Primer puesto: César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González

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1 ISSN: Número 1 Marzo de 2015 Primer puesto: César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González Segundo puesto: Renata Helena Candido Pocente

2 Contenido Presentación....3 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT Convocatoria 2014 Alere Editor: Biosystems S.A. Autores: César J. G. Collino Pérez Fernando Gallego González Renata Helena Candido Pocente Comité Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT Presidenta: María Eugenia González R. Móvil: (57) (3) Diseño y diagramación: El Bando Creativo Publicación anual Primera edición, marzo de 2015 Santiago de Cali, Colombia Primer puesto Evaluación metodológica del equipamiento PIMA para la cuantificación de linfocitos T CD4...4 Introducción...5 Métodos y materiales....7 Resultados y discusiones....9 Conclusiones y recomendaciones...18 Segundo puesto Imunoensaio cromatográfico rápido no diagnóstico diferencial de tuberculose e micobacteriose não tuberculosa em um serviço de referência terciária Sumário executivo Introdução Objetivo deste trabalho Materiais e métodos Resultados e discussões Conclusões e recomendações Bibliografia....26

3 Presentación El Premio Alere, en reconocimiento al esfuerzo de los profesionales de la salud que están en constante actualización e innovación, galardona a quienes en su incansable búsqueda de nuevos horizontes logran resultados positivos en beneficio de la humanidad. El Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014 pretende incentivar la investigación, la capacitación y la actualización enfocadas a mejorar la calidad de vida de los pacientes. Con la participación obtenida se superaron las expectativas. Nos sentimos orgullosos de haber contado con la producción intelectual de tantos profesionales latinoamericanos que pusieron a consideración del comité del Premio sus trabajos de investigación. El rigor de la evaluación rindió sus frutos, se encontraron trabajos de mucha importancia, relevancia y trascendencia para el área de la salud. Todos somos ganadores en el Premio Alere. El interés mostrado y la persistente labor por un mejor futuro hacen descollar a estos investigadores hasta el nivel de la excelencia. El jurado, por su parte, estuvo a la altura del Premio. Profesionales de talla mayor como Gustavo Méndez (México), María Belén Bouzas (Argentina) y Luisane Marie Falci Vieira (Brasil), tuvieron la ardua tarea de evaluar los proyectos y tomar la decisión de elegir al número uno. A los participantes, gracias por dar lo mejor de ustedes. Al jurado, gracias por la entrega y por la responsabilidad que le imprimieron a su meritoria misión. En 2015, el Premio Alere continuará incentivando la labor investigativa en POCT, y espera contar con una amplia y representativa participación de profesionales de los países de América. Presidenta Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT Presentación 3

4 Primer puesto Evaluación metodológica del equipamiento PIMA para la cuantificación de linfocitos t cd4 César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González Sección Citometría de Flujo, Servicio de Laboratorio, Hospital G. Rawson, Ministerio de Salud de la Provincia de Córdoba, Argentina. Tel: ,

5 Introducción La valoración confiable de los niveles de linfocitos CD3+CD4+ (LTCD4) resulta indispensable para el monitoreo de la progresión de la infección por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). Además, esta cuantificación tiene un impacto definitorio en la conducta terapéutica y evaluación del tratamiento antirretroviral (TAR) en este tipo de pacientes. En la actualidad, la metodología considerada como referencia (gold standard) para el recuento de LTCD4 es la citometría de flujo (CF) de simple plataforma, principalmente debido a que es una técnica precisa, exacta y reproducible. Sin embargo, es mandatorio la aplicación de estrategias de evaluación de métodos (EM) de forma previa a la aplicación en rutina de un sistema de medición, no siendo la CF una excepción a esta regla. En este sentido, es necesario establecer también una estrategia de control de calidad interno que permita realizar un seguimiento de la estabilidad del sistema de medición a lo largo del tiempo. En la realidad de nuestro país, los laboratorios que disponen de citómetros de flujo para hacer recuento de LTCD4, poseen desde una mediana hasta una alta complejidad, y están ubicados en grandes ciudades y requieren de personal altamente capacitado para la operación correcta de los mismos. Esto obliga a que pacientes que residen en pequeñas ciudades o en regiones geográficas periféricas, tengan que trasladarse grandes distancias para su atención; por otro lado, las muestras tomadas en centros de menor complejidad deben ser transportadas hacia los centros donde realicen la determinación considerada de alta complejidad, con todo el costo que esto conlleva. La primera situación planteada atenta contra la adherencia del paciente frente al seguimiento y tratamiento de esta patología, lo cual incrementa la barrera para la expansión y descentralización de los programas de Tratamiento Anti Retroviral (TAR) y adherencia de los pacientes a los mismos. En el segundo caso, y teniendo en cuenta factores Primer puesto 5

6 importantes como las distancias en nuestro país, el lapso de tiempo que transcurre desde la toma de la muestra primaria hasta su procesamiento, podrían afectar la integridad de las mismas, comprometiendo la calidad del resultado emitido. Una solución alternativa a la problemática descrita, es la aparición de las nuevas tecnologías de tipo Point of Care (POC) para efectuar la cuantificación de LTCD4. Pima CD4 Analyzer (Alere) es uno de estos equipos de tipo POC. Entre sus ventajas se tienen: a) es portátil, su tamaño y peso permiten un fácil transporte; b) utiliza un sistema de medición compuesto por cartuchos donde se realiza la reacción, estos son estables en condiciones ambientales variables en cuanto al calor y humedad; c) puede utilizarse con una fuente de energía externa o con una batería recargable, lo cual permite acceder a lugares sin fuentes de electricidad y medir por un periodo de tiempo establecido (6 a 8 horas); d) utiliza muestras de sangre capilar obtenidas por punción digital (pequeñas fracciones de ensayo), lo que hace posible independizarse de la necesidad de utilizar materiales para una venopunción convencional; e) la información del resultado de la cuantificación de LTCD4 se obtiene en un tiempo promedio de 20 minutos por muestra; f) finalmente, no requiere un operador altamente especializado para la operación de la metodología de medición establecida. Por lo mencionado en los párrafos precedentes, el objetivo de este trabajo fue llevar a cabo una exhaustiva EM del sistema de medición PIMA (Alere), evaluando el desempeño de este método en términos de precisión, linealidad y veracidad, para establecer finalmente la aceptabilidad del mismo en función de los requerimientos de calidad establecidos para los analitos implicados (LTCD4). 6 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

7 Métodos y materiales Muestras Se recolectaron un total de 101 muestras de pacientes que acudieron al servicio de laboratorio del Hospital Rawson; 60 de pacientes de sexo masculino y 41 de sexo femenino, con una mediana global de 39 años, y un rango de edad entre 20 y 72 años. En todas las muestras se realizó la cuantificación de las subpoblaciones linfocitarias por CF de simple plataforma utilizando el sistema TruCount (BD Bioscience, USA); además se efectuó la medición de la totalidad de las muestras con el sistema PIMA (Alere Pima Analyser TM, Germany). El tipo de muestras utilizadas fueron: a) sangre venosa entera anticoagulada con EDTA K 3 (tubos comerciales DVS 2,5 ml volumen final); b) sangre arterial capilarizada (pulpejo del dedo); c) material control comercial provistos por la empresa Alere (cartuchos comerciales); y d) muestra control estabilizada immunotrol (Coulter Corporation, Miami, Florida 33196, EE.UU.). Equipamiento utilizado Se aplicó el Método POC Alere Pima Analyser TM ; este es un sistema de medición basado en reacciones antígenos-anticuerpos que utiliza la sangre tomada (de 1 a 2 gotas) directamente por digitopunción, y es introducida en lo cartuchos diseñados para tal fin, en un volumen de 25ul, de los cuales solo se utilizan 5ul para el análisis posterior. En este proceso de medición la sangre se mezcla con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos (anti-cd3 y anti-cd4) contenidos dentro del cartucho de reacción; esta reacción se transfiere a la cámara de detección donde se toman imágenes (fotos), se integra la información y se calcula el valor de LTCD4 por µl de sangre. Primer puesto 7

8 Por otro lado, todas las muestras medidas por el sistema PIMA se valoraron mediante CF de simple plataforma con un citómetro de flujo BD FACSCalibur TM (BD Bioscience), y se utilizaron tubos trucount para el recuento absoluto y la clasificación relativa de cada población celular. Se trabajó con el reactivo Multitest para la evaluación del perfil linfocitario T (CD3/CD8/CD45/CD4). La calibración diaria de este equipamiento y el control de calidad interno fueron realizados acorde a las recomendaciones del fabricante. Este equipamiento participa además del Programa de Evaluación Externa de la Calidad del CEMIC, ProgBA. Análisis estadístico En los ensayos de precisión se siguieron los lineamientos y análisis estadísticos propuestos en las guías EP15-A2 y EP5-A2 del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, USA), utilizando el programa Microsoft Office Excel ver Para evaluar la linealidad de esta metodología se realizó un análisis de regresión polinomial aplicando el protocolo descrito en la guía EP6-A del CLSI, usando el programa estadístico InfoStat ver. 2011p. Con respecto al estudio de la concordancia clínica, se construyeron 3 tablas de 2 x 2, en las cuales se tomaron como valores de corte los niveles de decisión médica de 200, 350 y 500 LTCD4/µL, y a partir de ellas se calcularon sensibilidad diagnóstica, especificidad diagnóstica, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. Aspectos éticos No se requirió consentimiento informado, ya que los datos suministrados se destinaron a fines clínicos y se garantizó el anonimato. 8 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

9 Resultados y discusiones Evaluación de la precisión (Preliminar e intermedia) Experiencia con cartuchos control Alere Pima TM Bead Standard, provistos por el fabricante. Para esta experiencia se valoró cada uno de los dos cartuchos control (uno con valor asignado bajo, y otro con valor asignado normal de LTCD4) veinte veces en una misma corrida analítica, con la finalidad de establecer el límite de outliers. Acto seguido, se realizó una estimación de la precisión intermedia midiendo el recuento de LTCD4 de los dos cartuchos control durante veinte días, efectuando dos corridas diarias por duplicado cada una. Los resultados se encuentran expresados en la Tabla 1, donde también se expresan los requerimientos de calidad establecidos para este analito en función de variabilidad biológica individual y grupal (únicos requerimientos de calidad disponibles para recuento de LTCD4). Experiencia con muestras de sangre entera venosa (SEV). Esta experiencia se llevó a cabo de la misma forma que la realizada con los cartuchos comerciales, utilizando dos muestras de SEV, una de las cuales poseía un recuento de LTCD4 bajo y la otra, un recuento de LTCD4 normal. Estas muestras se valoraron en cinco corridas analíticas por triplicado. Los resultados se pueden observar en Tabla 1. Experiencia con muestras controles estabilizadas (MCE). En esta experiencia se determinó el recuento de LTCD4 a la MCE durante veinte corridas analíticas. Se realizó para obtener información respecto a la precisión intercorrida de la metodología de medición. Estos resultados se muestran en la Tabla 1. Primer puesto 9

10 Tabla 1. Resultados de la evaluación de la precisión Media (*) Imprecisión (*) CV (%) V.B. Min (%) V.B. Des (%) Precisión preliminar cartuchos comerciales Precisión intermedia cartuchos comerciales Precisión intermedia muestras Sangre Entera Venosa 142,9 1,5 (DS) (**) 1,0 18,8 12,5 947,0 16,9 (DS) (**) 1,8 18,8 12,5 141,3 2,2 (St) (***) 1,6 18,8 12,5 940,2 19,8 (St) (***) 2,1 18,8 12,5 176,9 18,2 (St) (***) 10,3 18,8 12,5 1040,5 65,9 (St) (***) 6,3 18,8 12,5 Precisión intermedia MCE 489,5 62,3 (DS) (**) 12,7 18,8 12,5 (*) Unidades: Células/µL. (**) Valor de desviación estándar. (***) Valor de precisión intermedia. Linealidad Para evaluar este aspecto se aplicó un análisis de regresión polinomial empleando el programa informático InfoStat V Se evaluó la distribución de los distintos niveles de concentración mediante modelos polinomiales de primer, segundo y tercer orden, de acuerdo con los lineamientos de la guía EP6-A del CLSI. Para la preparación de los distintos niveles de concentración se siguieron los lineamientos publicados previamente (H26-A2 CLSI); se partió de una muestra de SEV con un valor alto de LTCD4, que se puso en posición vertical, y se dejó en reposo durante 2 horas, aproximadamente, de manera que sedimentaran los elementos formes celulares. 10 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

11 Luego, utilizando el plasma sobrenadante de esa misma muestra, se realizaron las correspondientes diluciones para obtener 6 puntos de concentración equidistantes entre sí. Cada nivel de concentración se midió por duplicado. La concentración teórica del nivel más alto se estableció como el promedio del duplicado medido, y las restantes concentraciones teóricas se determinaron en función de los volúmenes de plasma adicionados (Tabla 2). Los resultados obtenidos se encuentran representados en la Tabla 3 y en la Figura 1. Tabla 2. Resultados de la evaluación de la linealidad Dilución 1 Medición (*) 2 Medición (*) Rec. Teórico (*) 15% % % % % % (*) Unidades: Células/µL. Primer puesto 11

12 Tabla 3. Resultados del Análisis de Regresión Polinomial Orden polinomial Coeficiente Valor coef. (1) E.E. Coef (2) t (3) p-valor (4) G.L. (5) Des. Est. Residual (6) Primer b0-9,68 34,88-0,28 0, ,66 Primer b1 1,01 0,03 31,75 <0, ,66 Segundo b0-75,86 66,25-1,15 0, ,66 Segundo b1 1,19 0,16 7,64 <0, ,66 Segundo b2-8,80e-05 7,50E-05-1,17 0, ,66 Tercero b0-164,74 127,99-1,29 0, ,72 Tercero b1 1,60 0,53 3,03 0, ,72 Tercero b2-5,80e-04 6,10E-04-0,95 0, ,72 Tercero b3 1,70E-07 2,10E-07 0,82 0, ,72 (1) Valor coef.: Coeficiente del polinomio; (2) E.E.: Error Estándar; (3) t: Valor obtenido del test-t; (4) p-valor: valor p asociado al resultado del test-t; (5) G.L.: Grados de Libertad; (6) Des. Est. Residual: Desviación Estándar Residual de la regresión. 12 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

13 Figura 1. Regresión Primer Orden Recuento LTCD4* Recuento Medido Recuento Teórico * Regresión lineal: en el eje Y se graficaron las concentraciones medidas, y en el X las teóricas (calculadas). Ambas concentraciones se expresan en cel./µl. Rango de linealidad teórico evaluado: LTCD4/µL Concordancia clínica Se establecieron los parámetros sensibilidad diagnóstica, especificidad diagnóstica, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo para distintos niveles de recuento de LTCD4. La metodología de referencia empleada este ensayo fue la Citometría de Flujo Simple Plataforma (FACSCalibur, BD); en la cual se consideró la primera determinación de los duplicados realizados por el sistema PIMA, y se actuó de la misma forma para las determinaciones elaboradas por FACSCalibur; esto se llevó a cabo sobre la totalidad de las muestras (101) de SEV que se valoraron. Los resultados obtenidos están representados en la Tabla 4. Primer puesto 13

14 Tabla 4. Resultados del Análisis de Concordancia Clínica Recuento LTCD4 de corte (células/µl) Sensibilidad (%) Especificidad (%) VPP (%) VPN (%) 200 (*) FACSC. 200(*) PIMA PIMA > (*) FACSC. 350(*) PIMA PIMA > (*) FACSC. 500(*) PIMA PIMA > FACSC. > 200(*) 2 74 FACSC. > 350(*) 1 68 FACSC. > 500(*) ,37 92,31 98, ,55 96, ,37 88,89 84,09 98,25 (*) Unidades: Células/µL. Veracidad - Comparación de métodos En esta experiencia se siguieron los lineamientos de la guía EP9-A2 del CLSI; se hizo una comparación de métodos entre los resultados obtenidos por el sistema PIMA (contemplado como método en estudio) y por FACSCalibur (contemplado como método de referencia). Para ello se consideró la media de los duplicados de los valores cuantificados en cada uno de los sistemas de medición. De las 101 muestras de SEV valoradas en ambos equipos, se descartaron 2 muestras que poseían recuentos superiores a 2000 LTCD4/µL, esto respeta estrictamente el estudio precedente de linealidad realizado en este trabajo. No se encontró ningún valor anómalo dentro de las 99 determinaciones que se tuvieron en cuenta. Con el fin de establecer la ecuación de la recta que mejor se ajusta a la 14 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

15 distribución de los datos, se aplicó la regresión de Passing-Bablok utilizando el programa MedCalc V Los resultados alcanzados fueron 11,72 para la ordenada al origen, y 0,876 para la pendiente; sus respectivos intervalos de confianza (95%) fueron de 4,45 a 16,77 y de 0,857 a 0,892; y se obtuvo un coeficiente de correlación r = 0,9897 (Figura 2). También se aplicó el análisis de Bland-Altman (MedCalc V ) para calcular el BIAS promedio con el cual se cuantifica el sistema PIMA respecto al sistema de medición FACSCalibur, y se determinó que el mismo tiene una magnitud de -74,1 LTCD4/ µl, con su respectivo intervalo de confianza (IC 95%) de -264,0 a 115,8 (Figura 3). Figura 2. Estudio de Regresión - Passing Bablock Recuento LTCD4 - PIMA PIMA = 0,876 X FACSCalibur + 11, Recuento LTCD4 - FACSCalibur Primer puesto 15

16 Figura 3. Estudio de Bland - Atlman. Diferencias absolutas 200 Diferencia (PIMA - FACSCalibur) SD 115,8 Mean -74, SD - 264, Media de PIMA y FACSCalibur Comparación Sangre Capilar vs. Sangre Entera Venosa (SEV) También se hizo una comparación de métodos para evaluar posibles diferencias que puedan establecerse al realizar el recuento de LTCD4 en sangre capilar obtenida por punción capilar utilizando el equipo PIMA, y la cuantificación de LTCD4 a partir de SEV. Se compararon 18 muestras de individuos adultos sanos, de quienes se adquirieron simultáneamente la muestra de SEV y la de sangre capilar obtenida por punción digital. La regresión efectuada por Passing-Bablok arrojó una pendiente de 1,026 (I.C. 95% de 0,778 a 1,382), una ordenada al origen de 9,73 (I.C. 95% de -323,94 a 234,50) y un coeficiente de correlación r = 0,900 (Figura 4). Respecto a los resultados arrojados por la comparación mediante Bland-Altman, se encontró que el BIAS promedio del sistema PIMA (Sangre Capilar) en comparación con PIMA (SEV) es de 28,3 LTCD4/ µl, con un I.C. 95% de -151,3 a 207,9 (Figura 5). 16 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

17 Figura 4. Estudio de Regresión - Passing Bablock (Sangre Capilar vs. SEV) PIMA - Sangre Capilar PIMA (S. capilar) = 1,026 x PIMA (S. venosa) + 9, PIMA - Sangre Venosa Figura 5. Estudio de Bland - Atlman (Sangre Capilar vs. SEV). Diferencias absolutas Diferencia (PIMA s.capilar - PIMA S. Venosa) SD 207,9 Mean 28, SD - 151, Media de PIMA con S. Capilar y S. Venosa Primer puesto 17

18 Conclusiones y recomendaciones Se demostró que para todos los casos en los que se evaluó la precisión, con sus diferentes componentes, el sistema PIMA cumple con los requerimientos deseables de calidad basados en la variabilidad biológica. En el caso de la MCE, cumplió con los requerimientos mínimos estipulados según variabilidad biológica. Es importante destacar que las magnitudes de los valores de imprecisión obtenidos con muestras de SEV y con MCE son similares entre ellos, pero los mismos difieren ampliamente de los obtenidos con cartuchos control Alere Pima TM Bead Standard. Esto puede ser explicado por el hecho de que en el caso de los cartuchos control, en realidad no se procesa una muestra de SEV, sino que se hace una determinación sobre un cartucho control que viene cerrado con un contenido fijo, y lo esperable es que la dispersión que se obtenga en este sea mucho menor en comparación con la dispersión obtenida a partir de varias determinaciones de una misma muestra utilizando varios cartuchos Alere Pima TM CD4, con la manipulación previa que esto conlleva (variables preanalíticas a considerar). Lo anterior deja de manifiesto que los cartuchos control Alere Pima TM Bead Standard son de gran utilidad para evaluar el funcionamiento del equipo Alere Pima Analyser TM, pero no son aptos para evaluar en términos analíticos (precisión, veracidad, linelidad) el funcionamiento del sistema en su totalidad, que también incluye los cartuchos Alere Pima TM CD4. Una forma de controlar el sistema en su totalidad sería con muestras de sangre entera estabilizadas (como es el caso de MCE). Utilizando estrategias de control de calidad interno se puede evaluar el funcionamiento del sistema de medición en su totalidad (inclusive los cartuchos Alere Pima TM CD4) en términos de precisión y veracidad, y de esta forma se puede demostrar el correcto funcionamiento del equipo a lo largo del tiempo. 18 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

19 En términos de linealidad, se demostró que el recuento de LTCD4 del equipo PIMA tiene un comportamiento lineal, y el modelo de medición es explicado por un polinomio de primer orden, en el rango reportable evaluado. En cuanto a la concordancia clínica, los resultados obtenidos permiten afirmar que la determinación de LTCD4 mediante la utilización del equipo Alere Pima Analyser TM, al tener una alta sensibilidad y especificidad diagnóstica para los niveles descritos previamente, es una herramienta útil para tomar decisiones médicas en pacientes de reciente diagnóstico de poseer el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), y que los cuales por diferentes situaciones no pueden acceder a metodologías convencionales para determinar sus niveles de LTCD4. Respecto al desempeño obtenido en términos de veracidad, observando los resultados de la regresión realizada, podemos asumir que el equipo Alere Pima Analyser TM, en comparación con FACSCalibur, tiene un error sistemático constante positivo (ordenada al origen positiva de 11,72), y un error sistemático proporcional negativo (pendiente menor a uno, de 0,876), lo cual coincide con trabajos previos. Esto da aún más respaldo a los resultados de nuestro trabajo, y dejan en evidencia que dichos errores sistemáticos no son producto de la aleatoriedad. Al analizar y utilizar la ecuación de la recta obtenida en la regresión, encontramos que el punto en el cual el recuento entre un equipo y otro serían equivalentes es a 94 LTCD4/µL. Esto implicaría que por debajo de esa concentración el equipo PIMA sobreestima (error por exceso), y que por encima de esa concentración subestima (error por defecto), respecto al equipo FACSCalibur; así se demuestra el bajo impacto clínico de estos errores en estos niveles de concentración en este analito (LTCD4). Primer puesto 19

20 Segundo puesto Imunoensaio cromatográfico rápido no diagnóstico diferencial de tuberculose e micobacteriose não tuberculosa em um serviço de referência terciária Renata Helena Candido Pocente*, Margarida Maria Passeri do Nascimento, Sandra Mara Nunes Moroti, Livia Maria Pala Anselmo, Cinara Feliciano, Roberto Martinez, Rodrigo C. Santana, Valdes Roberto Bollela. *Autor principal: Renata Helena Candido Pocente. Endereço: Laboratório de Micobactérias do Hospital sas Clínicas da Faculdade se Medicina se Ribeirão Preto. Campus Universitário S/N Ribeirão Preto-São Paulo. Tel: (16)

21 Sumário executivo Introdução O Brasil está entre os 22 países que concentram aproximadamente 80% do total de casos de tuberculose (TB), ocupando a 16ª posição em número absoluto de casos. À semelhança de outros países, o Brasil tem conseguido avançar no controle da doença nas últimas duas últimas décadas. Entretanto as elevadas taxas de co-infecção entre o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o bacilo da tuberculose (TB) e a emergência de bacilos resistentes tem sido um limitante para o o controle de ambas as doenças 1. Os pilares para o controle da TB incluem o diagnóstico precoce e o tratamento efetivo. O aumento da prevalência global do HIV tem promovido dificuldades adicionais no diagnóstico e, consequentemente, no controle da TB, especialmente no paciente com imunodeficiência em fase avançada. Nestes casos observa-se um aumento na ocorrência de micobactérias não tuberculosas (MNT), cujo diagnóstico inicial pode ser facilmente confundido com o da TB. Este fato se torna ainda mais desafiador se considerarmos que existem MNTs colonizando a árvore respiratória, a região gênitourinária, trato gastrintestinal e região perineal de pessoas saudáveis. Assim, a presença de baciloscopia e até a cultura positiva para micobactérias em alguns espécimes clínicos não é suficiente para garantir o diagnóstico de tuberculose. Além do cultivo é preciso identificar com acurácia a espécie de micobactéria para que o tratamento apropriado seja instituído. O Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCRP) é um hospital terciário com cerca de 700 leitos, referência para uma macrorregião com cerca de 4 milhões de habitantes. Nele estão localizados os serviços de referência para TB resistente, co-infecçãotb/ aids e para pacientes com micobacteriose não-tuberculosa do Nordeste do estado de São Paulo. Pelo porte, o hospital também é o centro onde se faz a maioria dos transplantes desta região do estado, o que provoca um elevada concentração de pacientes imunocomprometidos. Neste contexto, é fundamental diferenciar as espécies de micobactérias isoladas em cultivo. Segundo puesto 21

22 Até 2013 a rotina do laboratório para isolamento e identificação de micobactérias incluia o exame direto (Ziehl-Neelsen) e incubação no sistema automatizado MGIT 960 TM para qualquer amostra, exceto sangue e medula óssea. Estes dois espécimes são cultivados no sistema BD Bactec 9120 TM. Após sinalizar o crescimento no sistema automatizado, uma alíquota do meio de cultivo era separada para extração de DNA e amplificação por meio de técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) in house que amplifica um fragmento de 123 pares de bases da região IS6110 do Mycobacterium tuberculosis 2. Na presença da amplificação confirmava-se M. tuberculosis, e na sua ausência concluia-se pela presença de MNT. O tempo de execução da identificação das micobactérias pela PCR (extração do DNA, amplificação, revelação no gel de agarose e fotografia do gel) variava entre 8 e 10 horas para 6 a 8 isolados/semana, ou um dia de trabalho da biologista responsável pelo laboratório. Objetivo deste trabalho O objetivo deste estudo é avaliar a implantação de um imunoensaio cromatográfico rápido (IECR), na rotina de identificação de micobactérias do laboratório de um hospital de referência no Estado de São Paulo. Materiais e métodos Desenho do estudo: Estudo transversal, que avaliou os resultados da incorporação de teste TBAgMPT64 TM (Standard Diagnostic Inc-Republic of Korea; distribuido pela Alere S/A no Brasil) na rotina de identificação das micobactérias isoladas em cultura no hospital. Obtenção de amostras: as amostras coletadas por ocasião da investigação diagnóstica rotineira de TB e MNT em pacientes internados no HCRP. 22 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

23 Amostras estudadas: Foram analisadas amostras de 237 isolados de micobactérias em cultura, entre os meses de outubro de 2013 e julho de A confirmação de M. tuberculosis foi feita através de dois métodos moleculares: PCR in house e resultado do teste molecular rápido Genotype MTBDRplus (Hain Lifescience, GmbH, Germany), o qual é feito de rotina no laboratório e que, além de detectar mutações de resistência do bacilo, também identifica a espécie. As amostras caracterizadas como MNT pela PCR foram encaminhadas ao Laboratório de referência do Estado de São Paulo para identificação da espécie (Instituto Adolfo Lutz-IAL). Aspectos éticos: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do HCRP, com número 9586/2011. Resultados e discussões Das 237 cepas isoladas em cultura nos 10 meses deste estudo, 143 tiveram resultados positivos no imunoensaio cromatrográfico, identificando M. tuberculosis, e em 94 isolados o resultado indicou a presença de MNT. Foram isoladas micobactérias de diferentes sítios, conforme demonstrado na tabela 1: Tabela 1. Sítio da infecção da micobactéria isolada nos 237 pacientes estudados Espécime clínica M. tuberculosis MNT Escarro Líquido cefalorraquidiano 8 0 Lavado gástrico 6 2 Sangue 6 1 Aspirado traqueal/lav. broncoalveolar 5 3 Biópsia (pulmão e linfonodo) 4 0 Abscesso 3 1 Líquido pleural 2 0 Fezes 1 1 Osso 1 0 Total Segundo puesto 23

24 A seguir apresentamos em uma tabela 2x2 os resultados do IECR quando comparado com os resultados obtidos com a PCR in house e o Genotype MTBDRplus para identificar o complexo M. tuberculosis e os resultados do laboratório de referência do estado, para as cepas identificadas como MNT. Definição da espécie: PCR in house; Genotype MTBDRplus e resultados do laboratório de referência Imunocromatográfico POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO A sensibilidade e especificidade do IECR foi de 99,3% e 100%, respectivamente. O valor preditivo positivo foi de 100% e o negativo de 98,9%.O coeficiente kappa entre o IECR e os testes de referência utilizados foi de 0,99. O tempo necessário para realizar 10 testes de identificação com o IECR foi de 20 minutos, cerca de 30 vezes menor do que o tempo gasto para o teste utilizando o PCR in house. Se considerarmos o tempo de trabalho do biologista mais os insumos utilizados na PCR, o custo/teste do IECR também foi menor. 24 Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT 2014

Primer puesto: César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González

Primer puesto: César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González 4 Primer puesto: César J. G. Collino Pérez, Fernando Gallego González Segundo puesto: Renata Helena Candido Pocente Comité Premio Alere Latinoamericano a la Investigación en POCT Presidenta: María Eugenia

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