Jornada de Actualización Científica en Biología Novedades del Congreso Europeo ESHRE 2013 ESTADO ACTUAL DEL LABORATORIO DE ANDROLOGÍA

Transcripción

1 Jornada de Actualización Científica en Biología Novedades del Congreso Europeo ESHRE 2013 ESTADO ACTUAL DEL LABORATORIO DE ANDROLOGÍA Lic. Branzini Constanza

2 OMS 5 (2010)

3 Motilidad espermática: OMS 5 (2010) Sorprendentemente, WHO5 abandona la distinción entre espermatozoides progresivos lentos y rápidos Decisión controversial. El razonamiento detrás de esta última lo basa principalmente en la observación de que técnicos mal entrenados no pueden distinguir entre las dos categorías de manera repetible y fiable. En efecto, MacLeod y oro (1951) observaron hace 60 años que la calidad de la motilidad del espermática es un factor primordial para ser considerados en el análisis de semen. Además, señalaron que el logro de la estandarización intra e inter observador es esencial en cualquier método utilizado para evaluar la motilidad del esperma, y también que los observadores deben ser entrenados adecuadamente.

4 OMS 5 (2010) Morfología de los espermatozoides WHO5 ha adoptado plenamente los criterios estrictos Tygerberg para la morfología normal de los espermatozoides (Menkveld et al., 1990). Estos criterios se basan en la morfología típica de los espermatozoides que son capaces de migrar a través del moco cervical y logran unirse a la zona pelucida. (Menkveld et al., 2011). Por desgracia, en WHO5 la evaluación de múltiples defectos en los espermatozoides ha descendido a "procedimientos opcionales Como consecuencia de ello, una medida adicional que incluye los diferentes tipos de anomalías puede proporcionar información útil adicional mediante la identificación de patologías morfológicas y funcionales severas espermáticas.

5 Morfología Espermática curso ESHRE El índice de teratozoospermia TZI es una indicación indirecta de el riesgo de lo que parecía ser espermatozoides normales realmente tener defectos que eran invisibles en el nivel de observación y como afecta a su capacidad fecundante (Mortimer y Menkveld, 2001). Rowe et al. (2000) presenta un caso ilustrativo con 4% de formas normales que indican que si el TZI era, 1,7 la fertilización in vitro puede ser exitosa y con un TZI. 1.9 ICSI puede ser necesario con el fin de lograr la fertilización.

6 Morfología Espermática

7 Morfología Espermática

8 OMS 5: Nomenclatura WHO5 conserva el uso de términos de nomenclatura. Numerosos debates y publicaciones discuten posibles valores de referencia y análisis de tales nomenclaturas (ej., Eliasson, 1977; Guzick et al, 2001;. Bjo rndahl et al., 2010).

9 Tinción Vital con eosina. Se basa en que las células muertas tienen alteraciones de la membrana Plasmática, penetra el colorante. Vivos: no teñidos Muertos : Teñidos Los criterios de interpretación para la tinción eosina se ha cambiado arbitrariamente para que 'cabezas de color rosa claro se considera vivo "(OMS, 2010).

10 En WHO5, se afirma que tanto la vitalidad de los espermatozoides como la morfología de los mismos deben evaluarse por duplicado, evaluando 200 espermatozoides en cada réplica a fin de minimizar errores (OMS, 2010).

11 Abstinencia WHO5 recomienda evaluar las muestras seminales obtenidas después de 2-7 días de abstinencia, como se ha recomendado en las cinco ediciones del manual de la OMS.

12 The potencial use of consecutive ejaculates for gaining better quality sperm during fertility tratment Roshan Zaid North Middlesex University Hospital, UK

13 The potencial use of consecutive ejaculates for gaining better quality sperm during fertility tratment Roshan Zaid North Middlesex University Hospital, UK 2º eyaculado: >Motilidad rápida < volumen < inmóviles y móviles lentos >Concentración (no sig.) Estrategia eficiente para incrementar embarazos reduciendo la necesidad de técnicas invasivas

14 Evaluación del Diagnóstico M.E. (ultraestructural) Inmunocitoquímica Técnicas moleculares FISH SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) TUNEL microarrays Desventaja No permiten la utilización de los espermatozoides en tiempo real para ICSI

15 IMSI Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, Ramat Gan, Israel Benjamin Bartoov Selección de espermatozoides utilizando microscopia de alta magnificación (>7000X). Selección en TIEMPO REAL

16 Sperm with large nuclear vacuoles (SLV) negatively influence blastocyst formation, implantation, pregnancy and miscarriage rates in couples undergoing ICSI Amanda Setti Fertility: San Pablo, Brasil SLV (una vacuola >13%) tiene mayor incidencia en parámetros seminales anormales. SLV influencia negativamente la formación de blastocisto, implantación y embarazo. SLV mayor tasa de aborto.

17 Treatment with zinc, d-aspartate and coenzyme q10 protects human spermatozoa in vitro R. Talevi Universidad de Nápoles Federico II, Italia Luego de 6 hs: Motilidad se mantuvo en muestra tratada. Peroxidación espermática es menor en muestras tratadas. Tratamiento antioxidante efecto protección en la fragmentación de ADN. Suplementan la muestra seminal con antioxidanetes y evalúan cada hora durante 6 hs. Analizan cinética con CASA. Analizan peroxidación lipídica espermática. Fragmentación de ADN con TUNEL

18 Treatment of bovine spermatozoa with antioxidants improves embryo production in vitro R. Gualtieri Universidad de Nápoles Federico II, Italia

19 Antioxidant power of seminal plasma on male gamete competence Cornell University Test capicidad antioxidante TAC Abstinencia no varia la concentración de antioxidantes. Correlación directa de concentración y motilidad según la capacidad antioxidante. Muestras normospérmicas mayor TAC al comparar con muestras OAT. Pacientes con un TAC mayor al 1500µM logran embarazo, por debajo de este umbral fallas repetidas de IUI y logran baja tasa de embarazo solo con ICSI. Aporta informe sobre función e integridad espermática.

20 Origin of DNA fragmentation: pre o post spermatogenesis L. Harvey Cornell Medical College, USA Fragmentación de ADN ocurre por fallas de compactación durante la espermatogénesis o como resultado de agentes agresores en el tracto masculino? ROS Causas de daño de DNA DNA mal compactado es suceptible al stress oxidativo Compactación pobre de DNA genera clivages erroneos por las endonucleasas

21 Origen de la fragmentación: epididimo (correlacionan con parámetros seminales y días de abstinencia). Indice de fragmentación: correlaciona con la motilidad (analizan post swim up) Inversamente correlaciona con la tasa de implantación

22 PICSI El PICSI es una técnica que permite pre-seleccionar el espermatozoide a utilizar en un ICSI. Se recomienda realizar PICSI en aquellos pacientes que: Antecedentes de abortos a repetición. Pacientes con resultado TUNEL positivo (fragmentación de ADN > 20%) Placa de PICSI, que contiene un hidrogel de acído hialurónico previamente hidratado. Las gametas masculinas maduras que no presentan fragmentación en su ADN serán capaces de adherirse al área con acído hialurónico. De esta manera, el espermatozoide seleccionado posiblemente sea el mismo que tenga éxito en el proceso reproductivo natural, logrando una selección espermática de manera fisiológica. Estudios demuestran que los espermatozoides unidos al hidrogel, presentan bajo porcentaje de aneuploidías cromosómicas y bajo contenido de ADN fragmentado. A su vez, se mejora la calidad embrionaria y su desarrollo debido a la previa selección de espermatozoides con núcleo normal y ADN intacto.

23 PICSI Effect of sperm selection using hyaluronic acid binding on reproductive outcome with donated oocyte cycles (Clínica quirúrgica TAMBRE, Madrid) No encuentran diferencias significativas en la calidad seminal o fragmentación de ADN espermático. No encuentran diferencias en tasa de fertilización, clivaje, calidad embrionaria y embarazo.

24 Columnas de anexina Live Sperm fraction Para eliminar espermatozoides apoptóticos. Anexina V microesferas Kit

25 Columnas de anexina MACS is a useful technique to improve pregnancy rate in patients with high level of sperm DNA fragmentation (IVI Madrid) Tasa de embarazo: 36.6 % control vs 64.9% Magnetic cell sorting in frozen sperm samples (IVI Alicante) Comparan: Descongelada vs MACS, Gradiente de Densidad vs Grad+MACS >Pre-apoptosis: solo gradiente > apoptotisis: MACS > vitalidad: gradiente + MACS MACS mala calidad de la muestra al comparar con solo gradiente Mejora la calidad al realizar primero el gradiente y luego las MACS Pregnancy outcome after magnetic activated cell sorting used during sperm preparation before ICSI in men with a high rate of sperm DNA fragmentation. (INVICTA Polonia) 79 casos. 38% embarazo clínico, 32.9% nacidos vivos sin malformaciones. Sin grupo control!

26 FISH de Espermatozoides Se analizan todos los cromosomas del espermatozoide? No. Solo se analizan aquellos cromosomas que normalmente se encuentran alterados en mayor proporción: X, Y, 13, 18, 21. Cuándo está indicado realizar esta técnica? 1. Pacientes con alteraciones seminales: oligozoospermia, astenozoospermia, teratozoospermia pueden sugerir alteraciones genéticas en los espermatozoides. 2. Pacientes con meiosis alterada. 3. Pacientes con abortos de repetición: cuando tenemos dos o mas abortos. 4. Pacientes con fallos en FIV (Fecundación In Vitro). < 25% z aneuploides genera embarazo, > 25% no logran embarazo Tras fecundar los ovocitos dará lugar a un mayor número de embriones cromosómicamente anormales. Estos embriones o no implantan o dan lugar a un aborto pero un pequeño porcentaje da lugar a niños nacidos con algún tipo de patología.

27 FISH on sperm to identify infertile male patients with higher aneuploidy risk iviomics (IVI Valencia) Ciclos de IVF/ICSI realizado en pacientes con FISH anormal tienen menor tasa de transferencia, implantación y embarazo al comparar con pacientes con FISH normal. Ciclos de PGS en pacientes con FISH anormal mejoran la implantación y tasa de embarazo al comparar con PGS realizado en pacientes con FISH normal. Pacientes con FISH normal presentan resultados similares en ciclos de IVF/ICSI y PGS. Pacientes con FISH anormal presentan mayor tasa de implantación y embarazo con PGS al comparar con IVS/ICSI. El análisis de FISH en espermatozoides permite identificar pacientes de pobre pronóstico que pueden beneficiarse con la técnica de PGS.

28 Correlation between sperm DNA fragmentation and aneuploidy Existe correlación entre aneuploidias y fragmentación de ADN? (Dr. Gianaroli, SisMeR, Bologna, Italia)

29 Impact of sperm DNA fragmentation on reproductive outcome following IVF and ICSI: a retorspective analysis of 406 cases (Multicéntrico: Dinamarca, USA, Alemania e Irlanda) FIV: PR 45.1% si el índice DFI es <15 % PR 24.6% si el DFI esta entre el 15-25% ICSI: PR 48.7% si el índice DFI es <25 % PR 29.6% si el DFI ES > 25%

30 Are computer assisted semen analysis (CASA) motility parameters predictive of the fertilization rate in conventional IVF? Departamento de medicina reproductiva y ginecologia endocrinologia de la Universidad Maribor, Eslovenia ovf.mb@ukc-mb.si Los parámetros de motilidad convencionales de la OMS (progresivos, no progresivos, y progresivos rápidos) analizado en muestras de semen nativas no correlaciona con la tasa de fecundación in vitro. Los parámetros de motilidad espermática analizados con CASA en muestras seminales nativas o lavadas predicen la tasa de fertilización. Esto es importante a la hora de decidir que procedimiento se utilizará en el laboratorio FIV o ICSI.

31 Effects of sperm concentration after swim up on conventional in vitro fertilization rates Analysis of sperm motility analysis system (SMAS) Instituto Asada, Japón 2 grupos utilizando ambos SMAS: A: 1-2 x 106 Z/ml B: 2-15 x 106 Z/ml Grupo B: > curva de velocidad (distancia/tpo) y > amplitud.

32 Sperm vitrification will replace slow freezing IVI Alicante Analizan marcadores de daño celular (TUNEL) para comparar slow freezing (SF) vs vitrification (V). SF daña la membrana espermática, el citoesqueleto, la función mitocondrial y daña el ADN. Anteriormente, los inicios de la vitrificación espermática no se usaban crioprotectores y aún así la técnica era mejor que el SF. Hay 2 nacimientos. El trabajo realiza V con sucrosa + albumina Diseño: 3 alícuotas: fresco, SF, V SF y V > daño celular, < motilidad progresiva, < vitalidad al comparar con la muestra en fresco. SF vs V La V presenta >vitalidad y < fragmentación de ADN. Concluyen Vitrificación es más conservadora que slow freezing.

33 Gracias por su atención!!!