Presencia de especies de vibrio en alimentos de origen marino en Chile. Año 2009 FAO-USP, FDA-USA, Centro i-mar U Los Lagos e ISP

Transcripción

1 Presencia de especies de vibrio en alimentos de origen marino en Chile. Año 2009 FAO-USP, FDA-USA, Centro i-mar U Los Lagos e ISP Vibrio se encuentra frecuentemente en los ambientes marinos y estuarios. En el mundo varias especies son agentes etiológicos de diarrea en humanos. Chile ha registrados brotes de intoxicación alimentaria por presencia de Vibrio parahaemolyticus (Vp) en mariscos crudos o mal cocidos especialmente en verano, desde el año 1998 en Antofagasta y desde el 2004 en la Décima Región. Con el objetivo de caracterizar los riesgos que la población está expuesta, se realizaron los siguientes estudios: 1. Caracterización de mariscos en zonas de expendio de la X Región por presencia de Vp asociando la exposición, presencia de factores de virulencia y su relación con registro de casos clínicos. 2. Detección de otras especies de Vibrios descritas en brotes de intoxicación mundial, mediante Macroarreglo Molecular. 3. Simulación de Cálculo de Riesgo según los datos epidemiológicos en condiciones ambientales extremas. 4. Detección de especie, género y virulencia de panel mundial de 80 cepas de Vibrios por métodos moleculares. 5. Formación de red latinoamericana de base de datos, para la Evaluación de Riesgo Microbiológico de especies de Vibrio, VIBRIOSLATINNET Muestreo y Análisis de Enumeración y Virulencia. El estudio de evaluación de la exposición comprendió el análisis de 35 muestras por duplicado. El muestreo fue realizado por el Centro i-mar de la Universidad de los Lagos y analizado en el Instituto de Salud Pública de Chile y en Gulf Coast Seafood Laboratory del FDA-USA. Las matrices alimentarias estudiadas fueron especies de bivalvos consumidos en Chile y de interés de exportación como choritos (Mytilus chilensis), almejas (Protothaca taca), choros (Choromytilus) y cholgas (Aulacomya ater). Las muestras fueron obtenidas en dos Ferias de expendio de Puerto Montt. Una vez obtenidas fueron enfriadas entre 5-10ºC y enviadas al ISP. Las muestras fueron evaluadas por PCR en Tiempo Real en el formato del NMP entre 10 y 0,001g desde enriquecidos congelados a -70ºC. De los análisis realizados se detectó V parahaemolyticus totales en un 93 % de las muestras (65/70), en el rango entre < 0.03 a 1100/g. Un 26% de las muestras (18/70) presentó Vp toxigénico (tdh) en el rango entre 0.03 y 120/g. Ninguna muestra fue positiva para los genes asociados a toxicidad trh. El Grafico I muestra la presencia de Vp totales y virulentos por especie altamente consumida en Chile y Gráfico II por periodo de muestreo. El gráfico III ISP Página 1 de 6

2 muestra la proporción entre la cantidad de Vp por gramo de alimento y el número de intoxicados en Puerto Montt en una fracción del muestreo. Presencia de otras especies de Vibrio descritas en brotes de intoxicación. Mundialmente, V parahaemolyticus y vulnificus son las especies de mayor importancia asociadas a intoxicación por ingesta de bivalvos. Sin embargo, existen otras como V cholerae, V hollisae, V damselae, V alginolyticus, V harvey, V fluvialis, V fursissii, V metschnikovii and V mimicus que también han causado enfermedad en el hombre. Se evaluaron enriquecidos en forma de pool de las muestras con mayor diversidad bacteriana mediante Macroarreglos Moleculares. Se utilizaron sondas biotinizadas de ADN que amplifican genes conservados (RpoB y Ftsz) de las diferentes especies previa amplificación por PCR. Para verificar la especificidad del arreglo, se utilizó ADN genómico de las siguientes especies: V parahaemolyticus (3.9 x 10 8 ufc), V cholerae ( 3.9 x 10 8 ufc) y V alginolyticus (2.3 x 10 8 ufc). Para evaluar la sensibilidad de detección, se utilizó pooles de ADN genómico en concentraciones de 10 2 y 10 3 ufc. Se obtuvo especificidad del 100 % para las tres especies evaluadas en forma de pool. La sensibilidad fue de un DNA genómico proveniente 10 2 ufc para V parahaemolyticus y alginolyticus y 10 3 ufc para V cholerae. En relación a otras especies presentes en los bivalvos no descritas en brotes de intoxicación en Chile, mostraron presencia principalmente V alginolíticus (52,3%), V parahaemolyticus (9.52%), V cholerae (4.76%) y V mimicus (4.75 %). Los resultados se muestran en el Gráfico IV. Modelo de Riesgo. Se realizó la simulación utilizando el esquema básico de ERM de acuerdo al Codex Alimentarius, referencias de las ERM de Vibrio spp publicadas por la FAO/OMS y referencia de ERM de Vp ostras crudas del FDA (USA). El valor de la exposición y riesgo fue calculado según lo observado los días de mayor número de intoxicados. Los días correspondieron al 12 y 13 de febrero del 2005 con 675 casos. Se utilizó la máxima temperatura externa de la cosecha el día 11 de febrero correspondiendo a 30.2 C (Estación meteorológica (SCTE). La patogenicidad estimada fue 0.69 y la severidad 0.95 x10-6. El riesgo estimado considerando los días mas calurosos y el año que tuvo mayor número de intoxicados es de 0.20 por plato en Puerto Montt considerando una porción de 120 g y utilizando la curva Dosis respuesta del FDA. Estudio piloto colaborativo para detección de especificidad de panel de cepas mundiales por PCR. ISP Página 2 de 6

3 Se realizaron dos estudios: El año 2008 se evaluó un panel de 40 cepas y enriquecidos en un estudio colaborativo piloto internacional coordinado por FDA-USA con 11 laboratorios mundiales. Se detectó Vibrio parahaemolyticus totales mediante los genes tl, toxr y R72H y Vibrio parahaemolyticus patogénico con los genes tdh y trh.. Ocho de los 10 laboratorios utilizaron PCR tradicional, dos PCR en tiempo real y uno ensayo LAMP. El año 2009 se realizó el segundo estudio donde cada laboratorio evaluó y analizó en forma independiente un panel de 82 cepas principamente V parahaemolyticus, cholerae, vulnificus, algylolyticus, fluvialis, mimicus, hollisae, fischeri, metschnikov y cincinnatiensis. Las cepas correspondieron a extractos no viables de cepas patogénicas y no patogénicas de origen clínico y ambiental y enriquecidos de alimentos. En el caso de Chile, la metodología utilizada fue el sistema de screnning molecular comercial para V parahaemolyticus, V cholerae y V vulnificus (Bax Dupont ) y Real Time PCR con sondas para los genes tdh y trh. En el primer estudio para Vibrios totales con los 11 laboratorios, se detectaron 0.9% de Falsos positivos (11/1160) en cultivos puros o mezclas de cultivo. No se observaron Falsos negativos. Para la detección de virulencia, se observó un 13% de Falsos negativos (13/99) en mezclas de cultivo puros especialmente en relación al factor de virulencia trh. Este estudio mostró que la metodología de PCR tradicional era menos confiable que el Real Time PCR y LAMP. En el segundo estudio evaluado en forma independiente en cada laboratorio mostró que las 82 cepas analizadas por el sistema comercial hubo un 0% de Falsos negativos, 6.1% Falsos positivos y un 93.8 % de correlación con las muestras. En relación a la virulencia hubo un 4.8% de falsos negativos y un 31.7 % de falsos positivos para el gen tdh. En relación al gen trh hubo un 6% de falsos negativos y un 10 % falsos positivos. VIBRIOSLATINNET: Para la evaluación de Riesgo Microbiológico. La evaluación de riesgo cuantitativa aplicada a la Microbiología de Alimentos, es reconocida mundialmente como una herramienta multidisciplinaria útil para el manejo de los patógenos presentes en los alimentos y la elaboración de estándares internaciones que faciliten el comercio transfronterizo y aseguren la inocuidad de los alimentos. Se generó una base de datos de investigación científica e informes epidemiológicos por presencia de V cholerae, V vulnificus y V parahaemolyticus en ecosistema marinos y sus productos en países de Latinoamérica y el Caribe. Esta base de datos incluye datos generales por presencia de estos patógenos en matrices alimentarias asociados a variables durante la cosecha/postcosecha y consumo. Esta información está centralizada en la Universidad de Sao Paulo, Brasil y es el comienzo de una instancia de colaboración Latinoamericana que permitirá armonizar la metodología, definir las variables necesarias para una gestión de riesgo efectiva. También esta red permitirá estimular la notificación de los casos clínicos de los países. Esta información permitirá facilitar la toma de decisiones de los gobiernos para aumentar el nivel de protección. Conclusiones ISP Página 3 de 6

4 La población chilena, tiene muy arraigado la costumbre de consumir bivalvos crudos o levemente cocidos especialmente en la zona costera en época de vacaciones, que coincide con la presencia en mayores cantidades de especies de Vibrio de riesgo que son indígenas e inocuas para el ecosistema pero de riesgo para los seres humanos. Debido al gran número de intoxicados desde el año 2004 y al avance tecnológico, hemos evaluado la presencia de Vp totales y Vp toxigénico en diferentes especies de bivalvos en un formato microbiológico-molecular. En todas las matrices evaluadas se encontró Vp y Vp toxigénico excepto en los meses de invierno donde solo se encontró Vp totales. La concentración de Vp totales fue predominantemente baja a pesar de los meses verano y aún más baja en relación a la virulencia ( <100 /g). Todas las especies de Bivalvos, presentaron Vibrio parahaemolyticus cantidades similares. El estudio de especies de riesgo diferentes a Vp por Macroarreglo señaló presencia de predominante de principalmente de V alginolyticus, y ausencia de Vibrios de mayor riesgo como V vulnificus. Este estudio se recomienda repetir cada año para visualizar el posible cambio de flora nativa eventualmente difícil de visualizar en los agares selectivos utilizados en los programa de vigilancia. La simulación de modelo de riesgo desarrollado por el proyecto FAO USP PR permitió visualizar la probabilidad de infección de un individuo que consume una porción normal de mariscos en las condiciones ambientales extremas (20%). Estas condiciones pueden anualmente repetirse y este ejercicio, permite a los gestores de salud, aumentar las comunicación del riesgo cuando corresponde y en lo posible tomar medidas de mitigación. La participación en los estudios colaborativos internacionales pilotos, permite visualizar las limitaciones y ventajas de tecnologías de punta utilizadas mundialmente. El amplio panel de cepas utilizadas junto a los resultados del Macroarreglo, permiten considerar que no hay otras cepas de riesgo del género Vibrio muy diferentes a las visualizas en los agares selectivos normalmente utilizados (V alginolyticus y V cholera/v mimicus) y que dependerá de la presencia de estas cepas en aislados clínicos, la alerta de vigilancia. Finalmente, la formación de una red latinoamericana, es una primera aproximación de colaboración entre los países con intereses hábitos alimenticios comunes e interés por el comercio transfronterizo, que permitirá compartir los datos y experiencias científicotécnicas para proteger la salud de la población mediante el fortalecimiento de la vigilancia para asegurar la inocuidad de los alimentos. ISP Página 4 de 6

5 GRAFICO N 1 Número de muestras con presencia de Vp totales y virulentos en especies de bivalvos consumidos en Chile verano GRAFICO N 2 Número de muestras con Vp totales y Vp toxigénico en periodo de muestreo. ISP Página 5 de 6

6 GRAFICO N 3 Nº de casos clínicos versus concentración de Vp en bivalvos. 3 log10(cases of Gastroenterit 2,5 2 1,5 1 0,5 y = 0,5071x + 1,4123 R 2 = 0, ,5 0 0,5 1 1,5 mean log10(tlh/g) in shellfish GRAFICO N 4 Presencia de Vibrios en bivalvos descritos mundialmente en brotes de intoxicación alimentaria por Macroarreglo Molecular. Agradecimientos: Se agradece la colaboración de FAO-USP, FDA-USA, Centro i-mar U Los Lagos, Jefatura del Departamento Salud Ambiental y de todo el personal de la Sección Microbiología de Alimentos del ISP. BQ. Viviana Cachicas QF. Orialis Villarroel Subdepartamento Alimentos y Nutrición Instituto de Salud Pública de Chile ISP Página 6 de 6