puede degradar los enlaces glicosídicos α(1-6) por lo tanto es la enzima desramificante la encargada de realizar dicha función. Fosfoglucomutasa: Se encarga de transformar la Glucosa-1-P en Glucosa-6-P. Esta es una reacción reversible. Glucosa-1-P Glucosa-6-P

32 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica Para poder ser liberada al torrente sanguíneo y de este modo regular la glicemia, la Glucosa- 6-P debe ser desfosforilada, o sea, debe perder el grupo fosfato, para obtener una glucosa libre mediante la enzima Glucosa-6-fosfatasa Glucosa-6-P + 2 Glucosa +Pi En resumen, la regulación del metabolismo del glucógeno en el hígado, se lleva a cabo a través de la concentración de glucosa extracelular. Para mantener la glicemia, el hígado actúa como dador o captador de glucosa, dependiendo de los niveles extracelulares de ella. Las enzimas claves para la regulación de la glicemia son la Glucógeno Fosforilasa y la Glucógeno Sintetasa, ambas enzimas se comportan de acuerdo a la acción de dos hormonas secretadas por el páncreas: el Glucagón y la Insulina que actúan dependiendo de si el organismo se encuentra en condición de hipoglicemia o hiperglicemia. uando el nivel de glucosa en la sangre es bajo (hipoglicemia), el glucagón producido por el páncreas activa la acción de la glucógeno fosforilasa, estimulando la degradación del glucógeno en el hígado liberando glucosa al torrente sanguíneo con lo que su concentración aumenta. Por el contrario, cuando el nivel de glucosa sanguínea es alto (hiperglicemia), la insulina producida también en el páncreas activa la acción de la glucógeno sintetasa que estimula la síntesis de glucógeno por lo que la concentración de glucosa libre en la sangre disminuye. La disponibilidad de glucosa es esencial para que la célula pueda realizar correctamente su metabolismo energético. Así, el mantenimiento de una concentración adecuada de glucosa es crucial para el organismo. Un individuo adulto requiere de unos 500 g de hidratos de carbono al día. El glucógeno ingerido en la dieta es degradado en el tubo digestivo por enzimas hidrolíticas, y contribuye de esta manera a los requerimientos energéticos celulares. Frente a una dieta rica en hidratos de carbono, se promueve la acumulación de glucógeno hepático y muscular.

33 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica II.- bjetivos - Reconocer el efecto de una dieta rica en hidratos de carbono sobre la acumulación de glucógeno hepático en ratas. - omparar los niveles de glucógeno hepático en ratas sometidas a una dieta rica en hidratos de carbono y en ayuna con respecto a ratas controles. - Determinación de Glucógeno por su reacción con Yodo. III.- PARTE EXPERIMENTAL 1. Animales de experimentación Se utilizaron 3 ratas, las cuales se mantuvieron con pellet comercial y agua ad libitum (libre disposición), a 25º. 2. Dietas Una de las ratas fue mantenida con dieta glucídica. Para ello, fue alimentada durante los últimos 6 días anteriores a la toma de muestra, con pellet comercial y el agua fue reemplazada por una solución de azúcar al 59% (p/v). La otra fue mantenida en ayuna durante 3 días y agua ad libitum. La tercera rata fue mantenida con dieta normal, es decir, alimentada con pellet comercial y agua ad libitum por un período de 6 días. 3. btención de muestras El peso promedio final del hígado de cada rata fue: rata alimentada con dieta glucídica: rata en ayuno durante 3 días: rata alimentada con dieta normal: ada uno de los animales fue anestesiado con éter; luego, se les extrajo el hígado. Estos tejidos fueron homogenizados independientemente en un mortero con arena y con aproximadamente 300 ml de Ácido tricloro-acético al 5% p/v. ada homogenizado fue centrifugado a rpm por 10 min. Luego cada sobrenadante fue filtrado sobre papel filtro y rotulado como filtrado I, II y III. 4. urva de alibración (ó urva Estándar) bjetivo: - Desarrollar una curva de calibración que permita relacionar la cantidad de sustrato (glucógeno) con la Absorbancia.

34 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica Procedimiento: a) Desarrolle el siguiente protocolo: - A partir de una solución stock de glucógeno de concentración 0,4 mg/ml realice las diluciones indicadas en la siguiente tabla: Reactivos Glucógeno (0,4 mg/ml) 2 destilada Solución de Yodo (Lugol) TUBS Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón ,5 ml 1,0 ml 1,2 ml 1,5 ml 2,0 ml 2,0 ml 1,5 ml 1,0 ml 0,8 ml 0,5 ml gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota b) omogenice las soluciones. c) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda (utilice el tubo Nº 1 (blanco) para calibrar el equipo a cero. d) Anote las lecturas en la siguiente tabla: Absorbancia Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 e) on los datos anteriores complete la siguiente tabla: URVA DE ALIBRAIÓN Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 Glucógeno (mg/ml) Absorbancia f) Realice un gráfico (curva de calibración) de Absorbancia versus concentración de glucógeno. 5. Determinación de glucógeno por método de Yodo 1. Prepare un tubo blanco adicionando 2,0 ml de agua destilada y una gota del reactivo de yodo (Lugol), agite suavemente. 2. Luego rotule tres tubos de ensayo y adicione a cada uno de ellos, y por separado, 1,0 ml de cada filtrado proveniente de cada corte de hígado que contiene glucógeno. 3. Adicione a cada tubo de ensayo 1,0 ml de agua destilada y 1 gota del reactivo de yodo (Lugol), agite suavemente.

35 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica 4. alibre el espectrofotómetro a 540 nm con el tubo blanco, lea la Absorbancia de las muestras en el equipo a la misma longitud de onda y complete la siguiente tabla: Tubo N Absorbancia 5. on los datos anteriores, interpole los valores de Absorbancia en la curva de calibración para obtener la concentración de glucógeno y complete la siguiente tabla: Glucógeno Deduzca, según los resultados obtenidos, el tipo de dieta a la que fue sometida cada rata y cual le corresponde a cada filtrado: Filtrado I: Filtrado II: Filtrado III: 7. Exprese el contenido de glucógeno (en mg) por cada 100 ml de filtrado hepático que corresponde a cada rata en estudio: Rata con dieta normal: Rata con ayuno: Rata con dieta glucocídica:

36 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica Laboratorio N 5 LESTERL I.- INTRDUIÓN Las grasas (o lípidos) son los compuestos con los que el cuerpo humano almacena energía para las épocas de carencia. Evolutivamente, el cuerpo humano es almacenador de energía, es decir, está diseñado para acumular parte de la energía que absorbe por los alimentos para épocas de ayuno. La forma más eficaz de almacenar esta energía es en forma de grasas, que son muy ligeras por lo que en poco peso de grasa se puede acumular mucha energía. Los lípidos se clasifican en dos grupos principales: simples y complejos. Los lípidos simples más importantes son el colesterol y los ácidos grasos; dentro de los lípidos complejos se pueden mencionar los fosfolípidos y los triglicéridos. El colesterol es una grasa presente en todas las células del organismo. Se presenta en altas concentraciones en la médula espinal, páncreas y cerebro pero se sintetiza principalmente en el hígado y en el intestino delgado. Aproximadamente el 50% de las necesidades de colesterol son sintetizadas en el hígado mientras que el resto se obtiene de los alimentos de origen animal presentes en la dieta. En la molécula de colesterol se puede distinguir una cabeza polar constituida por el grupo hidroxilo y una cola o porción apolar formada por los distintos ciclos y los sustituyentes alifáticos. Así, el colesterol es una molécula hidrofóbica que al igual que otros lípidos es bastante soluble en disolventes apolares como el cloroformo, acetona y éter. onsiderando lo anterior, cualquier método de extracción de lípidos requiere utilizar mezclas de solventes orgánicos que permitan solubilizar todos los lípidos y precipiten proteínas e hidratos de carbono para su mejor separación. Los organismos mamíferos obtienen colesterol a través de dos vías: Vía exógena o absorción de colesterol contenido en los alimentos. El colesterol se encuentra exclusivamente en alimentos de origen animal, mayoritariamente en la yema de huevo, hígado, lácteos, cerebro (sesos) y músculo esquelético (carnes rojas). Vía endógena o síntesis de colesterol en las células animales a partir de su precursor, el acetato, en su forma activada acetil-coenzima A.

37 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica La producción de colesterol es regulada directamente por la concentración del colesterol presente en las células, habiendo una relación inversa con los niveles plasmáticos de colesterol. Una alta ingesta de colesterol en los alimentos conduce a una disminución neta de la producción endógena y viceversa. Además del papel en la reserva energética que cumple el colesterol, es imprescindible para la vida por numerosas funciones: Estructural: es un componente muy importante de las membranas plasmáticas de los animales (en general, no existe en los vegetales). Precursor de la vitamina D: esencial en el metabolismo del calcio. Precursor de hormonas sexuales: progesterona, estrógenos y testosterona. Precursor de las sales biliares: esenciales en la absorción de algunos nutrientes lipídicos y vía principal para la excreción de colesterol corporal. El mayor inconveniente que tiene la grasa es que no se disuelve en agua, y por lo tanto, no puede transportarse como tal por el torrente sanguíneo. Para poder transportar las partículas de grasa, el cuerpo utiliza unas moléculas más complejas llamadas lipoproteínas, que están formadas por una parte proteica y una parte lipídica compuesta por distintos tipos de grasas. Existen varios tipos de lipoproteínas en función del contenido proteico y lipídico que contienen. Los dos tipos de lipoproteínas que contienen colesterol son: LDL: compuestas principalmente por colesterol y una proteína llamada apob. Es la forma en que el organismo recoge el colesterol del hígado (donde lo sintetiza) y lo distribuye a los tejidos. El 70% del colesterol que circula por la sangre lo hace en forma de LDL-colesterol. Éste es el colesterol malo, responsable de la aterosclerosis, o acumulación del colesterol en la pared de las arterias. DL: compuestas principalmente por colesterol y una proteína llamada apoa. Estas partículas contienen el denominado colesterol bueno, porque transportan el exceso de colesterol desde los tejidos hasta el hígado. Actualmente se reconoce ampliamente el papel causal del colesterol presente en las lipoproteínas de baja densidad (LDL) en la patogenia de la aterosclerosis. De esta manera, la existencia sostenida de niveles elevados de colesterol LDL (popularmente conocido como colesterol malo ) por encima de los valores recomendados, incrementa el riesgo de sufrir eventos cardiovasculares (principalmente infarto de miocardio agudo). De manera interesante, el colesterol presente en las lipoproteínas de alta densidad (DL) ejercería un rol protector del sistema cardiovascular, que por ello se conoce como colesterol bueno. La concentración actualmente aceptada como normal de colesterol en el plasma sanguíneo llamada colesterolemia de individuos sanos es de 150 a 200 mg/100 ml. Se ha definido clínicamente que los niveles de colesterol plasmático total (suma de colesterol presente en todas las clases de lipoproteínas) recomendados por la Sociedad Norteamericana de ardiología (AA) son:

38 UNIVERSIDAD MAYR Enfermería laboratorio de Bioquímica olesterolemia por debajo de 200 mg/dl: es la concentración deseable para la población general, pues por lo general correlaciona con un bajo riesgo de enfermedad cardiovascular. olesterolemia entre 200 y 239 mg/dl: existe un riesgo intermedio en la población general, pero es elevado en personas con otros factores de riesgo como diabetes. olesterolemia mayor de 240 mg/dl: puede determinar un alto riesgo cardiovascular y se recomienda iniciar un cambio en el estilo de vida, sobre todo en lo concerniente a la dieta y al ejercicio físico. La aterosclerosis es un fenómeno muy complejo, que comienza en las primeras etapas del desarrollo y se prolonga durante años. onsiste en el depósito de células cargadas de partículas de LDL-colesterol en las paredes de las arterias. Esta pared responde a la agresión induciendo una respuesta protectora, que finalmente conduce a la formación de una placa. on el paso del tiempo, la placa aumenta de tamaño, hasta que estrecha la arteria dificultando la circulación de la sangre. Por otra parte, la placa también se puede romper, originando un trombo que puede obstruir completamente la arteria. Al final del proceso el corazón se ve privado de oxígeno y nutrientes por lo que se produce una angina o infarto de miocardio. La aterosclerosis está directamente relacionada con la concentración de partículas de LDLcolesterol presentes en la sangre, por lo que la prevención pasa por disminuir al máximo el nivel de LDL y aumentar el DL-colesterol, que es el que retira el colesterol circulante y lo devuelve al hígado. La forma de conseguir estos objetivos es adoptar hábitos de alimentación adecuada, realizar ejercicio físico habitualmente y cuando esto no es suficiente, se debe recurrir a fármacos específicos. En este trabajo práctico estudiaremos el contenido de colesterol contenido en la yema de huevo de gallina. La yema representa entre el 30 40% del peso total del huevo y la cantidad de colesterol aproximada (por yema de huevo) es de 250 mg. Masa de la yema de huevo: Masa del huevo entero: