Plasmodium vivax: avances en la identificación y caracterización de antígenos de potencial utilidad en el desarrollo de una vacuna antimalárica
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- Arturo Rubio Contreras
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1 Plasmodium vivax: avances en la identificación y caracterización de antígenos de potencial utilidad en el desarrollo de una vacuna antimalárica Darwin Andrés Moreno Pérez MSc., cphd Investigador Asociado Grupo Funcional Biología Molecular Fundación Instituto de Inmunología de Colombia 1
2 Metodología para el Desarrollo de Vacunas Parásitos Bacterias Virus Hongos 2
3 Metodología para el Desarrollo de Vacunas Malaria Enfermedad aguda Fácil diagnóstico Cinchona officinalis Aotus spp. OMS,
4 Malaria Biología Molecular Plasmodium vivax Diagnóstico y tratamiento oportuno Mosquiteros impregnados con insecticidas Fumigación residual de interiores MPAC de la OMS Malaria atlas project 132 a 391 millones de casos nuevos Price R et al. Am J Trop Med Hyg 2007,77:79-87 Sedes entomológicas para estudiar y controlar el vector Quimioprevención Organización Mundial de la Salud,
5 Ciclo de vida de Plasmodium 1. Etapa preeritrocítica 3. Etapa sexual 2. Etapa eritrocítica Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:
6 Ciclo de vida de Plasmodium 1. Genera hipnozoitos Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:
7 Ciclo de vida de Plasmodium 1. Genera hipnozoitos 2. Infecta reticulocitos Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:
8 Ciclo de vida de Plasmodium 1. Genera hipnozoitos 2. Infecta reticulocitos 3. Genera gametos tempranamente Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:
9 Ciclo de vida de Plasmodium Mueller I. et al. Lancet Infect Dis 2009,9:
10 Proceso de Invasión a eritrocitos Contacto Inicial Reorientación Unión Fuerte Invasión Gavin J. et al. Plos Pat 2014,10: e
11 Metodología para el diseño de una vacuna para P. vivax 1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios 2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular 3. Determinar las regiones de interacción proteínacélula 4. Evaluar la utilidad como vacuna 11
12 Metodología para el diseño de una vacuna para P. vivax 1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios 2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular 3. Determinar las regiones de interacción proteínacélula 4. Evaluar la utilidad como vacuna 12
13 Duffy-positive Duffy-null Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax? Fy a-b- Duffy-null Fy a+b+ Merozoitos de P. knowlesi y P. vivax African population Duffy Miller L. et al. J Exp Med 1979,149:
14 Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax? Horuk R. et al. Science 1993,261: P. vivax DBP DARC Reticulocitos Infección 14
15 Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax? Horuk R. et al. Science 1993,261: P. vivax P. vivax DBP DBP DARC Reticulocitos DARC Eritrocitos Maduros? Infección No hay infección 15
16 Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax? Horuk R. et al. Science 1993,261: P. vivax P. vivax DBP DBP DARC Reticulocitos DARC Eritrocitos Maduros Infección No hay infección 16
17 Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax? RBPs MSA1(MSP1) Regiones Conservadas Regiones Semi-conservadas Del Portillo H. et al. PNA 1991,88: AMA1 Galinsky M. et al. Cell 1992,69: Cheng Q. et al. Mol Bio Par 1994,65:
18 Qué Moléculas Conocíamos de P. vivax? P. vivax Reticulocitos Micronemas DBP Micronemas AMA Roptrias RBP1, 2 DARC Superficie MSP1 18
19 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos P. vivax Micronemas DBP Micronemas AMA Roptrias RBP1, 2 Superficie MSP1 19
20 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Enfoque Bioinformático Comparación por homología Micronemas DBP Micronemas AMA Roptrias RBP1, 2 Superficie MSP1 20
21 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Enfoque Bioinformático Transcripción >35h Secuencia de Secreción Proteínas de invasión en P. vivax Datos in silico RT, GPI, Dominios Función en Plasmodium Bozdech Z et al. PNAS 2008, 105:
22 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Validación Experimental Galinsky M. et al. Adv Par 2013,81:
23 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Validación Experimental Aotus spp. Galinsky M. et al. Adv Par 2013,81:
24 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína DivergenAlfabetoGenes.htm Genoma ARN ta-globin-protein-structure.html DBP 24
25 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína AND genómico PCR ARN Aotus spp. 25
26 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína PvRAP1 PvRhopH1 26
27 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína PvRAP1 PvRhopH1 Pv34 PvRON1 PvRON4 Pv12 PvARP PvGAMA Pv48 27
28 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína Día 0 ACF Obtención de sueros PI Día 20 AIF Día 40 AIF Día 60 Obtención de sueros PIII 28
29 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína PvRAP2 PvRhopH3 29
30 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína PvRAP2 PvRhopH3 Pv41 Pv38 PvTRAMP PvRON2 PvRON1 PvRhopH1 Pv12 PvRON4 PvRON5 PvARP PvGAMA Pv48 30
31 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína Pv41 31
32 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína Pv41 PvTRAMP Pv12 PvMSP10 PvARP Pv48 32
33 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína Pv41 PvTRAMP Pv12 PvMSP10 PvARP Pv48 Pv34 Pv38 PvRhopH1 PvRON4 PvRON5 PvGAMA 33
34 1. Identificación y Caracterización de Nuevos Antígenos Gen Transcrito Proteína Pv12 PvARP Pv48 PvRhopH1 PvRON5 PvGAMA 35
35 36
36 37
37 38
38 39
39 40
40 41
41 42
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43 44
44 45
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47 48
48 49
49 50
50 51
51 52
52 53
53 2. Estudio del proteóma de P. vivax P. falciparum P. vivax 1289 proteínas 457 proteínas Lasonder E et al. Nature 2002, 419: Florens L et al. Nature 2002, 419:520-6 Acharya P et al. Prot Clin Appl 2011, 6:e26623 Roobsoong W et al. J Proteomics 2011,74:
54 2. Estudio del proteóma de P. vivax Propagación de la cepa VCG-1 de P. vivax Procesamiento de la muestra Identificación de proteínas Aislamiento de estadios sanguíneos Análisis LC-MS/MS Predicción de candidatos a vacuna 55
55 2. Estudio del proteóma de P. vivax ORF DE REFERENCIA P. vivax Primates del Nuevo mundo Contaminantes Propagación de la cepa VCG-1 de P. vivax Procesamiento de la muestra Identificación de proteínas Aislamiento de estadios sanguíneos Análisis LC-MS/MS Predicción de candidatos a vacuna 56
56 2. Estudio del proteóma de P. vivax 734 moléculas moléculas Proteínas esenciales para establecer la infección por Plasmodium o desarrollarse dentro de la célula 57
57 2. Estudio del proteóma de P. vivax 27% 734 moléculas moléculas Contacto Inicial Reorientación Unión Fuerte Gavin J. et al. Plos Pat 2014,10: e Invasión 58
58 2. Estudio del proteóma de P. vivax 27% 734 moléculas moléculas Pv41, Pv12, MSP-1, MSP7, SERA, TRAgs and Pv-fam (a and d) RON5, RALP1, RON2, RhopH1 RON3 Contacto Inicial Reorientación Unión Fuerte Gavin J. et al. Plos Pat 2014,10: e Invasión 59
59 2. Estudio del proteóma de P. vivax 60
60 Antígenos Descritos a la Fecha P. vivax 61
61 Metodología para el diseño de una vacuna para P. vivax 1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios 2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular 3. Determinar las regiones de interacción proteínacélula 4. Evaluar la utilidad como vacuna 62
62 2. Actividad de Unión de Antígenos Identificación de Péptidos de Alta Capacidad de Unión DBP Receptor-Ligando 125 I-péptido Reticulocitos Unión + = Ocampo M. et al. Peptides 2002,23:
63 2. Actividad de Unión de Antígenos Identificación de Péptidos de Alta Capacidad de Unión DBP RBP1 MSP1 Ocampo M. et al. Peptides 2002,23:13-22 Urquiza M. et al. Peptides 2002,23: Rodríguez L. et al. Vaccine 2002,20:
64 3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA y Aglutinación Eritrocitos Proteína Unión + = Anti-His (Proteína) Cantor E. et al. Mol & Bio Par 2001,117:229/234 65
65 3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA y Aglutinación Eritrocitos Proteína Unión + = Anti-His (Proteína) Cantor E. et al. Mol & Bio Par 2001,117:229/234 66
66 3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA y Aglutinación Perla+Proteína Eritrocitos + = Unión 67
67 3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por ELISA y Aglutinación Perla+Proteína Eritrocitos + = Unión Cantor E. et al. Mol & Bio Par 2001,117:229/234 68
68 3. Actividad de Unión de Antígenos Unión in vitro a Reticulocitos Humanos por Microscopia Eritrocitos Proteína + = Unión + Anti-CD71 Rodamina (Ret) Anti-His FitC (Proteína) Arévalo-Pinzón G. et al. Mal J 2015,14:106 69
69 3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría Eritrocitos Proteína + = Unión + Anti-CD45 APC (Linfocitos) Anti-CD71 APC-H7 (Ret) Anti-His PE (Proteína) Eritrocitos Inmaduros Eritrocitos Maduros 70
70 3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría PvGAMA GR Reticulocitos Mayor porcentaje de unión a reticulocitos 71
71 3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría PvGAMA GR Reticulocitos Mayor porcentaje de unión a reticulocitos Preferencia por células CD71 hi 72
72 3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría PvGAMA GR Reticulocitos Pv48 73
73 3. Actividad de Unión de Antígenos Determinación de Unión por citometría 74
74 Ligandos Descritos a la Fecha P. vivax Reticulocitos DARC 75
75 Metodología para el diseño de una vacuna para P. vivax 1. Identificar y caracterizar antígenos parasitarios 2. Estudiar el rol en el proceso de adhesión celular 3. Determinar las regiones de interacción proteínacélula 4. Evaluar la utilidad como vacuna 76
76 4. Inmunogenicidad de Moléculas Primates Proteína+ACF + + Reto = % Parasitemia 77
77 4. Inmunogenicidad de Moléculas Primates Proteína+ACF + + Reto = % Parasitemia MSP1 Rodríguez L. et al. Vaccine 2002,20: kda 14 kda 78
78 4. Inmunogenicidad de Moléculas Primates Proteína+ACF + + Reto = % Parasitemia 80% de los primates controlaron la infección 79
79 Conclusiones La predicción bioinformática es una herramienta útil para identificar proteínas parasitarias con rol en adhesión celular. La adaptación de la cepa VCG-1 de P. vivax en primates Aotus permitió caracterizar a nivel de biología molecular antígenos con potencial para desarrollar una vacuna contra la especie. Se estudio por primera vez en Colombia el proteoma de una cepa de P. vivax adaptada en primates. 80
80 Conclusiones Hemos utilizado distintas técnicas de interacción proteína-célula para determinar las moléculas o regiones de estas que se unen a los reticulocitos humanos (PvRON5, PvGAMA y Pv48). Contamos con una fuente de información útil para continuar con estudios de caracterización de proteínas candidatas a vacuna. Se demostró el papel inmunogénico y de protección para distintos fragmentos de una molécula considerada como buen candidato a vacun (MSP-1). 81
81 Agradecimientos Profesor Manuel Elkin Patarroyo MD (Director FIDIC) Manuel Alfonso Patarroyo MD., DrSc (Jefe del GF Biología Molecular e Inmunología) Diego Edison Garzón Ospina MS., cphd (Investigador Asociado GF Biología Molecular) Luis Alfredo Baquero Suarez BSc (Investigador Junior GF Biología Molecular) Hernando Curtidor M.S., PhD (Jefe del GF Receptor-Ligando) Gabriela Arévalo Pinzón MS., cphd (Investigador Asociado GF Receptor Ligando) Maritza Alejandra Bermúdez Díaz BSc (Investigador Junior GF Receptor Ligando) Otros investigadores: Yago Pico de Coaña (GF Biología Molecular) Oscar Pérez Leal (GF Biología Molecular) Álvaro Monguí (GF Biología Molecular) Diana Ángel (GF Biología Molecular) 82
82 Ente Financiador Entidades Internacionales 83
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