Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV

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1 BLOQUE Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Dra. Yolanda Mínguez, PhD Dr. Fernando Bronet, PhD IVI V NUEVAS TÉCNICAS

2 Contenido 1. Time-lapse: Morfocinética IMSI Luz polarizada Separación magnética de espermatozoides (MACS) Bibliografía UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 1 de 21

3 1. Time-lapse: Morfocinética La evaluación de los embriones generados a través de fecundación in vitro (FIV) ha mejorado a lo largo de los años. La evaluación clásica de los embriones se basa en parámetros morfométricos que permiten la elección del mejor embrión con las mayores probabilidades de conseguir una gestación. El cultivo extendido de embriones hasta el estadio de blastocisto se ha propuesto para mejorar la selección embrionaria y las posteriores tasas de éxito (Milki et al., 2000; Marek et al., 2000; Gardner et al., 1998), pero no todos los autores encuentran diferencias al transferir blastocistos (Coskun et al., 2000; Huisman et al., 2000). Así pues, hay varios estudios sobre la morfología de los pronúcleos (Scott et al., 2000; Tesarik et al., 1999), tiempos de división tempranos (Nagy et al., 1998; Payne et al., 1997; Capmany et al., 1996) o de la combinación de una puntuación subjetiva de la calidad embrión con la tasa de desarrollo (Cummings et al., 1986). La información obtenida de las observaciones microscópicas han contribuido al gran éxito de la fecundación in vitro, sin embargo necesitamos mejorar la selección embrionaria basada en la evaluación subjetiva y estática. La morfología embrionaria es un importante parámetro y la selección embrionaria debería comenzar siempre con una evaluación morfológica, pero con el fin de identificar embriones con la mayor tasa de implantación se ha propuesto una combinación de morfología y marcadores basados en el análisis del time-lapse. El desarrollo embrionario es un proceso dinámico en el que la morfología del embrión puede cambiar significativamente durante el paso del tiempo (horas). Es sabido que el tiempo entre la fecundación y la primera división es una herramienta muy útil que puede determinar la viabilidad embrionaria (Sakkas et al., 1998; Shoukir et al., 1997). La tecnología de time-lapse es un análisis no invasivo del desarrollo embrionario que nos ayuda a evaluar la importancia fisiológica de los sucesos morfológicos asociados con la fecundación y durante los estadíos tempranos del desarrollo embrionario. Cómo puede ayudarnos la tecnología del time-lapse? La mayoría de los estudios basados en el análisis del time-lapse se han basado en el desarrollo temprano, la formación y fusión de los pronúcleos o el tiempo de la primera división (Lemmen et al., 2008; Fenwick et al., 2002; Lundin et al., 2001; Payne et al., 1997). Desde que Edwards (1984) estudió por primera vez el fenómeno de la división temprana y su efecto en la tasas de embarazo, muchos autores han estudiado la relación entre división temprana y tasas de embarazo e implantación. Se ha demostrado que los embriones que han completado su primera división a las 25 horas posterior a la inseminación después de un fecundación in vitro tradicional o ICSI logran mayores tasas de embarazo e implantación, incluso en embriones de buena calidad, comparados con embriones que no muestran división temprana (Sakkas et al., 1998; Shoukir et al., 1997). Existen muchos estudios que comparan ciclos donde al menos se ha transferido un embrión con división temprana con ciclos donde ninguno de los embriones transferidos presentaba UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 2 de 21

4 división temprana (Neuber et al., 2003; Bos-Mikich et al., 2001; Sakkas et al., 1998; Shoukir et al., 1997). Sin embargo algunas estudios se basan en transferencias homogéneas donde todos los embriones transferidos estaban en la misma categoría (Van Montfoort et al., 2004; Wharf et al., 2004; Salumets et al., 2003; Lundin et al., 2001; Tsai et al., 2002; Sakkas et al., 2001). Estos estudios demuestran claramente un aumento en las tasas de embarazo e implantación en los ciclos con embriones con división temprana. Esta relación se ha estudiado incluso en ciclos en los que se había llevado a cabo transferencia de un único embrión (Van Montfoort et al., 2004; Salumets et al., 2003). También se ha encontrado una mayor tasa de embriones que llegan al estadio de blastocisto en los ciclos que presentan división temprana de los embriones (Fenwick et al., 2002). Todos estos estudios demuestran la utilidad de la división temprana como un indicador de la viabilidad embrionaria y de embarazo. En los últimos años se han desarrollado nuevos sistemas que combinan la microscopia y el incubador permitiéndonos analizar las características morfológicas de los embriones sin necesidad de retirar al embrión de sus condiciones optimas de cultivo. Con la introducción del time-lapse y el análisis digital de las imágenes no solo podemos obtener una imagen completa del desarrollo embrionario sino que además podemos determinar con precisión el momento en el que se produce cada división así como el momento del fenómeno intracelular que ocurre en torno a la fecundación. Los principales marcadores que podemos evaluar con la tecnología de time-lapse y que están relacionados con mayor tasa de implantación son: división temprana, fragmentación, multinucleación y sincronía (Meseguer et al., 2011; Hesters et al., 2008; Wong et al., 2008; Scott et al., 2007; Van Royen et al., 2003; Tsai et al., 2002; Pelinck et al., 1998; Kligman et al., 1996). Pero también podemos estudiar el comportamiento anormal e inusual como las divisiones irregulares y la formación y reabsorción de fragmentos (Pribenszky et al., 2010; Hardarson et al., 2002; Van Blerkom et al., 2001). Además debemos tener en cuenta que este nuevo análisis puede corregir interpretaciones erróneas en algunos de los eventos embrionarios como la perdida de la multinucleación que normalmente suele aparecer durante las horas en las que normalmente no se visualizan los embriones, y categorizar a un zigoto con dos pronúcleos cuando un tercer pronúcleo ha estado presente en ese punto en otro momento. Ya en el año 2000 Scott el al. (2000) analizaron los datos de videos de embriones humanos incubados en el sistema de time-lapse. Se estudiaron los tiempos de aparición y desaparición de los pronúcleos (PN) y el tiempo de la primera (2 células), segunda (3 células) y tercera (4 células) división embrionaria. Los resultados muestran que la mayoría de los embriones que implantaron habían formado PN a las 15 horas posterior al ICSI. Estas observaciones coinciden con los resultados mostrados por Fancsovits et al. (2005) que proponen que la desaparición temprana de los pronúcleos (entre horas) es un buen indicador de la viabilidad UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 3 de 21

5 embrionaria. Además el estudio muestra que si los pronúcleos desaparecen demasiado tarde esos embriones no implantan. Estos resultados también demuestran que los embriones que inician la primera, segunda y tercera división demasiado pronto o demasiado tarde tampoco son capaces de implantar. Meseguer et al. (2011) muestran los resultados del análisis de 247 embriones cultivados en el sistema time-lapse. En este estudio se tomaron en cuenta 2 parámetros: la duración del segundo ciclo celular y la segunda sincronía, definida como el paso de un embrión de 2 células a 4 células. El autor encuentra una correlación significativa entre estos parámetros y la tasa de implantación. De hecho ambos eventos embrionarios aparecen como indicadores importantes. Estudiando ambos parámetros y otros eventos embrionarios, el autor propone un algoritmo para seleccionar el embrión con la mayor tasa de implantación. El estudio llevado a cabo por Wong et al. (2010) demuestra que el intervalo de tiempo entre el final de la primera mitosis y el inicio de la segunda mitosis puede predecir la formación de blastocisto y que la duración de la primera citocinesis puede predecir la implantación. Estos resultados están en concordancia con un estudio reciente donde los autores encuentran una correlación entre el tiempo requerido para completar la segunda y tercera división y la mayor tasa de blastocistos (Hashimoto et al., 2012). En este sentido Cruz et al. (2013) estudiando 834 embriones encontraron que existían algunos parámetros morfocineticos, como la sincronía, relacionados con la tasa de blastocistos de buena calidad. Algunos autores incluso han propuesto el uso de la información de lso tiempos de división para establecer una relación entre la probabilidad de encontrar un embrión cromosómicamente anormal en función de los ritmos de división (Basile et al, 2014; Campell et al, 2013) o incluso se han observado diferentes ritmos de división en función del sexo del embrión (Bronet, et al, 2015; Serdarogullari et al, 2014). Conclusión Las evaluaciones basadas en los sistemas de análisis de imagen añaden objetividad al proceso de selección embrionaria. Los nuevos parámetros estudiados no solo se basan en los tiempos de división sino que además pueden observarse los sucesos anormales morfológicos a través de la tecnología de time-lapse. Algunos estudios han demostrado que la monitorización de rutina del desarrollo embrionario a través del time-lapse supone una nueva herramienta que puede ser utilizada para seleccionar el embrión con las mayores tasas de implantación. Por lo tanto podemos asumir que el estudio del desarrollo cinético ayuda a diferenciar entre embriones de similares características morfológicas. 2. IMSI La técnica de inseminación de ovocitos más utilizada en los centros de Reproducción Asistida es la inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI). La ICSI nos permite la observación morfológica tanto del ovocito como del espermatozoide a un aumento máximo de UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 4 de 21

6 400x. Sin embargo la capacidad de observación de la morfología espermática a 400x en microscopio invertido puede ser insuficiente, puesto que nos permite discernir únicamente características morfológicas graves como la presencia de doble cola, doble cabeza, globozoospermia, megalozoospermia, etc. La relación entre la morfología del espermatozoide y el éxito del ICSI ha sido muy discutida desde los inicios de la ICSI. Algunos trabajos (Mansour RT et al.,1995; Nagy ZP et al, 1995; Sukcharoen N et al., 1998 y Oehninger et al, 1998) demostraron que los resultados con ICSI no se veían afectados por la morfología de los espermatozoides. Sin embargo, De Vos et al. (2003) demostró que las tasas de gestación e implantación disminuían, en casos en los cuales únicamente había espermatozoides morfológicamente anormales para la realización del ICSI, comparándolos con otros casos en los que se encontraban espermatozoides normales para ser inyectados. Incluso algunos grupos con casos de fallo repetitivos de FIV convencional e ICSI (Parinaud J. Et al, 1993; Shoukir Y. et al., 1998) concluyeron que el factor masculino afecta también el desarrollo temprano del embrión (Tesarik J,et al, 2002 y 2004). La morfología fina y real del espermatozoide se puede conocer y distinguir con métodos como las Tinciones de Kruger o la microscopia electrónica, pero dichos métodos no permiten seleccionar el espermatozoide con la mejor morfología para la posterior microinyección o ICSI. Hace ya unos años que varios grupos comenzaron a utilizar un nuevo método de selección de espermatozoides. Este método se denominó Examen morfológico de los orgánulos del espermatozoide móvil a grandes aumentos (high magnification motile sperm organellar morphology examination, MSOME) y fue introducido por Bartoov B.et al. en el año Nos permitía observar al microscopio invertido la morfología del núcleo espermático a un aumento entre 6000X y 13500X, y también clasificar a los espermatozoides en cuatro categorías diferentes según la presencia de vacuolas en la cabeza de los espermatozoides y el tamaño de las mismas. Las categorías establecidas para clasificar los espermatozoides fueron las siguientes, Grupo I: ausencia de vacuolas, Grupo II: como máximo dos vacuolas pequeñas, definidas estas por un tamaño menor del 4% del volumen de la cabeza, Grupo III: más de dos vacuolas pequeñas o al menos una vacuola grande y Grupo IV: vacuolas grandes y morfología anormal de la cabeza. Tras introducir esta valoración del núcleo espermático, el mismo grupo introdujo el IMSI (inyección intracitoplasmática del espermatozoide móvil seleccionado morfológicamente) (Bartoov B, et al., 2003), permitiendo utilizar para ICSI el espermatozoide seleccionado y clasificado mediante categoría MSOME. Para realizar el IMSI se precisa un equipamiento muy parecido al empleado para el ICSI, incluyendo equipo de microinyección, mesa o superficie antivibratoria y microscopio invertido. La diferencia radica básicamente en que el microscopio invertido para IMSI requiere una óptica con sistema de objetivos de alta resolución (100x o 60x)/imágenes con contraste de interferencia diferencial (DIC) que permite visualizar el espermatozoide a aproximadamente aumentos. A su vez la imagen del espermatozoide se verá aumentada mediante zoom digital hasta aproximadamente aumentos en un monitor de 19. UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 5 de 21

7 400X 6.000X Con esta técnica el grupo que introdujo la clasificación MSOME y el IMSI obtuvo una mayor tasa de gestación e implantación, y una disminución de la tasa de aborto temprano espontáneo, concluyendo que el desarrollo temprano del embrión estaba asociado a la morfología del núcleo del espermatozoide, y afirmando que las vacuolas presentes en el núcleo del espermatozoide pueden ser la causa de defectos cromosómicos en el mismo (Berkowitz, 2006). A partir de ese momento se publicaron diversos estudios como los de Antinori M. et al.,2007 y 2008, o Vanderzwalmen P et al., 2007 que mostraban, en parejas con varios ciclos fallidos de reproducción asistida, mejores resultados en gestación e implantación con IMSI. Uno de los UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 6 de 21

8 inconvenientes de estos trabajos era que en todas las comparaciones, se relacionaban los resultados de la IMSI con resultados retrospectivos de ciclos anteriores de ICSI. Hazout A. et al., 2006, también relacionaba la presencia de vacuolas en el núcleo espermático con la fragmentación en el DNA; obteniendo una mejora en la implantación y gestación utilizando IMSI. La presencia de vacuolas podría reflejar defectos moleculares responsables de la remodelación anormal de la cromatina durante la maduración del espermatozoide (Caily et al., 2003), lo cual puede volver al espermatozoide más vulnerable a daños en su DNA causados externa o internamente por especies oxigeno reactivas (Sakkas et al., 2003; Agarwal et al., 2005). Y estos daños reflejados en la fragmentación espermática afectarían a la fecundación, gestación e implantación como ya demostraron otros autores (Tesarik et al., 2002, 2004 y 2005). Sin embargo, los diferentes estudios realizados hasta la fecha no son concluyentes respecto a la eficacia de esta técnica frente al ICSI convencional. La mayoría de los trabajos no encuentran diferencias en las tasas de fecundación con IMSI e ICSI (De Vos et al., 2013). Balaban et al., 2011 encuentra que el IMSI no mejora los resultados en pacientes no seleccionados, mientras que en parejas con factor masculino aumenta la tasa de implantación aunque no la tasa de recién nacido vivo. Es evidente que son necesarios estudios prospectivos randomizados y bien diseñados que nos confirmen el beneficio de esta técnicas en cuanto a resultados clínicos (Nadalina et al., 2009 y Setti et al., 2010). Por otro lado, con respecto a la calidad embrionaria, si bien Wilding et al publica mejor calidad embrionaria con IMSI que con ICSI, es cierto que la mayoría de los grupos coinciden en que la calidad embrionaria en D2 (Mauri et al., 2010 y Oliveira et al. 2011) y D3 (Balaban et al., 2011, de Almeida Ferreira Braga et al., 2011, Knez et al., 2011) en los embriones obtenidos con IMSI es similar a la de los embriones resultantes trás ICSI convencional. Vanderzwalmen P et al., compara en 2008 la calidad de los blastocistos obtenidos a partir de IMSI en ovocitos de la misma paciente e inseminados con espermatozoides de distintas categorías MSOME. Pese a encontrar diferencias significativas en la calidad de los blastocistos resultantes, la calidad embrionaria en D2 y D3 no reflejaba dichas diferencias. Sin embargo, De Vos et al no encuentra tampoco diferencias en la calidad embrionaria en los distintos estadios hasta D5 entre ambas técnicas. Conclusión Actualmente el IMSI nos está aportando información relevante sobre la prevalencia de determinado tipo de vacuolas en la cabeza de los espermatozoides y el efecto real de las mismas tanto en los resultados clínicos (Wilding et al. 2011, De Vos et al., 2013) como a nivel de integridad del ADN de dichos espermatozoides (Watanabe et al. 2011). Los estudios disponibles hasta la fecha parecen concluir que el empleo del IMSI no estaría indicado en parejas con sémenes normales y si en aquellos casos con factor masculino. Sin embargo, a día de hoy la eficacia del IMSI todavía resulta incierta y se precisan estudios prospectivos randomizados en grupos seleccionados de pacientes encaminados a conocer realmente los pacientes que se pueden beneficiar de esta técnica y no utilizarla innecesariamente en aquellas parejas a las que no aportaría beneficio alguno. UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 7 de 21

9 3. Luz polarizada La identificación de indicadores de competencia ovocitaria representa un objetivo importante en las técnicas de reproducción asistida (TRA). Tener el conocimiento de que ovocitos serán capaces de conseguir embriones de buena calidad que posteriormente den lugar a una gestación podría permitir la inseminación selectiva de ovocitos y así reducir el número de embriones congelados tras un ciclo de TRA. La microscopia con luz polarizada es una herramienta no invasiva relativamente nueva que nos permite analizar los ovocitos sin la necesidad de fijarlos, de modo que no se inducen alteraciones en los gametos femeninos debido al procedimiento (Keefe et al, 2003). La microscopia de luz polarizada permite la detección de estructuras ansiotropicas, que una vez son iluminadas originan rayos de luz derivados de la luz polarizada. Cuando un haz de luz polarizada incide en un material birrefringente se divide en dos haces de polarización opuesta. Al salir del material uno de los haces sufre un retardo con respecto al otro. La medida de ese retardo (nm) es la retardanza. La birrefringencia, es una propiedad de estructuras que presentan orden molecular. Por norma general, una estructura birrefringente, presentan dos ejes ópticos ortogonales, el eje rápido y el lento. El índice de refracción a lo largo del eje lento es mayor que a lo largo del eje rápido. La luz que es polarizada paralelamente al eje lento, viaja a una velocidad menor que la luz polarizada en paralelo al eje rápido. Como resultado, la luz polarizada al penetrar en la estructura puede estar en fase, mientras que al salir de la estructura, se encuentra fuera de fase. La medida de este cambio de fase en nanómetros puede usarse para medir la birrefringencia, que puede ser empleada para analizar la magnitud y la orientación del orden molecular de las muestras. Son birrefringentes las estructuras biológicas con un alto grado de moléculas alineadas. Ejemplos de esto incluyen las membranas celulares, los filamentos y los microtúbulos. Cuanto UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 8 de 21

10 más íntegras estén estas estructuras mayor es la retardanza. Así la retardanza puede ser una medida indirecta de salud de estas estructuras biológicas, y por extensión del propio ovocito. De particular importancia en el ovocito nos centraremos en la zona pelúcida y en el huso meiótico. Estas estructuras birrefringentes tienen la capacidad de alterar la luz polarizada a medida que esta atraviesa el ovocito. Dichos cambios son capturados y procesados en un software especial y el grado de birrefringencia puede ser calculado generando datos cuantitativos que son directamente proporcionales al grado de organización molecular de la estructura en observación. Esta información cuantitativa es la base de muchos estudios centrados en seleccionar ovocitos sanos ya que tanto el huso como la zona pelúcida son estructuras indicativas de salud ovocitaria. Valiéndonos de los estudios con luz polarizada, podemos estudiar fundamentalmente dos estructuras ovocitarias, el huso meiótico, y la zona pelúcida. Varios autores muestran en sus estudios en ovocitos humanos que las características birrefringentes del huso meiótico están asociadas con un alto grado de organización estructural de los ovocitos y podría estar positivamente relacionada con el potencial de desarrollo de los embriones derivados de estos ovocitos (Wang et al, 2001; De Stains et al, 2005; Shen et al, 2006; Rama Raju et al, 2007) y la zona pelúcida (Pelleteir et al, 2004; Shen et al, 2005; Kilani et al, 2006; Rama Raju et al, 2007; Cheng et al, 2010; Ebner et al, 2010). Las anomalías en el huso meiótico pueden ser el origen de una segregación anormal de cromosomas durante la última fase de la meiosis y por tanto, generar embriones aneuploides. En un estudio reciente sobre pacientes de diagnostico genético preimplantacional, que incluían edad materna avanzada, aborto de repetición y fallo de FIV, Patricio et al (2007) reporta que un porcentaje alarmante de embriones (82%) mostraba algún tipo de alteración cromosómica al ser analizados. Asimismo Coticchio et al (2004) reportó que solo un 5-10% de los ovocitos poseen la capacidad intrínseca de generar embriones con potencial de desarrollo. Ambos reportes coinciden en que estos embriones probablemente deriven de gametos defectuosos. La mayoría de los estudios del huso meiótico se han llevado a cabo mediante técnicas de inmunocitoquímica, que requieren la fijación del espécimen. Estas técnicas no permiten seguir la dinámica del cambio de los husos en un mismo ovocito, y por supuesto, un ovocito fijado deja de ser viable y por lo tanto no puede emplearse para inseminar y generar un embrión, quedando restringido únicamente a fines experimentales. Con la introducción de tecnología no invasiva de luz polarizada, que permita visualizar el huso meiótico, se puede estudiar la estructura y conformación de los husos meióticos, y el posterior empleo del ovocito para otros estudios, o su uso en TRA. Existen evidencias, de que los ovocitos maduros en los que no se puede visualizar el huso meiótico, presentan escaso potencial de desarrollo, por tanto, acceder a esta información puede ser una fuente importante de información acerca de la calidad ovocitaria y de su UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 9 de 21

11 madurez tanto citoplasmática como nuclear (Rama Raju et al, 2007). Resultados similares con respecto a la calidad embrionaria son observados por Rienzi et al, (2003) quien además reporta que un 9% de los ovocitos MII no presentan huso meiótico en el momento del ICSI. La ausencia del huso meiótico puede ser indicativa de una maduración ovocitaria incompleta y su detección representa una fuente importante de información acerca de la calidad ovocitaria y de su madurez tanto citoplasmática como nuclear. Por otra parte mediante el empleo de luz polarizada, se puede analizar también la estructura y calidad de la zona pelúcida, que es producida por el ovocito durante su maduración, por lo que anomalías en su estructura, pueden revelar indirectamente deficiencias en la calidad ovocitaria. Se ha podido relacionar la intensidad de la birrefringencia de la zona pelúcida con el potencial implantatorio de los embriones procedentes de estos ovocitos (Montag et al, 2008). Utilizando la tencilogia de luz polarizada se ha podido ver incluso que el area de la capa interna de la zona pelucida puede ser empleada como un indicador de competencia ovocitaria, ya que los ovocitos con valores de area mas pequeñas con mayor probabiloidad dan lugar a una gestación (Molinari et al, 2012). Otros autores proponer el empleo de luz polarizada como técnica de rescate para aquellos ovocitos donde no se aprecian signos de fecundación al día siguiente de la microinyección (Coticchio, 2013; Moon et al, 2013). En un estudio reciente (Picimato et al, 2014) se observa como mediante el uso de luz polarizada antes de realizar la microinyección se consigue un aumento de la tasa de fecundación. Conclusión Como conclusión podemos decir que el uso de microscopia con luz polarizada nos permite estudiar ciertos aspectos y características de los ovocitos que hasta el momento no se tenían en cuenta y que sin embargo están relacionados con la competencia ovocitaria y las probabilidades posteriores de implantación. 4. Separación magnética de espermatozoides (MACS) Como introducción a esta técnica, es interesante comenzar recordando aspectos básicos relacionados con la apoptosis espermática. La apoptosis es un proceso de muerte celular programada, la cual es requerida en la espermatogénesis normal de mamíferos para asegurar la homeostasis celular y el mantenimiento del balance entre células germinales y células de Sertoli (Sharma et al., 2004). Este proceso parece estar regulado por factores extrínsecos e intrínsecos y se puede desencadenar por una gran variedad de estímulos. La irradiación, la quimioterapia, y la exposición a toxinas son ejemplos de estímulos extrínsecos potencialmente importantes en la apoptosis de las células espermáticas. UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 10 de 21

12 Así, pacientes con fallos o problemas en la función testicular pueden modificar este proceso y aumentar la apoptosis testicular, y, como consecuencia, alterar los parámetros seminales observados en el eyaculado. Además, el proceso apoptótico está íntimamente relacionado con la función espermática, puesto que la inducción de este proceso conlleva a alteraciones de la membrana plasmática del espermatozoide (fundamental para la inducción de la reacción acrosómica previo a la fecundación), pérdida de funcionalidad mitocondrial (fundamental para la movilidad espermática), y finalmente fragmentación del ADN espermático (fundamental, como se comentó anteriormente, para la viabilidad del embrión y consecución de embarazo). No se conoce con exactitud si los marcadores apoptóticos detectados en los espermatozoides son residuos de un proceso apoptótico incompleto empezado antes de la eyaculación o son el resultado de una apoptosis iniciada después de la post-eyaculación, pero sí está demostrado que en el eyaculado hay espermatozoides con este proceso iniciado, y con las mismas características de motilidad y forma que los espermatozoides normales, lo que lleva a pensar que si los primeros fecundaran un ovocito, inducirían un fallo reproductivo. Por tanto, no hay duda de la utilidad, en determinados pacientes con alteraciones en el proceso apoptótico, de la eliminación eficaz de los espermatozoides apoptóticos antes de su utilización en reproducción asistida. Por otro lado, las técnicas de preparación de semen que existen actualmente (gradiente de densidad y swim-up) consiguen separar de un eyaculado de forma muy eficiente los espermatozoides móviles, pero no son eficaces en la eliminación de células apoptóticas (Said 2005), que puedan presentar adicionalmente alteraciones funcionales o daños en el material genético. Esta situación ha conducido a desarrollar técnicas de preparación o separación espermática alternativas como es la Separación Magnética de Espermatozoides o MACS. Aunque la técnica de MACS está descrita desde hace más de 25 años, y sobre todo se utiliza de manera rutinaria, tanto experimental como clínicamente, en el campo de la inmunología y hematología, únicamente se está empleando desde hace poco más de 2-3 años en el campo de la reproducción asistida. Esta técnica se basa en el uso de micropartículas magnéticas de aproximadamente 50 nanómetros de diámetro, los MicroBeads (MB) conjugadas con proteínas o anticuerpos (Ac.) específicos para su unión a las células o marcadores de interés. Requieren unas columnas para separar físicamente las células en función de si están o no marcadas, debido a su pequeño tamaño requieren un intenso campo magnético creado en la matriz de la columna, suficiente para retener las células unidas con una mínima cantidad de MB, mientras que las células no unidas pasan a través de la columna y pueden ser recogidas. Las células unidas pueden posteriormente ser liberadas de la columna mediante lavados. Ambas fracciones son separadas con elevada pureza, manteniendo su estructura, función óptima y viabilidad. La selección puede ser positiva, si las células que consideramos óptimas son aquellas marcadas por los MB y retenidas en la columna, o selección negativa si aquellas que no tienen el UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 11 de 21

13 marcador molecular en cuestión y eluyen a través de la columna son las que vamos a utilizar, pues son las óptimas. En el campo de la reproducción asistida se ha empezado a emplear esta técnica MACS para la separación de espermatozoides apoptóticos que se encuentren en una muestra de semen, puesto que como ya hemos indicado, la eliminación de estas células sería de gran utilidad para mejorar la muestra de espermatozoides en los TRA. La externalización de la fosfatidilserina (PS) es uno de los acontecimientos más tempranos de la apoptosis (Glander et al 1999), dependiente de Ca +2, la PS tiene alta afinidad por la Anexina V, proteína de unión a fosfolípidos de kda y que sirve para la identificación de células con la integridad de la membrana comprometida (Vermes et al 1995). Esta proteína conjugada con los MB se pueden unir magnéticamente a los espermatozoides con la membrana comprometida e identificar aquellos que estén en apoptosis o con el proceso apoptótico iniciado, quedando éstos retenidos en las columnas y eluyendo por tanto aquellos espermatozoides que no estén unidos a las partículas paramagnéticas (la fracción anexina V negativa), siendo éstos los candidatos a ser utilizados como óptimos en los TRA. Exterio Interior Activación Diferenciación Apoptosis Fosfatidilserina (PS) Anexina V esferas de metal Externalización PS Ca 2+ NO apoptótico Apoptótico Incubación con esferas Anexina V UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 12 de 21

14 Células apoptóticas retenidas en la columna Células marcadas con Anexina: retenidas en la columna. Células sin Anexina: atraviesan la columna. Análisis: citometría de flujo Elución Conclusión Existen diversos artículos ya publicados que demuestran la eficiencia de la técnica MACS para separar eficientemente los espermatoizdes no-apoptóticos de una muestra de semen (Said et al, 2008). Además, se ha descrito que esta técnica aumenta el porcentaje de espermatozoides con buena integridad funcional mitocondrial y mayores tasas de supervivencia (Grunewald et al 2006). Pero hasta el momento, todavía se está estudiando la relación de estos parámetros con la realización de TRA con esas mismas muestras, para ver si la técnica MACS mejora también las características funcionales de los espermatozoides empleados en el tratamiento. UNIDAD 02: Nuevas técnicas en el laboratorio de FIV Página 13 de 21

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