Estudio prospectivo de niños con diagnóstico reciente de HIV-1: evaluación de parámetros virológicos, clínicos e inmunológicos.

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1 TÍTULO Estudio prospectivo de niños con diagnóstico reciente de HIV-1: evaluación de parámetros virológicos, clínicos e inmunológicos. Título corto: Estudio prospectivo de niños con HIV-1 1

2 RESUMEN El presente estudio se sitúa en el marco de un país, como es Argentina, que cuenta con terapia antirretroviral de alta eficacia (HAART) y recursos para prevenir la transmisión madre-hijo (TMH) del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) desde hace diez años. A pesar de los recursos disponibles todavía existen muchos casos de niños infectados por el HIV. La mayoría de estos niños infectados por HIV-1 inician HAART luego de su diagnóstico, y deberán seguir recibiéndolo por el resto de sus vidas. Esto conlleva a la posibilidad de encontrarse con problemas de toxicidad de las drogas y/o de falla de la terapia antirretroviral. Considerando que es escasa la información con la que se cuenta a cerca de los niveles de resistencia a las drogas antirretrovirales en población pediátrica de Argentina es que se plantearon los objetivos del presente estudio: analizar prospectivamente los niveles de resistencia a las drogas antirretrovirales en niños infectados por TMH con HIV-1 antes y durante el tratamiento antirretroviral y evaluar su impacto sobre la evolución de la infección en el niño, así como en el sistema de salud pública. Para cumplir con nuestros objetivos se reclutó, entre diciembre de 2004 y mayo de 2008, una población de niños (Edad: 0-14 años) infectados por HIV-1 por TMH, quienes recientemente habían obtenido el diagnóstico de HIV en 2 hospitales pediátricos públicos. Para realizar el estudio de seguimiento se tomó una primera muestra antes de iniciar el HAART, y luego, por el transcurso de 2 años, se tomaron muestras cada 3 meses. Se estudiaron factores inherentes al virus y al hospedador, se midió la presencia de drogas antirretrovirales en plasma, se recabaron datos clínicos y antropométricos de los niños, información de los esquemas terapéuticos administrados y de la historia de TARV en los niños al nacer y de sus madres. Se estudió una población de 101 niños (46 niñas y 55 niños) infectados por HIV-1 (mayoritariamente recombinantes intersubtipos BF). Se halló que en la mayoría de los casos no se tomaron las medidas de prevención necesarias para impedir la TMH, hubo un sub-diagnóstico de las madres durante el embarazo y numerosos niños tuvieron un diagnóstico tardío y fueron el caso índice de la infección por HIV de sus familias. Esto podría sustentarse en las falencias que exhibe un sistema que, aunque dotado de recursos, no resulta eficientemente accesible para la comunidad toda. En el momento del diagnóstico de HIV, aproximadamente la mitad de los niños tenía signos clínicos moderados o graves e inmunosupresión grave, ambos estados asociados a niños de mayor edad. Durante el HAART se observó que los niños con CD4 inicial <15% no lograron normalizarlos, mientras que aquéllos con CD4 15% sí, y sólo el 48% de los niños con signos clínicos moderados o graves al inicio logró mejorar la sintomatología. Además, el ser diagnosticado e iniciar HAART a mayor edad fue un factor de riesgo 2

3 asociado a la falla virológica. Ante este hecho se pone en evidencia la necesidad de un programa global de entrenamiento y capacitación de los trabajadores de la salud en el contexto del SIDA para lograr garantizar los estándares esenciales de cuidado, como es el diagnóstico temprano de la infección pediátrica, en todo el sistema de salud para iniciar HAART en el momento adecuado. La frecuencia de resistencia primaria en la población total fue del 5,9%, pero en la población de niños menores de 1 año de edad fue del 16,1%. El presente trabajo es el primero en describir la frecuencia de mutaciones primarias asociadas a resistencia en una población de niños recientemente diagnosticados con HIV en Argentina y sus resultados fueron tomados como referencia para generar la recomendación de realizar el ensayo de resistencia a todos los niños recién diagnosticados menores de 12 meses de edad en el Primer Consenso Argentino de Terapia Antirretroviral organizado por la Sociedad Argentina de Infectología. En la población seguida durante el HAART se observó que 60% tuvo falla virológica y 73% seleccionó al menos una mutación asociada a resistencia a las drogas antirretrovirales en una mediana de tiempo de 6 meses. Este estudio es pionero en analizar la relación entre la presencia de drogas antirretrovirales en plasma y la respuesta virológica, ya sea desde lo cuantitativo (CV plasmática) o lo cualitativo (perfil de resistencia a las drogas). En este análisis se halló una mayor frecuencia de supresión de la CV si las drogas antivirales se encontraban detectables en el plasma. Los niños que no suprimieron su CV seleccionaron mutaciones primarias asociadas a resistencia con mayor frecuencia y en menos tiempo que aquellos que sí la suprimieron. Una pobre adherencia al tratamiento parecería ser la causa más probable de la falla virológica y de la resistencia antiviral en esta población. Mediante la implementación de un tratamiento directamente observado se podría mejorar la adherencia y consecuentemente, determinar si el mayor obstáculo para la efectividad del HAART en niños en nuestro contexto social es realmente la adherencia y podría aumentar las probabilidades de lograr tratamientos exitosos. Por vez primera se presenta clara evidencia del impacto sobre el desarrollo de resistencia de las poblaciones minoritarias entre las cuasiespecies virales exhibiendo mutaciones primarias asociadas a resistencia una vez iniciado el HAART en población pediátrica. Así se advirtió que una contribución de entre 2 y 10% de la población viral dotada con la mutación M184V antes de iniciar TARV otorgaría una predisposición aumentada de seleccionarla en un tiempo muy corto tras el inicio de HAART. Este trabajo realiza un importante aporte dirigido a mejorar la calidad de vida de los niños con infección por HIV, demostrando por primera vez en nuestro medio la necesidad de monitorear resistencia en niños menores de un año de edad y recientemente diagnosticados con HIV, como así también analizando y 3

4 relacionando la falla al tratamiento a niveles de drogas antirretrovirales en sangre y a la presencia de cuasiespecies minoritarias con mutaciones asociadas a la resistencia al TARV. Estos datos tienen un impacto directo al momento de tomar decisiones sobre intervenciones en los niños. En conclusión, en un país como Argentina, en donde los recursos para la prevención y los cuidados clínicos han estado disponibles durante más de una década, es urgente focalizar los esfuerzos en aumentar el acceso a intervenciones efectivas para prevenir la adquisición de la infección por HIV. Los resultados presentados indican claramente que es fundamental monitorear la resistencia antes de iniciar tratamiento, encontrar la manera de mejorar la adherencia, así como también intensificar la investigación y las aplicaciones tecnológicas para la detección de cuasiespecies minoritarias que permitan disponer de mejores herramientas con el objetivo de mejorar la calidad de vida de los niños infectados por HIV. 4

5 ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN...7 La epidemia de HIV/SIDA...7 Situación de la epidemia de HIV/SIDA en Argentina en menores de 13 años...7 La infección por HIV en población pediátrica...7 Monitoreo de la infección pediátrica...8 Tratamiento antirretroviral...9 Tratamiento antirretroviral en población pediátrica...9 Drogas antirretrovirales...10 Esquemas de tratamiento en niños...12 Resistencia a las drogas antirretrovirales...12 Mutaciones virales asociadas a resistencia...13 Detección de resistencia a drogas antirretrovirales...13 Estado del conocimiento de la resistencia a las drogas antirretrovirales en niños...14 II. OBJETIVOS E HIPÓTESIS...17 Objetivos...17 Hipótesis...17 III. MATERIALES Y MÉTODOS...18 Población bajo estudio...18 Obtención y procesamiento de las muestras...18 Medición de la carga viral plasmática...18 Estudio de poblaciones celulares...19 Amplificación de la región pol del genoma viral y secuenciación nucleotídica...19 Estudio genotípico de resistencia a las drogas antirretrovirales...20 Subtipificación viral...20 Detección de poblaciones virales minoritarias...20 Dosaje de drogas antirretrovirales en plasma...21 Datos clínicos...21 Tratamiento antirretroviral...21 Recopilación y análisis estadístico de los datos...22 IV. RESULTADOS...23 Sección IV. 1. Análisis de factores inherentes al virus, a su hospedador y a la madre del hospedador en el momento del diagnóstico de la infección por HIV en el niño...25 Sección IV. 2. Análisis de la transmisión de variantes del HIV con comportamiento diferencial frente a las drogas antirretrovirales y su posterior selección durante el TARV...27 IV Análisis de la transmisión madre-hijo o de la selección natural de virus con mutaciones primarias asociadas a resistencia a las drogas antirretrovirales...27 IV Análisis de la selección de virus con mutaciones primarias asociadas a resistencia a las drogas antirretrovirales durante el HAART...28 Sección IV. 3. Análisis de parámetros clínicos, inmunológicos, terapéuticos y virológicos antes y durante el TARV...31 IV Análisis de parámetros clínicos, inmunológicos, terapéuticos y virológicos en el momento del diagnóstico de HIV...31 IV Análisis de parámetros clínicos, inmunológicos, terapéuticos y virológicos durante el tratamiento antirretroviral...33 Sección IV. 4. Resumen de resultados...38 V. DISCUSION...41 VI. CONCLUSIONES...48 VII. TABLAS Y FIGURAS...50 Tabla 1: Distribución de los casos notificados de SIDA y nuevos diagnósticos de HIV según vía de transmisión. Año Tabla 2: Categorías clínicas en niños infectados por HIV...51 Tabla 3: Categorías inmunológicas en niños infectados por HIV, basadas en el recuento y porcentaje de LTCD4+, según edad...52 Tabla 4. Historia de TARV de los niños y sus madres Tabla 5. Edad, tipo de parto y vía de infección por HIV de las madres...53 Tabla 6. Características y parámetros inmunológicos, virológicos y clínicos de la población pediátrica estudiada en el momento de ingreso al estudio

6 Tabla 7. Parámetros inmunológicos de la población pediátrica estudiada en el momento de ingreso al estudio...54 Tabla 8. Resistencia predictiva a las drogas antirretrovirales e historia de TARV en niños con mutaciones primarias asociadas a resistencia...54 Tabla 9. Porcentajes de poblaciones minoritarias de K103N y M184V en muestras basales Tabla 10. Selección de mutaciones primarias asociadas a resistencia a las drogas antirretrovirales en niños bajo HAART...56 Tabla 11. Detalle de la selección de mutaciones primarias asociadas a resistencia a cada uno de los grupos de drogas antirretrovirales en niños bajo HAART Tabla 12. Cambio de los z scores de peso y talla durante el tratamiento antirretroviral...57 Figura 1: Evolución de los casos de HIV/SIDA por transmisión vertical en Argentina según año de infección / nacimiento, Figura 2: Diferencias en el curso de la carga viral y la respuesta inmune específica entre niños y adultos Figura 3: Mutaciones en el gen de la transcriptasa reversa asociadas a la resistencia a los inhibidores nucleosídicos y no-nucleosídicos (NRTIs y NNRTIs) Figura 4: Mutaciones en los genes de la PR, envoltura e IN, asociadas a resistencia a los inhibidores de la proteasa, de fusión y de la integrasa, respectivamente Figura 5: Análisis filogenético de los virus...61 Figura 6. Progreso inmunológico en niños bajo HAART Figura 7. Progreso de peso y talla en niños bajo HAART Figura 8. Selección de mutaciones asociadas a resistencia en niños bajo HAART según la respuesta virológica Figura 9. Selección de M184V durante el HAART según la presencia previa de poblaciones virales minoritarias con esa mutación VIII. REFERENCIAS

7 I. INTRODUCCIÓN La epidemia de HIV/SIDA Según el reporte mundial publicado por el Programa Conjunto de las Naciones Unidas sobre el HIV/SIDA (ONUSIDA) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) en diciembre de 2007 [1] cada día en el mundo, más de 6800 personas contraen infección por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y más de 5700 fallecen a causa del Sindrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), en la mayoría de los casos debido a un acceso inadecuado a los servicios de prevención y tratamiento de la infección por HIV. La pandemia del HIV sigue constituyendo uno de los desafíos más importantes en enfermedades infecciosas para la salud pública. En Argentina las estimaciones durante el año 2007 en forma conjunta entre ONUSIDA, la OMS y la Dirección de SIDA y Enfermedades de Transmisión Sexual (ETS) del Ministerio de Salud de la Nación [2] muestran que aproximadamente ( a ) personas viven con HIV/SIDA, de las cuales un 50% desconocerían su situación serológica. Existe un total de casos notificados de SIDA, pero se estima que el total real de enfermos diagnosticados sería de (25% mujeres y 75% hombres). Los diagnósticos de HIV notificados, son en todo el país casos. La razón por sexo en el 2006 en casos notificados de SIDA fue de 2,4 hombres por mujer y en HIV notificados fue de 1,5 hombres por mujer. Esto denota la importancia que ha cobrado la epidemia en la población heterosexual y principalmente en las mujeres en los últimos años. La distribución de casos según vías de transmisión se detalla en la Tabla 1. Situación de la epidemia de HIV/SIDA en Argentina en menores de 13 años El total de casos notificados de SIDA y HIV en los menores de 13 años a diciembre 2007 fue de 4174, con distribución por sexo similar. La transmisión madre-hijo (TMH) representa el 95% de los casos, siendo un 3% desconocido y un 2% por otras causas (abuso sexual, inicio temprano de las relaciones sexuales, uso de drogas y transfusiones) [2]. La evolución del número de casos de HIV/SIDA según el año se grafica en la Figura 1. La infección por HIV en población pediátrica En la infección por HIV los niños no se comportan como adultos pequeños. Sin tratamiento antirretroviral (TARV) existe una presentación bimodal de la infección: en un 10-25% de los niños se observa una rápida progresión a SIDA y complicaciones letales durante el primer año de vida. En un 75-90% existe un curso de la infección más leve, con aproximadamente 8 años hasta la presentación de síntomas asociados al SIDA. 7

8 En el nacimiento, la carga viral (CV) es generalmente baja (< copias/ml) y luego aumenta rápidamente durante las siguientes 2 semanas a valores superiores a las copias/ml, para luego de 4-5 años empezar a disminuir nuevamente [3-5] (Figura 2). La dinámica de infección es significativamente distinta a la de los adultos sin TARV, en quienes se observa un rápido aumento y descenso de la CV pocos meses después de la infección aguda (Figura 2). En niños la alta CV está asociada al crecimiento somático del sistema linfático, a la inhabilidad del sistema inmune inmaduro de montar una respuesta HIV-específica y posiblemente a un número mayor de células susceptibles al HIV. El espectro de manifestaciones clínicas también es diferente. La seroconversión en niños infectados verticalmente no ha sido descripta, así como se ha descripto el Síndrome Retroviral Agudo en adultos. Actualmente, la progresión de la enfermedad está principalmente influenciada por la eficiencia del TARV. Monitoreo de la infección pediátrica El monitoreo de la infección por HIV-1 en el niño se realiza con el seguimiento del estado clínico (signoes y síntomas), inmunológico (recuento de Linfocitos T CD4+) y virológico (recuento de CV plasmática). La clasificación clínica según los signos y síntomas presentes en los niños se detalla en la Tabla 2. La interpretación del recuento de Linfocitos T CD4+ (LTCD4+) en niños debe tener en cuenta la edad como una variable. Se desarrolló un sistema de clasificación inmunológica en población pediátrica, que incluye definiciones de supresión inmunológica relacionada a la edad del niño (Tabla 3)[6]. A pesar que el recuento absoluto de LTCD4+ cambia con la edad, el porcentaje de LTCD4+ no, convirtiéndose este último en un mejor marcador de progresión de la enfermedad. En adultos y niños infectados el recuento de LTCD4+ decae a lo largo de la infección; pacientes con menores recuentos tienen un pronóstico peor que aquéllos con mayor recuento. Los niños durante el primer año de vida tienen proporcionalmente mayor riesgo de progresar a SIDA; sin embargo, todos los grupos etarios muestran un rápido aumento de riesgo si el porcentaje de LTCD4+ decae por debajo del 15-20%. El riesgo de progresión a SIDA o muerte aumenta dramáticamente cuando la CV excede las copias/ml [7]. A pesar de que existen datos que indican que altos niveles de CV están asociados a la progresión a SIDA, el valor predictivo de la carga viral en niños es moderado [8, 9]. Por esto, los niveles de CV y el porcentaje de LTCD4+ proveen información complementaria e independiente para el seguimiento de los niños. Es importante contar con una determinación de CV y porcentaje de LTCD4+ en el momento del diagnóstico y cada 3-4 meses de ahí en adelante. Sin embargo, se debe considerar un monitoreo más 8

9 frecuente en caso de sospecha de deterioro clínico, inmunológico o virológico, en niños menores de 1 año, para confirmar valores anormales y antes de iniciar o modificar el TARV. Tratamiento antirretroviral El conocimiento acerca de los mecanismos moleculares implicados en cada etapa del ciclo de replicación del HIV ha proporcionado las bases esenciales para el descubrimiento y desarrollo de drogas antivirales y terapias destinadas a inhibir la replicación del virus, y prevenir o retrasar la evolución de la enfermedad. Hasta el momento, el enfoque más desarrollado ha resultado ser la inhibición de dos enzimas virales esenciales, la transcriptasa reversa (RT) y la proteasa (PR) virales. Sin embargo, otros pasos del ciclo de replicación, como ser la entrada a la célula y la integración al genoma celular, ya son un blanco de los agentes antivirales. Tratamiento antirretroviral en población pediátrica En los últimos 20 años el TARV ha aportado un beneficio clínico a niños infectados por HIV con síntomas clínicos o inmunológicos, especialmente desde que se cuenta con tratamientos más potentes. Los estudios iniciales de monoterapia en niños a principios de los años 90 demostraron beneficios clínicos e inmunológicos significativos [10-13]. Estudios posteriores demostraron que la terapia combinada, inicialmente con 2 inhibidores nucleosídicos de la RT llevaba a mejores resultados clínicos, virológicos e inmunológicos que la monoterapia [14-16]. Actualmente, se recomienda el TARV de alta eficacia o HAART (Highly Active Antiretroviral Treatment), incluyendo al menos 3 drogas. Estos regímenes se han asociado a mayor sobrevida, reducción de infecciones oportunistas y otras complicaciones de la infección por HIV, mayor crecimiento de la funcionalidad neurocognitiva, y mejor calidad de vida de los niños [17-22]. El tratamiento con HAART tiene un impacto dramático sobre la salud de los niños infectados por HIV. Sin embargo, para alcanzar este beneficio se requiere rigurosa adherencia a los demandantes esquemas de tratamiento y, además, tener en cuenta la posibilidad de presentación a corto y largo plazo de toxicidad [23, 24]. A pesar de que la patogenia de HIV y que los principios virológicos e inmunológicos que subyacen el uso del TARV son similares para todas las personas infectadas con HIV, existen consideraciones únicas para niños y adolescentes infectados, incluyendo: 9

10 Adquisición de infección por exposición perinatal en la mayoría de los casos. La mayoría de las transmisiones perinatales ocurren durante o cerca del nacimiento, lo que permite el inicio de TARV durante el periodo temprano de la infección (infección primaria). El TARV podría ocurrir en un contexto de previa exposición a Zidovudina (AZT) u otras drogas antirretrovirales in utero, durante y/o después del parto en muchos niños expuestos. La infección perinatal ocurre durante el desarrollo del sistema inmune del niño en crecimiento, por lo tanto se verán diferencias en las manifestaciones clínicas y virológicas secundarias a la ocurrencia de la infección primaria. Cambios con la edad en parámetros farmacocinéticos que con el continuo desarrollo y maduración de los sistemas de órganos involucrados en el metabolismo de drogas requieren evaluaciones específicas de dosis y toxicidad. Antes de iniciar el TARV se necesitan tener en cuenta una serie de factores [25], incluyendo: Severidad de la enfermedad por HIV y el riesgo de progresión a SIDA, determinado por la edad, la CV, el porcentaje de LTCD4+, y la presencia de enfermedades marcadoras de SIDA. Disponibilidad de formulaciones pediátricas apropiadas (y de sabor agradable) para niños y de información farmacocinética de la dosis adecuada para la edad. Potencia, complejidad (frecuencia de dosis, requerimiento de comida, etc) y potenciales efectos adversos a corto y largo plazo de la drogas administradas. Efecto del esquema inicial elegido sobre futuras opciones de tratamiento. Presencia de co-infecciones o enfermedades (Hepatitis B o C, Tuberculosis, enfermedad en riñón o hígado) que podrían afectar en la elección de las drogas. Potenciales interacciones entre las drogas antirretrovirales y otros medicamentos que el niño consuma. Habilidad del tutor y/o del niño para adherir al tratamiento. Drogas antirretrovirales En la actualidad existen alrededor de 12 drogas que han sido aprobadas para tratamientos pediátricos. Sin embargo, no todas estas drogas están disponibles en Argentina en formulación pediátrica. Muchas veces se debe recurrir a fraccionar comprimidos para adultos para llegar a una dosis pediátrica, con el riesgo que esta práctica conlleva de obtener dosis inadecuadas. 10

11 Las drogas más utilizadas en Argentina para el tratamiento de niños y adolescentes son: 1) Inhibidores de la RT: Inhibidores nucleosídicos de la RT (Nucleoside Analogue Reverse Transcriptase Inhibitors, NRTIs): Estos compuestos son derivados de los nucleósidos nativos utilizados durante la replicación del genoma viral, y comparten con éstos varias características estructurales y funcionales. Luego de ingresar a la célula, las pro-drogas son convertidas en su forma activa 5 -trifosfato. Estos análogos inhiben la transcripción reversa compitiendo con los nucleótidos nativos por la unión a la RT y, debido a que carecen de un grupo 3 -OH en su estructura, provocan la terminación de la elongación de la cadena de Ácido Desoxirribonucleico (ADN) cuando son incorporados a la misma [26-28]. AZT, lamivudina (3TC), didanosina (DDI), estavudina (D4T), abacavir (ABC) y emtricitabina (FTC) son los NRTIs más utilizados. Salvo el FTC, los demás se suelen conseguir líquidos o en polvos solubles en agua. Inhibidores no nucleosídicos de la RT (Non-Nucleoside Analogue Reverse Transcriptase Inhibitors, NNRTIs): son un grupo diverso de compuestos que inhiben a la RT de HIV a través de un mecanismo diferente a los inhibidores nucleosídicos. Los NNRTIs inhiben directamente a la RT uniéndose a la enzima de una manera no competitiva, impidiendo que la transcriptasa pueda actuar formando una cadena de ADN. Debido a que interaccionan con un sitio de unión específico de la enzima, cualquier modificación, como por ejemplo una mutación puntual, puede afectar la sensibilidad del virus a este tipo de drogas, desarrollando resistencia rápidamente. En la actualidad son 2 los NNRTIs que se utilizan para el tratamiento de niños con HIV: nevirapina (NVP) y efavirenz (EFV). La NVP se encuentra disponible en formulación líquida mientras que el EFV no, además de tener limitaciones en su uso según la edad del niño. 2) Inhibidores de la PR (IPs): estos compuestos son capaces de inhibir selectivamente la actividad de la PR de HIV-1, inhibiendo el clivaje de la proteína precursora Gag-Pol. De esta manera, se impide la maduración de los nuevos virus, haciéndolos no infecciosos y, por lo tanto, impidiendo nuevos ciclos de infección en otras células. Los IPs disponibles para niños que no pueden ingerir comprimidos o cápsulas son: nelfinavir (NFV) y lopinavir/ritonavir (LPV/rtv), disponibles en polvo soluble y jarabe, respectivamente. El fosamprenavir (FPV) sólo está disponible en comprimidos. 3) Inhibidores de la fusión (IF): estas drogas inhiben la unión o fusión del virus a la célula blanco. El enfuvirtide (T-20) es el único IF aprobado y se ha demostrado que es efectivo y seguro en niños mayores de 6 años de edad con experiencia previa con otras drogas antirretrovirales, y quienes han fallado a tres clases de drogas [29]. 11

12 Esquemas de tratamiento en niños La estrategia actual de la indicación oportuna del TARV es lograr la máxima supresión viral, evitar el desarrollo de resistencia y preservar o restaurar la función inmunológica. Siendo la mayoría de los casos de HIV por TMH, es importante definir tempranamente la condición de infectado a fin de iniciar el tratamiento lo más próximo a la finalización de la profilaxis del recién nacido. Los esquemas terapéuticos recomendados para niños son aquellos de los que se dispone información de estudios clínicos, en los cuales se demostró eficacia y durabilidad óptimas, con toxicidad aceptable y facilidad para administrar. Estos esquemas son: Basados en NNRTIs (1 NNRTI + 2 NRTIs): - EFV en combinación con 2 NRTIs para niños 3 años. (Puede usarse NVP como alternativa de no poder administrar EFV). - NVP en combinación con 2 NRTIs para niños < 3 años o que requieran formulación líquida. Basados en IPs (1 ó 2 IPs + 2 NRTIs): especialmente para niños <2 años - LPV/rtv en combinación con 2 NRTIs (Puede usarse NFV como alternativa). Selección de los NRTIs : - AZT + 3TC o DDI - ABC + AZT - DDI + 3TC o ABC + 3TC o D4T + 3TC (alternativos). D4T sólo en circunstancias especiales. Debido al constante avance en el conocimiento de la infección por HIV y al desarrollo de nuevas drogas antirretrovirales, es necesario actualizar permanentemente los esquemas terapéuticos recomendados en población pediátrica. Dichas actualizaciones se encuentran disponibles en el sitio web del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos [25]. Resistencia a las drogas antirretrovirales. Se define resistencia a cualquier cambio que restaure la replicación viral en presencia de un inhibidor. La aparición de variantes de HIV resistentes a drogas es un factor importante en la falla terapéutica ocurrida en pacientes bajo TARV. El fenotipo resistente a drogas fue reportado inicialmente durante el tratamiento con AZT. Sin embargo, el desarrollo de variantes resistentes ha sido observado para todos las drogas antirretrovirales aprobadas para el tratamiento de la infección. 12

13 Mutaciones virales asociadas a resistencia Debido a la baja fidelidad de copia de la RT viral, y a la elevada tasa de replicación viral en los individuos infectados, las mutaciones se acumulan rápidamente, dando como resultado una población viral heterogénea. El estudio de datos provenientes del análisis de secuencias nucleotídicas de virus resistentes ha permitido identificar mutaciones puntuales en los genes que codifican para los principales blancos de las drogas antirretrovirales (RT y PR virales), que resultan en sustituciones aminoacídicas simples y que se han asociado a distintos fenotipos resistentes. Las mutaciones que confieren resistencia pueden transmitirse durante las infecciones de novo, provocando su diseminación en la población [30-32]. Es importante tener en cuenta que la dinámica y la frecuencia en la generación de resistencia a drogas no es la misma para todos las drogas antirretrovirales. Bajo ciertas condiciones terapéuticas, como por ejemplo con AZT o Indinavir (IDV), se generan altos niveles de resistencia después de un largo tiempo de selección (6 meses a 2 años) [33-35], ya que un gran número de mutaciones deben estar presentes para conferir un alto grado de resistencia. Por el contrario, con drogas como NVP o 3TC, una simple mutación confiere altos niveles de resistencia en escaso tiempo (al mes si de administran como monoterapia) [36-38]. Estos fenómenos demuestran que la barrera genética que el virus debe superar para generar resistencia depende de la droga y de la combinación de drogas utilizadas. Las mutaciones asociadas a resistencia a los distintos grupos de drogas antirretrovirales descriptas por la Sociedad Internacional de SIDA se detallan en las Figuras 3 y 4. Detección de resistencia a drogas antirretrovirales Teniendo en cuenta que la emergencia de mutantes resistentes de HIV-1 es el resultado de un fenotipo alterado por un cambio de genotipo viral, se puede realizar la detección de resistencia a las drogas antirretrovirales mediante estudios genotípicos o fenotípicos. Los ensayos genotípicos detectan mutaciones en el genoma viral asociadas a resistencia a determinadas drogas antirretrovirales en el contexto de una secuencia consenso resultante de la heterogeneidad de cuasiespecies, mientras que los fenotípicos miden in vitro la capacidad del virus en la muestra de crecer en presencia de drogas antirretrovirales. El ensayo utilizado para este trabajo fue la secuenciación nucleotídica (ensayo genotípico) de una región del gen pol que codifica para las enzimas RT y PR. Éste permite la determinación de cambios en el genoma viral que pueden resultar en alteraciones de la secuencia aminoacídica de las proteínas virales. Los estudios de genotipo son potencialmente de alta sensibilidad debido a que se obtiene una secuencia completa y precisa que permite un análisis de todas las mutaciones posibles. Sin embargo, debido a que la secuencia 13

14 obtenida es una secuencia consenso que refleja la secuencia mayoritaria (aquella que está presente en más de un 20% en la población viral), las mutaciones que se evidencien sólo serán aquellas de la cuasiespecie mayoritaria. Por lo tanto, pueden no detectarse las variantes minoritarias del total de la población viral de un individuo infectado, las cuales podrían predominar más adelante bajo una determinada presión selectiva de drogas. Estado del conocimiento de la resistencia a las drogas antirretrovirales en niños La TMH del HIV puede ser reducida con el TARV de la madre (durante el embarazo y parto) y del recién nacido (RN). La implementación del Protocolo ACTG 076 (AZT oral durante el embarazo, AZT endovenoso durante el parto y 6 semanas de jarabe de AZT al RN) ha demostrado un descenso del 70% de la TMH del HIV [39, 40]. Luego, se observó un descenso más pronunciado aún desde la implementación de HAART para la prevención de la transmisión vertical [41, 42]. Desde 1990 la Argentina cuenta con el la Ley Nacional de SIDA [43] que protege y garantiza TARV universal y gratis para todo individuo infectado por HIV. También se cuenta con una Ley Nacional, sancionada en 2001 [44], que establece la obligatoriedad de ofrecer el diagnóstico de HIV a toda mujer embarazada. Se recomienda la implementación de TARV durante el embarazo, pudiéndose conseguir gratis la medicación para las madres y sus RN en todos los establecimientos asistenciales del subsector público. Se estimula a las madres infectadas a que no amamanten a sus hijos y se les provee en forma gratuita leche en polvo (fórmula de inicio) en todos los hospitales con maternidad. Se recomienda realizar el parto por cesárea electiva en mujeres sin ningún tipo de profilaxis o con CV >1.000 copias/ml. Con este marco legal y disponibilidad de recursos, se esperaría que la TMH del HIV en Argentina sea prácticamente nula. Sin embargo, así como en otros países en desarrollo, la Argentina sigue teniendo un alto número de niños infectados por TMH del HIV [2]. En los últimos 5 años se han diagnosticado en el Centro Nacional de Referencia para el SIDA (CNRS) 184 niños de una población de 2750 niños, indicando una prevalencia del 6,7%. La mayoría de los niños infectados por HIV-1 inician HAART luego de su diagnóstico, y deberán seguir recibiéndolo por el resto de sus vidas. Esto conlleva a la posibilidad de encontrarse con problemas de toxicidad de las drogas y/o de falla del TARV. La falla de tratamiento puede deberse a distintos motivos, incluyendo baja potencia y variaciones en el metabolismo de las drogas [45, 46]. Sin embargo, las dos causas más importantes son la baja adherencia al tratamiento y el desarrollo de resistencia al TARV, asociada a la emergencia de mutaciones en el genoma de HIV. Tanto en adultos como en niños, la 14

15 presencia de variantes resistentes puede tener un grave efecto sobre el progreso de la infección hacia SIDA, ya que reducen las opciones de drogas antirretrovirales activas [47-49]. Así como la epidemia de SIDA continúa creciendo en mujeres en edad reproductiva [50] y la infección primaria con cepas de HIV resistentes a las drogas antirretrovirales sigue en aumento en población adulta [51-53], es esperable que el riesgo de la TMH de variantes resistentes también aumente. Asimismo, el mayor número de mujeres recibiendo TARV antes y durante el embarazo podría contribuir a este hecho [54]. De hecho, ya se ha documentado la transmisión vertical de cepas resistentes [55-71]. Como ya se mencionó anteriormente, la evolución de la infección en niños difiere de la de adultos. Existen trabajos que han descripto la evolución de parámetros clínicos, inmunológicos y virológicos (incluyendo desarrollo de resistencia) en población pediátrica bajo TARV [67, 68, 72-79]. Algunos muestran los resultados de estudios con AZT en monoterapia [63], con esquemas de 2 drogas [67, 68, 72-74] y otros con HAART [67, 68, 72-79]. La mayoría de estos trabajos estudian poblaciones de niños con historia previa de TARV; son muy pocos los estudios que incluyen al menos un grupo de niños durante su primer esquema terapéutico [63, 66, 72, 76, 77, 80]. Por otro lado, todos estos estudios analizan poblaciones de niños de Estados Unidos de Norte América (EE.UU.) y países de Europa y África, excepto algunos que se realizaron en Brasil [72, 73, 80]. Además, estos trabajos llevados a cabo en Brasil son los únicos que incluyen algunos niños con una recombinante BF del HIV-1, que como ya se mencionó anteriormente tiene una alta prevalencia en Argentina [81-85]. El hecho que todavía existan numerosos casos de niños infectados por HIV-1 por TMH, la posibilidad de que inicien un TARV de alta eficacia, los escasos estudios realizados en América del Sur, más la característica particular de la epidemia local con alta prevalencia de variantes recombinantes BF infrecuentes en otros lugares del mundo, impulsó que se estableciera el objetivo de llevar a cabo el primer estudio prospectivo que analiza la resistencia al TARV en niños recientemente diagnosticados con HIV-1 de Argentina. Este estudio ha permitido, por un lado, analizar prospectivamente los niveles de resistencia a las drogas antirretrovirales en niños infectados por TMH con HIV-1 antes y durante el tratamiento antirretroviral. Asimismo, describe parámetros clínicos, inmunológicos y virológicos al momento del diagnóstico, tales como la frecuencia de variantes del HIV-1 resistentes al TARV, así como el tiempo transcurrido y el grado de enfermedad de los niños cuando son diagnosticados, entre otros. Por otro lado, ha permitido describir la evolución de la infección en aquellos niños que inicien TARV, evaluando el éxito o falla de la terapia e intentando encontrar factores asociados (presencia de resistencia, adherencia al tratamiento, edad de inicio del HAART, entre 15

16 otros) a uno u otro evento. Asimismo, pretende analizar la utilidad (para el paciente y para el sistema de salud pública) del estudio de resistencia, tanto para la elección del primer esquema terapéutico como para los alternativos ante una falla terapéutica. 16

17 II. OBJETIVOS E HIPÓTESIS Objetivos Estudiar la prevalencia de cepas del HIV-1 con mutaciones asociadas a la resistencia a las drogas antirretrovirales. Analizar el impacto de la presencia de cuasiespecies virales minoritarias con mutaciones asociadas a resistencia a las drogas antirretrovirales antes del inicio de la terapia sobre la resistencia una vez iniciado el HAART. Determinar la relación de niveles de drogas antirretrovirales en sangre con la falla virológica y la selección de variantes virales resistentes al TARV. Hipótesis El conocimiento de la resistencia basal es una herramienta útil para la toma de decisiones terapéuticas. Es claro que aquella se encuentra influenciada por múltiples factores relacionados tanto con el virus como con el hospedador. Inherentes al hospedador, deben considerarse factores tales como la disponibilidad de formulaciones pediátricas de las drogas antirretrovirales y la implícita dependencia de un adulto responsable para la administración de la medicación. Sobre la base de ello se hipotetiza que: La presencia de un escenario que predispone hacia una pobre adherencia al tratamiento favorece la falla virológica, con aparición (o no) de cepas con mutaciones asociadas a resistencia. Referido al virus, es conocida su plasticidad genómica que le otorga la capacidad de generar variantes con distinto grado de adaptabilidad. Entre éstas se encuentra la posible presencia de cuasisespecies dotadas de mutaciones asociadas a resistencia y con una contribución cuantitativa minoritaria. Si existe en la población viral que infecta al niño una contribución minoritaria (no detectable por métodos de genotipificación tradicionales) de cepas con mutaciones asociadas a resistencia, la presión de selección ejercida por el tratamiento antirretroviral promoverá su predominancia. 17

18 III. MATERIALES Y MÉTODOS Población bajo estudio Todos los individuos estudiados procedían de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y sus alrededores (mayoritariamente de los alrededores), y de la Ciudad de La Plata, regiones en las cuales se han notificado la mayoría de los casos pediátricos de SIDA y de infectados con HIV en la Argentina. La población estudiada corresponde a niños (Edad: 0-14 años) infectados con HIV-1 por TMH, quienes recientemente obtuvieron el diagnóstico en 2 hospitales pediátricos públicos y cuyos padres o tutores aceptaron participar en el estudio. Para esto último los padres/tutores fueron informados sobre el mismo y firmaron un formulario de Consentimiento Informado. Se utilizó el criterio de los Centros de para el Control y prevención de Enfermedades de EE.UU. (CDC, Centers for Disease Control and Prevention) para el diagnóstico de HIV: tener 2 muestras con al menos una determinación virológica (p24 plasmático o ADN proviral cualitativo) positiva en cada una. En el momento de firmar el consentimiento informado, el infectólogo realizó una anamnesis a las madres y completó un formulario de datos del TARV de ellas y su hijo/hija. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. Obtención y procesamiento de las muestras El esquema de muestreo utilizado fue el siguiente: se tomó una primera muestra luego de contar con el diagnóstico de infección por HIV y antes de iniciar el TARV, considerada como muestra basal. Luego, por el transcurso de 2 años, como mínimo y siempre que fuera posible, se tomaron muestras cada 3 meses aproximadamente (existiera o no TARV). En todos los casos se extrajo sangre periférica por punción venosa utilizando ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante. Un tubo de sangre entera se utilizó para el recuento de poblaciones linfocitarias de sangre periférica (linfocitos T CD3+, CD4+ y/o CD8+). De otro tubo de sangre se separó el plasma para la determinación de carga viral plasmática, resistencia a las drogas antirretrovirales, detección de drogas en plasma y subtipificación viral. Medición de la carga viral plasmática La carga viral plasmática fue evaluada como parámetro de la replicación viral existente en los pacientes. Se realizó por el método del ADN ramificado (b-dna, branched DNA) con un límite de detección de 50 copias 18

19 de ARN del HIV-1/ml [VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay (bdna), Bayer Corporation, CA, EE.UU.], siguiendo las especificaciones del fabricante. Estudio de poblaciones celulares Las poblaciones linfocitarias de sangre periférica (Linfocitos T CD4+ y/o CD8+) se estudiaron para evaluar el estado inmunológico de los pacientes. Según los valores obtenidos se determinó la categoría inmunológica de los pacientes siguiendo la clasificación del CDC del año 1994 [6] (Tabla 3). Para poder realizar análisis de todos los niños juntos, independientemente de su edad, se calcularon valores z (z scores) del recuento total de LTCD4+ y del porcentaje de esta población según la edad. Para estos cálculos se utilizaron valores absolutos y porcentuales de LTCD4+ de niños sanos de Argentina [86]. La cuantificación de poblaciones linfocitarias se realizó por citometría de flujo (Coulter XL, Coulter Co., Hialeah, Fl, EE.UU.). Amplificación de la región pol del genoma viral y secuenciación nucleotídica La amplificación de la región pol del genoma viral se realizó para poder llevar a cabo luego: 1) la secuenciación nucleotídica de la misma y posterior estudio genotípico de mutaciones asociadas a resistencia a las drogas antirretrovirales y, 2) el estudio de poblaciones minoritarias asociadas a resistencia. El ARN del HIV-1 fue extraído a partir de 140 µl de plasma utilizando el equipo comercial QIAamp viral extraction kit (QIAGEN GmgH, Hilden, Alemania), siguiendo las especificaciones del fabricante. El ARN viral extraído fue empleado en una retrotranscripción a ADN copia (ADNc), seguido de dos reacciones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa, Polimerase Chain Reaction), donde se amplifican regiones de los genes PR y RT por medio de una RT-PCR nested (retrotranscripción-pcr anidada). Los productos de amplificación se emplearon luego en reacciones de secuenciación, utilizando el BigDye Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), con el fin de obtener la secuencia nucleotídica completa del gen que codifica para la PR viral (codones 1-99) y la secuencia nucleotídica parcial del gen que codifica para la RT viral (codones 1-400), siguiendo el procedimiento descripto previamente [87]. Los productos de las reacciones de secuenciación fueron purificados mediante reacciones de precipitación etanólica, y analizados en un secuenciador automático ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Las secuencias nucleotídicas obtenidas a partir de cada par de primers fueron ensambladas y analizadas mediante el software de análisis de secuencias Sequencer versión 4.8 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, E.E.U.U.). 19

20 Estudio genotípico de resistencia a las drogas antirretrovirales Luego del ensamblaje, las secuencias nucleotídicas de la PR y RT del HIV-1 fueron analizadas usando el sistema de interpretación HIVdb: Drug Resistance Algorithm (Beta Test) version 4, Stanford HIV Drug Resistance Database (Stanford University, E.E.U.U.) [88], para evaluar la presencia de mutaciones asociadas a resistencia a los antirretrovirales. Subtipificación viral La subtipificación del virus se realizó para conocer el subtipo de los virus que infectaron a los pacientes. Para esto, las secuencias obtenidas, según lo descripto anteriormente, fueron alineadas con secuencias de referencia de los diferentes subtipos del HIV-1 existentes [89] utilizando el programa Clustal W (BioEdit sequence alignment editor) [90] y las similaridades fueron analizadas con el programa Simplot 2.5. (J Hopkins University, Baltimore, MD, USA) [91]. El análisis filogenético se realizó mediante un árbol construido por el método de Neighbor Joining con el programa MEGA3 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis versión 2.1, de Kumar, Tamura, Jakobser y Nei) bajo el modelo evolutivo K2P, T/t: 2.0. Test estadístico: Bootstrapping, 500 réplicas. Detección de poblaciones virales minoritarias La detección de poblaciones virales minoritarias con mutaciones asociadas a resistencia a las drogas antirretrovirales se realizó con el objetivo de detectar mínimas cantidades de virus que porten estas mutaciones, imposibles de ser detectadas por los métodos de genotipificación estándares. Por medio de la utilización de PCR en tiempo real para una amplificación selectiva se estudió la presencia de poblaciones minoritarias de virus con mutaciones asociadas a resistencia a un NNRTI (NVP) y un NRTI (3TC). La mutación asociada a la resistencia a NVP estudiada fue la K103N y la mutación asociada a la resistencia a 3TC estudiada fue la M184V. Estas dos mutaciones se eligieron por ser las que suelen ser seleccionadas con mayor frecuencia cuando las drogas están presentes en un individuo. Se utilizó esta técnica de PCR selectiva en tiempo real (SPCR, Selective real-time PCR) ya que puede detectar y cuantificar cepas virales con una determinada mutación que se encuentran en menos de un 20% de la población viral total (poblaciones minoritarias). De esta manera, se logra detectar mutaciones que por el método de genotipificación convencional no es posible, ya que éste tiene una sensibilidad para detectar mutaciones presentes en más de un 20% de la población total. Para la SPCR se utilizaron primers específicos capaces de detectar selectivamente las cepas salvajes y mutadas presentes en distintas 20

21 proporciones en una muestra. Sobre la base de una búsqueda de publicaciones previas en el tema se eligieron las estrategias publicadas por Lecossier, et al [92] para la detección de la mutación K103N y la de Bergroth, et al [93] para la mutación M184V. Teniendo en cuenta que los trabajos mencionados realizaron la técnica de SPCR sobre muestras de pacientes infectados con subtipos del HIV-1 diferentes a los prevalentes en la población de Argentina (predominantemente subtipo B e intersubtipo B/F) [84, 85], se realizaron algunas modificaciones en las secuencias de los primers y sondas publicadas. Estas modificaciones en algunos nucleótidos se realizaron para aumentar la sensibilidad de la reacción frente a muestras locales. Estas modificaciones implicaron una nueva puesta a punto del método en nuestro laboratorio con estos primers nuevos y con unos estándares confeccionados de novo para tal fin. Para la SPCR se utilizó la tecnología Taqman, y se siguió el procedimiento descripto previamente [94]. Dosaje de drogas antirretrovirales en plasma La presencia de drogas antirretrovirales en plasma se midió como indicador de que la medicación estaba siendo tomada por los niños (adherencia al tratamiento). Tanto la muestra basal como las de seguimiento se extrajeron por la mañana, generalmente antes de tomar la dosis de medicación correspondiente. De esta manera, se esperaba encontrar niveles de drogas en plasma correspondientes al valle, es decir, no valores máximos. El dosaje se realizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, High-Performance Liquid Chromatography), utilizando el equipo HPLC Thermo Finnigan. Los métodos cromatográficos fueron desarrollados y validados basándose en la metodología descripta por Moyer, y colaboradores [95], con algunas modificaciones. Datos clínicos Los estadíos clínicos se determinaron según los signos y síntomas de los pacientes siguiendo las guías de clasificación de los CDC de 1994 [6] (Tabla 2). El desarrollo y crecimiento de los niños fue evaluado según sus pesos y tallas. Para poder realizar análisis de todos los niños juntos, independientemente de su edad y sexo, se calcularon valores z (z scores) de peso y talla según la edad y el sexo. Para estos cálculos se utilizaron valores de peso y talla de niños y niñas sanos de Argentina [96]. Tratamiento antirretroviral El TARV instaurado en los niños estuvo a cargo de los médicos infectólogos involucrados en este proyecto, según criterio médico y disponibilidad de drogas. Los esquemas de triple terapia utilizados fueron 2 NRTIs más 1 NNRTI o 2 NRTIs más 1 IP. Los NRTIs prescriptos fueron AZT, 3TC, DDI o D4T. Los NNRTIs 21

22 prescriptos fueron NVP o EFV, y los IP fueron NFV o LPV/rtv. Algunos pacientes que ingresaron al estudio no comenzaron TARV por no ser necesario, según el criterio médico y las recomendaciones vigentes. Recopilación y análisis estadístico de los datos Los datos clínicos (TARV, manifestaciones clínicas, modificaciones en el TARV, etc) y los resultados del laboratorio fueron recopilados en una base de datos para su posterior análisis en conjunto. Los cambios de recuento y porcentaje de CD4, CV plasmática, z scores de CD4, peso y talla antes de iniciar TARV se compararon con aquellos durante el seguimiento, utilizando el test de Mann-Whitney para realizar las comparaciones de estos parámetros entre grupos. El tiempo transcurrido hasta la muerte, la supresión de la CV, la selección de mutaciones primarias asociadas a resistencia y la mejoría clínica se analizó utilizando las curvas de sobrevida de Kaplan-Meier. La asociación entre factores basales y la falla virológica se calculó por regresión logística. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS para Windows versión 13.0 (SPSS Inc, Chicago, USA). Una p de 2 colas menor a 0,05 se consideró como estadísticamente significativa. 22

23 IV. RESULTADOS Desde el comienzo del estudio en diciembre de 2004 hasta mayo de 2008, ingresaron al mismo 101 niños. De 66 de ellos se logró tener un seguimiento en el tiempo una vez iniciado o no el TARV. De aquellos niños que no tuvieron un seguimiento, sólo contamos con la muestra basal. Los motivos de abandono temprano del estudio fueron, en general, desconocidos por los investigadores involucrados en este estudio. En algunos casos (6/36, 17%) el motivo de abandono fue el fallecimiento enseguida del ingreso al estudio. Otras causas esgrimidas fueron: 1) mudanza de la familia a otro barrio, con el consecuente cambio de centro de atención médica, 2) fallecimiento de la madre, con la consecuente derivación de la custodia del niño a un familiar o a un instituto de menores, 3) incapacidad de la persona a cargo del cuidado del niño (madre, padre o tutor) de cumplir con las visitas pre-establecidas cada 3 meses aproximadamente. También existió el caso de niños que empezaron el seguimiento pero en algún momento lo abandonaron. Consideramos a estos niños como perdidos en el seguimiento si habían faltado a más de 3 visitas. Cabe señalar que hubo pacientes que no completaron todas las visitas esperadas durante 2 años debido a que, al momento de corte para analizar los resultados (mayo 2008), todavía no se había cumplido ese plazo. Esto sucedió en varios casos porque el reclutamiento de pacientes fue continuo a lo largo del estudio, por lo tanto existen pacientes que ingresaron hace menos de un año, por ejemplo. Teniendo en cuenta lo antedicho y el criterio para definir a un niño perdido en el seguimiento, podemos describir la población estudiada de la siguiente manera: Niños que han asistido en tiempo y forma a lo largo de su seguimiento: 46 (45,5%) (Tiempo de seguimiento: media: 24 meses, error estándar: 1,7; Rango: 2,1-48,5 meses; mediana: 24,5 meses; rango intercuartilo: 17-33,3 meses). Seguimiento completo (2 años): 27 niños Seguimiento de 1 ½ años: 6 niños Seguimiento de 1 año: 4 niños Seguimiento de 6 meses: 6 niños Seguimiento de 3 meses: 3 niños Niños que comenzaron el seguimiento pero eventualmente lo abandonaron: 20 (19,8%) (Tiempo de seguimiento: media: 9,6 meses, error estándar: 1,4; Rango: 2,1-21,0 meses; mediana: 8,3 meses; rango intercuartilo: 3,3-14 meses). 23