ENFERMEDAD DE TOBIA: POSIBLE CAUSA DE ENFERMEDAD FEBRIL TRANSMITIDA POR GARRAPATAS EN COLOMBIA

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1 ENFERMEDAD DE TOBIA: POSIBLE CAUSA DE ENFERMEDAD FEBRIL TRANSMITIDA POR GARRAPATAS EN COLOMBIA Autores: Efraín Benavides, Paola García; Rocío Patiño, Gloria Henao, Liliana Cortes Resumen En diciembre de 2003 el laboratorio de hemoparásitos del Programa Nacional de Investigación en Salud Animal de CORPOICA recibió solicitud del Instituto Nacional de Salud y Secretarías de Salud para confirmar un diagnóstico de babesiosis humana en un aparente brote que afectó un grupo familiar en la vereda La Mazata municipio de Villeta, en el cual existieron dos casos fatales. Se procesaron 26 muestras de sangre y algunas garrapatas. Para cada muestra se prepararon frotis delgados, gota gruesa y extendidos de concentrado de glóbulos blancos; todos coloreados con Giemsa. Se realizó observación microscópica de eritrocitos y leucocitos, para detectar Babesia spp. 6 Ehrtichia spp. Una muestra fue examinada con coloración Naranja de Acridina y cultivo in vitro. Se examinó la hemolinfa de las garrapatas y se clasificaron taxonómica. Se realizó una evaluación epidemiológica de historias clínicas y factores asociados con el brote. Las muestras resultaron negativas para hemoparásitos, el cultivo in vitro fue negativo. No se halló evidencia clínica o epidemiológica que sustentara el diagnóstico de babesiosis. Las garrapatas se clasificaron como Rhipicephalus sanguineus y fueron negativas a Babesia spp. La enfermedad febril en Villeta se presentó en conglomerados familiares, lo cual se ha descrito para fiebres moteadas causadas por Rickettsias que ron transmitidas por artrópodos. Se sugiere que el brote en mención se trata de la enfermedad de Tobía, causada por Rickettsias que son transmitida por la garrapata Amblyomma cajennense, enfermedad descrita en Colombia hace más de 50 años. Palabras clave: Rickettsias, zoonosis, Amblyomma cajennense, Babesiosis humana, enfermedad, tobia, garrapatas, Colombia, causa, enfermedad febril Abstract: In December 2003, the haemoparasites laboratory of the National Program of Research on Animal Health of CORPOICA received a request from the National institute of Health and from the Health Secretaries to confirm a diagnosis of human babesiosis, in an apparent outbreak that affected a family group in the community of La Mazata town of Villeta (Cundinamarca, Colombia) in which two fatal cases occurred. Introducción La Babesiosis es una enfermedad transmitida por garrapatas, considerada en algunos países como zoonosis emergente, causada un protozoario intra eritrocítico del género Babesia (Kjemtrup & Comad, 2000). El agente causal tienen distribución mundial, ocurriendo en los eritrocitos de animales domésticos y silvestres. De las más de 100 especies de Babesia reconocidas, sólo unas pocas pueden causar infección en el hombre (hawan, 2003). El primer caso de babesiosis en humanos ocurrió en 1956 en Yugoslavia; desde entonces, cientos de casos se han reportado en los Estados Unidos y existen cerca de 30 reportes en Europa; en otras regiones se han registrado muy pocos casos de la enfermedad (Herwaldt et a1.,2003). En los Estados Unidos, la

2 mayoría de casos son debidos a infección pm Babesia microti, un parásito de pequeños roedores, transmitido por la garrapata lxodes scapularis y la infección se considera endémica en la región costera noreste (Herwaldt et al. 2003). En Europa, la babesiosis humana es menos frecuente y se atribuyen los casos a Babesia divergens, un parásito del ganado transmitido por la garrapata lxodes ricinus. Las manifestaciones de enfermedad incluyen fiebre, escalofríos, sudoración, mialgias, fatiga, hepatoesplenomegalia y anemia hemolítica, es mucho más severa en individuos inmuno-comprometidos o en ancianos y los síntomas típicamente ocurren de 1 a 4 semanas luego de la exposición a garrapatas infectadas y pueden durar varias semanas. En Colombia, las regiones inferiores a 2000 m.s.n.m. se consideran endémicas para Babesia bigemina y Babesia boviss en bovinos, siendo transmitidas por la garrapata Boophilus microplus (Mateus, 1987; Benavides, 2002). En caninos, se reconoce la infección por Babesia canis, transmitida por la garrapata Rhipicephalus sanguineus. También se han descrito piroplasmas en los équidos del país siendo Anocentor nitens la garrapata implicada en su transmisión; pero se desconoce si Theileria equi, está presente en nuestro territorio (De Waal, L992). El reclamo de babesiosis en humanos en Colombia posee importantes implicaciones epidemiológicas, debido sus vectores, las garrapatas I. scapularis o I. Ricinus no existen en el país (Doss et al., 1978). El aporte de pruebas contundentes que indiquen la participación de animales domésticos en esta transmisión implicaría la educación de profesionales y público en general, para reducir las posibilidades de transmisión de esta enfermedad, además este hallazgo repercutirá en el sistema de Salud Pública ya que en países donde la babesiosis humana es endémica se considera a este organismo como posible contaminante de transfusiones sanguíneas y de órganos (Herwaldt et a1.,1997; Chamberland et al., 1998), lo cual dispararía las alarmas de nuestro sistema de salud. Por otra parte, existen las rickettsias asociadas a transmisión por artrópodos que son mantenidas en ciclos silvestres vector huésped primario, infectando de manera accidental a su huésped vertebrado alterno. Los dos tipos principales de esta enfermedad en humanos, son la Ehrlichiosis Monocítica Humana (EMH), causada por Ehrlichia chaffeensis y la Ebdichiosis Granulocítica Humana (EGH), causada por Anaplasma phagocytophila (previamente llamada Ehrlichia phagocytophila o Ehrlichia equi). Las cuales deben ser tenidas en cuenta como diagnóstico diferencial. En la segunda y tercera semana de diciembre de 2003, el laboratorio de hemoparásitos del CEISA recibió solicitudes para la confirmación diagnóstica de Babesiosis en muestras de humanos procedentes del departamento de Cundinamarca, todos relacionados con un mismo caso originario de enfermedad febril, aparentemente presentándose en forma de conglomerados familiares concomitante con enfermedad en caninos e historia de presencia de garrapatas. Este documento describe los procesos adelantados sobre las muestras recibidas en el laboratorio, los resultados alcanzados en esos análisis y se realiza una discusión acerca de las asociaciones epidemiológicas del caso, sugiriendo actividades subsecuentes de investigación epidemiológica y esfuerzos de confirmación diagnóstica para definir la etiología de la enfermedad. Materiales y Métodos Muestras: Las muestras primarias se recibieron en el laboratorio el 17 y 18 de Diciembre de 2003, remitidas por el hospital de San José de Bogotá, D.C.,

3 correspondientes a una solicitud de confirmación diagnóstica en dos pacientes con diagnóstico preliminar de "babesiosis" en uno de ellos, realizado en un laboratorio clínico veterinario particular (Veterilab) en muestras remitidas a través de la Escuela de Carabineros de la policía de la capital (aparentemente procesadas inicialmente como si se tratase de un canino) y cuya historia las asociaba con asistencia al funeral del caso primario en Villeta (Cundinamarca). Posteriormente el 19 y 30 de Diciembre se recibieron sangres con anticoagulante adicionales de humanos y caninos, remitidas por el Hospital Salazar de Villeta, el Hospital San Rafael de Girardot y el Instituto Nacional de Salud, INS, que corresponden a familiares de las anteriores pacientes con la misma historia de visita a Villeta y enfermedad asociada de similar sintomatología. Adicionalmente se procesaron algunas garrapatas procedentes de Villeta. Frotis Sanguíneos: Para cada muestra se prepararon extendidos sanguíneos de frotis delgado y de gota gruesa (Davies, 1989; CDC, 2002), se realizó una concentración de glóbulos blancos (buffy Coat) mediante microcentrifugación en tubo capilar, a partir de la cual se obtuvieron frotis. Todas las placas obtenidas fueron coloreadas con giemsa- Se realizó observación microscópica detallada de eritrocitos y leucocitos, con el fin de detectar la presencia tanto de Babesia spp. como de Ehrlichia spp.. el examen de los extendidos fue realizado de forma independiente por dos profesionales, cada uno de ellos examinó no menos de 50 campos de inmersión (x100), conteniendo entre eritiocitos/campo. Para las gotas gruesas se evaluó mínimo 20 campos de inmersión. En caso de observarse formas sospechosas de hemoparásitos, se obtuvo un registro fotográfico y se discutió el hallazgo. Dada la urgencia de clarificar el diagnóstico en el caso secundario, se procesaron muestras de extendido sanguíneo y de capa de glóbulos blancos de este paciente mediante la técnica de Naranja de Acridina (Kawamoto, 1990); una vez teñidas las láminas se observaron en microscopio fluorescente, donde en el caso de ocurrir parásitos, las estructuras que poseen fragmentos de DNA o RNA brindan fluorescencia de forma específica. Cultivo in Vitro: En un intento por aislar Babesia spp. de la paciente caso secundario (MYBR)' se intentó establecer un cultivo in vitro a partir de su sangre, utilizando algunas modificaciones al protocolo de cultivo, específicamente el medio de cultivo se suplementó con suero humano al 40% y el cultivo inicial se sembró sobre glóbulos rojos humanos normales de un donante grupo 0, RH negativo (Schuster, 2002). El cultivo inicial se sembró en microplaca de 24 pozos, dos celdas fueron inoculadas con un volumen final de 1 ml, utilizando una suspensión al 10% de una mezcla 1:1 de glóbulos rojos de la paciente y glóbulos rojos sanos. Se incubó a 37 C, el medio se cambio diariamente, removiendo el sobrenadante y recuperando el volumen con medio fresco, el refrescamiento de glóbulos rojos se realizó los días 5 y 10. Se realizaron frotis delgados los días 5, 7 y 9 que fueron teñidos Giemsa. El seguimiento de este cultivo se rcalí26 durante 10 días. Se recibieron especimenes de garrapatas remitidas por el Hospital Salazar de Villeta, obtenidas del perro Mateo. Clasificación v examen de hemolinfa de garrapatas: Los especimenes fueron clasificados taxonómicamente acorde a las claves aceptadas para este fin (López. 1980). Posterior a su clasificación, se incubaron los especimenes por cinco días a 28 C y humedad relativa de 80% para realizar frotis de hemolinfa teñidos con Giemsa, estos se observaron para detectar las posibles vermículos o kinetos de Babesia spp en la muestra (Benavides, 1987; Guglielmone et al., 1996).

4 Resultados y Discusión Muestras: Se procesaron muestras de sangre de 26 pacientes. Con base en estas muestras se procesaron 27 extendidos sanguíneos, 23 gotas gruesas y 23 preparados de capa de glóbulos blancos. Se examinó una muestra mediante coloración de Naranja de Acridina, la misma sobre la que se intentó el cultivo invito. Las garrapatas recibidas en el laboratorio fueron clasificadas como Rhipicephalus sanguineus. Al examen de hemolinfa al día quinto de incubación, resultando negativas a la infección por Babesia spp. Hematología: Con relación a los leucocitos, el caso secundario principal (MYBR) demostró una neutrofilia (87%), con un 27% de cayados; mientras en el caso secundario LAB se encontró inversión de la fórmula leucocitaria. Para los contactos secundarios, 4/19 pacientes mostraron linfocitosis y 3/19 contactos secundarios presentaron eosinofilia. Con referencia al hematocrito y alteraciones morfológicas de los eritrocitos, sólo se detectó anemia en el caso secundario MYBR, con un valor de 26%, asociado con policromatofilia. El resto de los pacientes presentaron valores normales del hematocrito, aunque en 2/3 de los casos secundarios y en 5/19 de los contactos secundarios se detectaron alteraciones en la coloración de los eritrocitos. En cuanto a la serie plaquetaria, en todos los pacientes caso secundario se destacó la presencia de macro plaquetaslo que sugiere una producción trombocitaria aumentada o anómala. Frotis Sanguíneos: En lo que refiere a la presencia de hemoparásitos (protozoarios o rickettsías), luego del examen de los diversos tipos de extendidos preparados, no se encontraron formas parasitarias que concluyeran que Babesia spp. fuese la causa de enfermedad. En el paciente MYBR se detectaron en tres ocasiones -dos en la preparación de buffy coat y una en el extendido sanguíneo algunas formas sospechosas que simulaban un trofozoito anular que podría tratarse de Plasmodium spp. o Babesiaspp., a los cuales se les obtuvo registro fotográfico y se presentan en la figura 1 y 2.

5 Figura 1. Formas sospechosas de Babesia spp. en el paciente MYBR. La lamina A ilustra una posible forma de pera, pero presenta un halo claro a su alrededor, nótese la macroplaqueta en el extremo superior izquierdo. La lamina B ilustra una posible forma anular, pero también presenta un halo claro alrededor de la estructura. Las formas presentadas en la figura 1, aunque poseen alguna semejanza con estructuras parasitarias, no presentaron adecuada diferenciación cromática y se observó un halo claro en su entorno, sugiriendo de que se trataba de artefactos. Sin embargo en el frotis de capa de glóbulos blancos se hallaron dos estructuras en un solo campo (figura 2) que parecen corresponder con un trofozoito anular de un protozoito del filum Apicomplexa orden Eucoccidiorida, a donde pertenecen tanto plasmoüumspp., como Babesiaspp. (CDC, 2002). Las implicaciones de este hallazgo se discutirán en la siguiente lección. En lo que respecta al intento de cultivo invitro de Babesia spp., el cultivo se siguió durante 10 días más para evidenciar la posible aparición de formas parasitarias, siendo el resultado negativo. Entonces el cultivo fue abandonado. Figura 2. Estructuras halladas en el frotis de la capa de glóbulos blancos de la paciente MYRB que semejan trofozoitos anulares de un protozoario, que bien podría corresponder a Plasmodium spp o Babesia spp. La definición cromática parecía adecuada en el microscopio de luz. La babesiosis es una enfermedad transmitida por garrapatas, es decir no es una enfermedad contagiosa, sino que requiere para una transmisión efectiva de la picadura de una garrapata por esta razón la babesiosis en humanos no ocurre en forma de brote, sino a manera de casos aislados, principalmente en pacientes inmuno comprometidos (CDC, 2002). El brote de enfermedad que nos ocupa se ha presentado en forma de un conglomerado o cluster familiar, donde parece existir un modo de transmisión contagioso o por lo menos diferente al de la picadura de garrapata. Es bastante improbable que, así fueran muy abundantes, garrapatas infectadas con el

6 hemoparásito, hubiesen picado y se mantuviesen in situ hasta transmitir la infección, en tan alto número de pacientes. La evidencia morfológica y parasitológica a partir de las muestras recibidas no permite sustentar un diagnóstico de babesiosis humana en los pacientes examinados. Un segundo aspecto a tener en cuenta es el nivel de la parasitemia en los pacientes. Sí existía un foco activo de transmisión de babesiosis en la región, debiese existir al menos alguno de los contactos secundarios donde la parasitemia fuera notable (>1%), asumiendo que los casos primarios se atendieron tardíamente cuando los niveles de parásitos en la sangre podrían haber pasado a los niveles no detectables del portador crónico. Acorde a Dhawan (2003), los casos confirmados de babesiosis humana se presentan con niveles de parasitemia que fluctúan entre 1-10%, habiéndose registrados con 85% de los eritrocitos infectados. Por otro lado existe una enfermedad que es transmitida por garrapatas y que se ha reportado, ocurre en forma de brotes en conglomerados familiares, llamada Fiebre Moteada de las Montañas Rocosas causada por R. rickettsii (Azad & Beard, 1998). Recientemente se ha descrito en Brasil la ocurrencia de un brote de una fiebre moteada fatal en el estado de Mina Gerais (Galváo et al., 2003), caracterizado por presentarse en conglomerados familiares, asociado con transmisión por la garrapata Ambiyomma caiennense de su agente causal, R. rickettsii. Este organismo es el mismo agente causal de la enfermedad de Tobia descrita en Colombia hace más de 50 años (Patiño et al., 1937), la cual es la misma RMSF (Anónimo, 1998; Azad & Beard, 1993). Esta es una enfermedad febril aguda que ocurre occidente, caracterizada por dolor de cabeza escalofrío, fiebre, dolor muscular y erupción cutánea en tronco y extremidades alrededor del cuarto día de enfermedad. Existen varios puntos en común, que sugieren que el brote de enfermedad que se enfrenta en la vereda La Mazata pueda ser Fiebre de Tobia, ya que su presentación ocurrió en forma de conglomerados familiares, en la región existe la garrapata vector A. caiennense, la que se ha demostrado puede alimentarse fácilmente sobre humanos, el caso secundario principal y cinco de los contactos secundarios poseen historia de erupción cutánea, lo cual es un signo en la RMSF, la evidencia anecdótica o recuperación de un perro medicado con Doxicilina, es una indicación importante que el agente causal es una rickettsia y no un protozoario. Este antibiótico es el de elección en caso de sospecha de rickettsias o Ehrlichias, tanto en humanos como en caninos (Varela, 2003). Es urgente definir si el brote que nos ocupa se trata de la enfermedad de Tobia. En el caso de la RMSF y otras fiebres moteadas, los parásitos se ubican en células epiteliales de los capilares y no es factible detectarlos por examen de extendidos sanguíneos. A pesar de que esta enfermedad se reporta de manera frecuente en clínicas y laboratorios veterinarios del país y de que se utilizan diversos kits de diagnóstico, nuestro laboratorio no conoce la primera lámina obtenida en el país donde se pueda corroborar la ocurrencia de este organismo. Dependiendo de la especie involucrada, el método de diagnóstico de las Ehrlichiosis es la observación microscópica directa en frotis teñidos con Giemsa o el examen serológico (Varela, 2003). En Venezuela recientemente se describió la ocurrencias de E. canis transmitida por la garrapata del perro Rh. sanguineus, lo cual indica que al menos este organismo sí existe en Sudamérica (Unver et al., 2001). Es importante que en Colombia se desarrollen investigaciones epidemiológicas sobre estos microorganismos con capacidad

7 zoonótica, para orientar el diagnóstico y poder desarrollar estrategias de prevención adecuadas para estas enfermedades. Bibliografía Anonymous Disease Vector Ecology Profile. Colombia- Defense Pest Management Information Analysis Center. Armed Forces Pest Management Boa d. Forest Glen Section. rilalter Reed Army Medical Center, Washington, DC. 85p. Azad AF. & Beard CB Rickettsial pathogens and their arthropod vectors. Emerging Infectious Diseases Benavides E Babesiosis bovina: Porcentajes de infección de la garrapata Boophilus microplus con Babesia spp. en el Piedemonte Llanero. Revista ACOVEZ 11 (39),9-15. Benavides E, 2002 Epidemiología y control de los hematozoarios y parásitos tisulares que afectan al ganado. Carta Fedegan 72, (Anexo coleccionable "Manejo Integrado de Plagas y Enfermedades en explotaciones ganaderas 9 ). Centers for Disease Control & Prevention CDC. 2002, Babesiosis. Laboratory Identification of Parasites of Public Health Concern. DPDx. Division of Parasitic Diseases (DPD). Chamberland ME, Epstein J Dodd RY Persing D, Will RG, DeMaria Jr A, Emmanuel JC, Pierce B, & Khabbaz R Blood Safetv. Emerging Infectious Diseases 4 (3), Davies ET Manual de Investigación Veterinaria. Técnicas de Laboratorio. Volumen 1. Traducción del Inglés por Pedro Ducar Maluenda. Editorial Acribia S.A.,Zaragoza.258P. De Waal. DT F4aíne Piroplasmosis: A review. British Veterinary Journal 148, 6 - L4. Dhawan VK Babesiosis. E Medicine. htto :// 193.htm Doss MA, Farr MM, Roach KF. & Anastos G Index-Catalogue of Medical and Veterinary Znology, Specinl Publicarton No. 3. Ticla and Tickborne Diseases. IV. Geographical Distibution of Ticks. USDA, Washington, DC, 648 PP. Galvao MAM, Dumler JS, Mafra CS, Calic SB, Chamone CB, Filho GC' Olano JP' & V9alker DH. 2m3. Fat l spotted fever rickettsiosis. Minas Gerais. Brazil. Emerging Infectious Diseases 9 (11), 1402, 05. Guglielmone AA, Gaido AB. & Mangold AJ Light microscopy diagnosis of Babesia bovis and Babesia bígemina kinetes in the haemolymph of artificially infected Boophilus microplus engorged female ticks. Veterinary Parasitology 61,