ESTADO ACTUAL Y PERSPECTIVAS DE LA REPRODUCCIÓN CAPRINA

Transcripción

1 ESTADO ACTUAL Y PERSPECTIVAS DE LA REPRODUCCIÓN CAPRINA ZARAZAGA L.A. UNIVERSIDAD DE HUELVA, Campus de La Rábida Crta.. Palos de la Frontera, s/n, Huelva

2 1. INTERÉS DE CONTROLAR LA REPRODUCCIÓN CAPRINA. 2. EL COMPORTAMIENTO DE LOS MACHOS E INSEMINACIÓN ARTIFICIAL. 3. TRATAMIENTOS FOTOPERIÓDICOS. 4. BIOTECNOLOGÍA EMBRIONARIA. 5. CONCLUSIÓN.

3 INTERÉS DE LA TRANSFERENCIA Producir machos hijos de hembras de élite,, para la I.A. Creación y mejora del progreso genético. Reducción del intervalo generacional. Difusión de la mejora genética. Facilitar los intercambios internacionales de material genético. Disminuir los riesgos de transmisión de enfermedades. Preservar genotipos en peligro de extinción. Usos comerciales.

4 SELECCIÓN DE DONANTES Valor genético-aptitudes zootécnicas. Haber tenido un parto en la época reproductiva anterior y transcurrir 2 a 5 meses antes de iniciar el tratamiento. Rechazar animales con alteraciones reproductivas. Posibilidad de embarazo (pseudogestantes( pseudogestantes). Capacidad de respuesta a superovulación. Presencia de anticuerpos (ecg( ecg, FSHp). Hembras nulíparas,, desarrollo corporal adecuado (60% PV adulto; meses). Enfermedades contagiosas.

5 ETAPAS DE LA TRANSFERENCIA Tratamientos hormonales de preparación de donadoras y receptoras.

6 SINCRONIZACIÓN DE DONADORAS Progestágeno (FGA, MAP) 11-12d Inserción Análogo PgF2α Inicio celo (=J0) IA Colecta embriones (J7) D0 Retirada D10 D11 D12 D13 D14 Inyección de ofsh o pfsh mg 6 dosis bi-quotidianas y decrecientes durante los 3 últimos días del tratamiento progestágeno

7 VARIABILIDAD DE RESPUESTA Número de cuerpos lúteos Caprina (n=9) Ovina (n=10) Porcina (n=9) 4 5 N Tratamiento ( n cabras) Origen FSH

8 RESULTADOS DE FECUNDACIÓN % ovocitos fecundados <15 15 <15 15 <15 15 n CL/cabra Monta IA exocervical IA intra-uterina Baril et al., 1993

9 ETAPAS DE LA TRANSFERENCIA Tratamientos hormonales de preparación de donadoras y receptoras. Fecundación de donadoras: monta, I.A intra-uterina, endoscopia.

10 MÉTODOS DE DETECCIÓN DEL MACHOS ENTEROS CELO-1 Rebaños pequeños y son de valor genético reducido. Con mandil. MACHOS VASECTOMIZADOS Evita cubriciones no deseadas. No modifica el comportamiento sexual del macho (testosterona). Usarlos tras 5 eyaculaciones una vez operados. Irreversible: escaso valor genético. Animales que tengan un buen comportamiento sexual y se reduce la motivación sexual. Tiempo de recuperación largo.

11 MÉTODOS DE DETECCIÓN DEL CELO-2 HEMBRAS ANDROGENIZADAS O MACHOS CASTRADOS. Evita inconvenientes precedentes. Inyección diaria o por implante de esteroides (testosterona o estrógenos). 50 mg de propionato de testosterona diariamente durante 18 días o implante subcutáneo con los mismos esteroides. Animales viejos.

12 MOMENTO DE REALIZACIÓN DE LA I.A. EN CELO NATURAL Una sola I.A. a las 24 horas tras la identificación del celo; en grandes rebaños (número suficiente de animales). CONTROL DEL CELO Y DE LA OVULACIÓN Necesaria para obtener buenos resultados en la segunda parte del celo, antes de que se produzca la ovulación. Necesario sincronizar el celo de las hembras cíclicas o inducirlo si no están cíclicas. Tratamientos hormonales. Obtener producciones en el momento más interesante por precio en el mercado. I.A.

13 MOMENTO DE LA I.A. VARÍA ENTRE LAS DISTINTAS RAZAS Se debe testar previamente o determinar el momento del pico preovulatorio de LH. CABRAS ALPINAS Y SAANEN 43 ± 2 y 45 ± 2 horas, respectivamente. Cabras nulíparas: : 45 ± 2 horas. RESUMEN DE REALIZACIÓN Una sola inseminación a las 45 horas de la retirada de la esponja. Con dos inseminaciones: a las 30 y a las 48 horas de la retirada. Con detección del celo natural: a las 12 y 24 horas de la primera detección. Se tiende cada vez más a una sola inseminación. Número de espermatozoides: Semen fresco: 150 millones Semen congelado: 100 millones por pajuela.

14 INSEMINACIÓN ARTIFICIAL TRANSCERVICAL Más sencilla que en la oveja. Menor fertilidad que por la vía laparoscópica. Respuesta menor cuanto mayor es la tasa de ovulación. INTRAUTERINA (POR VÍA LAPAROSCÓPICA) Fertilidad 60% mayor con semen congelado respecto a la anterior. Menores dosis de semen. Requiere más tiempo de realización. Muy recomendable en ovino. Momento de realización: horas tras la retirada de la esponja.

15 ETAPAS DE LA TRANSFERENCIA Tratamientos hormonales de preparación de donadoras y receptoras. Fecundación de donadoras: monta, I.A intra- uterina, endoscopia. Colecta de embriones: cervical, endoscopia, cirugía.

16 COLECTA POR VÍA QUIRÚRGICA

17 COLECTA POR VÍA CERVICAL

18 MÉTODOS Y RESULTADOS DE LA RECOLECTA Método % estructuras colectadas (1 ra colecta) Autores Por vía cervical 35-50% Soonen et al 1991 Flores-Foxworth, % Suyadi et al., 2000 Por vía endoscópica 60-65% Vallet et al Por vía quirúrgica 70-80% Vallet et al. 1991

19 MÉTODOS DE RECOLECTA : VENTAJAS E INCONVENIENTES Cervical Endosc. Cirugía Trata tamiento PGE o PGF2α no no Anestesi sia Local General General Duración 1h -1h Volumen de colecta > 500 ml 80 ml 80 ml Repetición Si Si 3 Resultado 70 a 95% 100% 100%

20 RECOLECCIÓN Lavado de oviducto o los cuernos uterinos con PBS. Antes del 4º día en el oviducto, 6º-7º día en el cuerno uterino tras el inicio del celo. Siempre con la membrana pelúcida intacta: mórulas o blastocistos.

21 Solución 1 MEDIOS DE RECOLECCIÓN Mg/L Solución 2 Mg/L CaCl 2H 2 2 O 132,5 NaCl 8000 MgCl 6H 2 2 O 100,0 KCl 200 KH PO Na HPO BSA 4000 D-glucosa 1000 Na piruvato 36 Sulfato de estreptomicina Na penicilina-g Disolver los reactivos de las soluciones 1 (en 200 ml agua y mezclar rápidamente). r Ajustar el ph entre miliosmoles. Esterilizar la soluci µm m y conservar a 4ºC U.I. y 2 (en 800 ml de n osmótica ml) y 2 (en 800 ph a 7,3. La presión osm. Esterilizar la solución n final por filtro de 0,22

22 ESTADOS DE DESARROLLO DE EMBRIONES EN CABRA Y OVEJA DÍA DE RECOLECCIÓN OVEJA 2-4 CÉLULAS 1-2 CÉLULAS 8 CÉLULAS 4-8 CÉLULAS 8-20 CÉLULAS 8-20 CÉLULAS CABRA 5 MÓRULA JÓVEN 20 CÉLULAS-MÓRULA JÓVEN 6 MÓRULA COMPACTADA- MÓRULA JOVEN BLASTOCISTO 7 BLASTOCISTO MÓRULA COMPACTADA. EXPANDIDO Y FUERA DE BLASTOCISTO EXPANDIDO LA ZONA PELÚCIDA 8 BLASTOCISTO FUERA DE LA ZONA PELÚCIDA BLASTOCISTO EXPANDIDO Y FUERA DE LA ZONA PELÚCIDA

23 ETAPAS DE LA TRANSFERENCIA Tratamientos hormonales de preparación de donadoras y receptoras. Fecundación de donadoras: monta, I.A intra-uterina, endoscopia. Colecta de embriones: cervical, endoscopia, cirugía. Selección de embriones: morfología.

24 SELECCIÓN MORFOLÓGIACA No fertilizados Morulas Compactadas Blastocitos en vía de eclosión Blastocitos

25 EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS EMBRIONES Una vez recolectados se colocan en una placa de Petri con PBS filtrado con un 4% de BSA La clasificación n es la siguiente: I. Excelente: Embrión n ideal, esférico, simétrico, con células c de tamaño, color y textura uniforme. II. Bueno: embrión n con pequeñas desigualdades entre los blastómeros, algo de picnosis y pequeñas vesículas. III. Regular: embrión n con algunas células c degeneradas, vesiculación y blastómeros irregulares. IV. Malo: embrión n con muchas células c degeneradas, grandes y gran cantidad de vesículas. El grado de desarrollo debe ser el adecuado y no deben tener un retraso superior a 48 h de lo que sería normal.

26 DESARROLLO EMBRIONARIO

27 DESARROLLO EMBRIONARIO

28 ETAPAS DE LA TRANSFERENCIA Tratamientos hormonales de preparación de donadoras y receptoras. Fecundación de donadoras: monta, I.A intra-uterina, endoscopia. Colecta de embriones: cervical, endoscopia, cirugía. Selección de embriones: morfología. Criopreservación de los embriones: congelación lenta, vitrificación.

29 CRIOCONSERVACIÓN Congelación lenta Baja concentración de crioprotectores (1,5 M Etilen-glicol).

30 CONGELACIÓN LENTA Crioprotector con el medio de conservación n (PBS + 4%BSA4 %BSA) provoca un aumento considerable de la presión n osmótica. Para reducir el choque osmótico, los embriones se pasan sucesivamente, durante 5 a 10 minutos por baños de un medio de conservación n que contenga una concentración n creciente de crioprotector: Glicerol 0,7 M, después s de 10 minutos a 1,4 M Etilenglicol 0,5 M, 1,0 M, y después s 1,5 M con pasos de 5 minutos. Después s del último baño, es decir, cuando se alcanza la concentración n final del crioprotector, los embriones se preparan para la congelación n normalmente en pajuelas de 0,25 ml esterilizadas. Llenado de las pajuelas: 3 compartimentos de líquido l separados por burbujas de aire. Cada pajuela debe llevar 2 ó más s embriones, en función n de la carga que se desee. La primera columna de la pajuela debe ser de PBS con crioprotector, después s se deja una burbuja y se cogen los embriones, otra burbuja y se termina de llenar la pajuela.

31 CRIOCONSERVACIÓN Congelación lenta Baja concentración de crioprotectores (1,5 M Etilen- glicol). Enfriamiento lento: deshidratación progresiva que limita la formación de cristales de hielo intracelulares. Necesidad de un aparato programable, o congelación por vapores de nitrógeno. Tiempo necesario 2 h C - 7 C - 30 C 4 C/mn 10 mn à - 7 C Inducción de la cristalisación 0.3 C/mn 2500 C/mn C 1h45

32 DESCONGELACIÓN-1 La descongelación n debe ser rápida, r de manera que se descongelan sacándolas del nitrógeno líquido l y metiéndolas en agua a 37º durante 30 segundos. Inmediatamente después s de la descongelación, n, es indispensable eliminar rápidamente r el crioprotector para la supervivencia del embrión. No obstante, las células c que presentan una concentración n elevada de crioprotector no deben ser colocadas directamente en un medio isotónico. En tal caso, las diferencias de presión n osmótica provocaría a una entrada demasiado rápida r de agua en la célula c con el riesgo de reventar. Es necesario proceder a la eliminación n progresiva del crioprotector, de manera que los flujos de salida de crioprotector y de entrada de agua sean compatibles con la permeabilidad de la membrana plasmática.

33 MÉTODOS: DESCONGELACIÓN-2 1) Eliminación n del crioprotector por etapas, se hace de forma inversa a la adición n del criprotector: etilenglicol: : 1,5 M, 1,0 M, 0,5 M y por último 0 M. La duración n en cada baño o es de minutos. 2) La eliminación n del crioprotector por efecto de la sacarosa, el principio es acelerar el flujo de salida. La molécula de sacarosa no penetra en la célula c por simple difusión n lo que su presencia en el medio crea un aumento de la presión n osmótica del medio extracelular, favoreciendo la difusión n masiva de crioprotector en el compartimiento intracelular. Los embriones descongelados se depositan directamente en una solución n de PBS que contiene de 0,25 a 0,5 M de sacarosa y luego en 2 ó 3 baños de PBS antes de ser examinados.

34 MÉTODOS: DESCONGELACIÓN-3 3) También n se puede eliminar el crioprotector por efecto de la sacarosa directamente en el interior de la pajuela. Para ello, durante el llenado de la pajuela antes de la congelación, n, los embriones aspirados en una gota de medio de congelación n (etilenglicol( 1,5M en PBS con 20 SVF) son separados por burbujas de aire y una solución n de PBS con sacarosa 0,25M. Después s de la descongelación n se sacude la pajuela para mezclar las soluciones de etilenglicol y de azúcar, permitiendo de esta forma la difusión n del crioprotector al exterior de las células c en poco minutos. En el caso de transplante por endoscopia, esta técnica t permite transplantar directamente el contenido de la pajuela en el útero sin previa observación n ni manipulación del embrión. Tras la eliminación n se valora la calidad de los embriones con lupa a 80 aumentos y sólo s se transplantarán n los que presenten unos contornos celulares nítidos. n

35 CRIOCONSERVACIÓN Congelación rápida: vitrificación La vitrificación n consiste en someter a los embriones a concentraciones elevadas de crioprotectores con el fin de aumentar la viscosidad del medio intra y extracelular. En este caso, es posible enfriar rápidamente r los embriones sin que se produzca la formación n de cristales y se consigue introduciendo directamente la pajuela en nitrógeno líquido. l (50%) Para la realización n práctica, se equilibra primero el embrión n a 20º durante 10 minutos en una mezcla de glicerol (10%) y propilenglicol (20%) en una solución n de PBS con 10% de SFB o de un 6% de BSA. Seguidamente se sumerge durante un tiempo muy corto (1 minuto) en una mezcla de glicerol al 25% y propilenglicol a 25%. Viscosidad importante: estado vidrioso sin formación de cristales s de hielo. Toxicidad de los crioprotectores a concentración elevada. Enfriamiento rápido. No se necesita aparato. Tiempo necesario: 10. Para la descongelación, n, se sumergen en agua a 20º y luego en una solución de sacarosa 1M en PBS durante 10 minutos. Inmediatamente después s se hidratan los embriones pasándolos por dos baños sucesivos de PBS con SFB.

36 TRANSFERENCIA 100 % b a Partos Embriones vitrificados d c Sobrevivencia de embriones Embriones congelados a vs. b; c vs.d : diferencia no significativa

37 ETAPAS DE LA TRANSFERENCIA Tratamientos hormonales de preparación de donadoras y receptoras. Fecundación de donadoras: monta, I.A intra- uterina, endoscopia. Colecta de embriones: cervical, endoscopia, cirugía. Selección de embriones: morfología. Criopreservación de los embriones: congelación lenta, vitrificación. Transferencia de los embriones congelados.

38 INDUCCIÓN DE RECEPTORAS SIMILAR AL DE LAS DONANTES: Mismo estadio fisiológico donante-receptora. Tratamiento progestativo+ecg 48 h antes de la retirada. Retirada de la esponja 12 h después de las donantes si se han superovulado con FSH.

39 TRANSPLANTE CALIDAD DE LOS EMBRIONES. NÚMERO. MOMENTO DE REALIZACIÓN. TRANSPLANTE BILATERAL O UNILATERAL. LUGAR DEL TRANSPLANTE. SINCRONIZACIÓN DONANTE/RECEPTORA. RESPUESTA OVULATORIA DE LA RECEPTORA. MÉTODOS DE TRANSPLANTE Vía quirúrgica Endoscopía Vía cervical

40 FACTORES DE VARIACIÓN DE LA FERTILIDAD INDIVIDUO Estado del ovario, número de pequeños folículos. Posibilidad de realizar un pretratamiento para aumentar número de pequeños folículos (10 días antes del tratamiento de superovulación con FSH). RAZA ESTACIÓN O ÉPOCA DEL AÑO Tasa de ovulación. Número de embriones anómalos. ALIMENTACIÓN Alimentación insuficiente: luteolisis prematura. ESTADO DE PSEUDOGESTACIÓN Aparece en más del 50% de los rebaños. Se observa en el 3-4% 3 de las hembras. Presencia de un cuerpo lúteo persistente. 100 µg de cloprostenol 20 y 10 días antes de colocación esponja. Resultados inciertos del tratamiento, disminuye la tasa de fertilidad.

41 FACTORES DE VARIACIÓN DE LA FERTILIDAD RESPUESTA DEL OVARIO AL TRATAMIENTO HORMONAL. No todas las hembras responden al tratamiento progestativo. Incluso el 25% de las hembras no presentan elevación de las concentraciones de progesterona 6 días después de la retirada. Ovulación O tardía o luteolisis prematura con nueva ovulación. MOMENTO DE LA OVULACIÓN. Intervalo entre el inicio del estro y pico preovulatorio de LH varía de 11,2 ± 5,6 h. El intervalo entre el pico de LH y el inicio de las ovulaciones es casi constante de unas 22 h. Muy importante para determinar momento de I.A., y sincronización con receptoras.

42 FACTORES DE VARIACIÓN DE LA FERTILIDAD MOMENTO DE LA OVULACIÓN Administración de GnRH al final del tratamiento progestativo. Varía de las 44 hasta las 68 horas de la retirada de la esponja. REPETICIÓN DEL TRATAMIENTO Aparición de anticuerpos anti-ecg ecg. Con 3 a 5 tratamientos aumenta la frecuencia (31%) de salida en celo tardía (más de 30 horas tras la retirada de la esponja), mientras que es del 16,7% con menos de 3 tratamientos.. Retraso de aparición del celo retraso del pico de LH PROLIFICIDAD DE LAS HEMBRAS INSEMINADAS

43 Rendimientos de la transferencia de embriones Cabras Alpine-Saanen Num. Ovulaciones 14 Estructuras colectadas (70-75%) 75%) Embriones fertilizados (70-80%) 7-9 Embriones de buena calidad 6-8 Embriones congelables (85 % de los fertilizados) Embriones utilizables después descongelación (80%) 5-6 Cabritos nacidos por donadora tratada (45-50%) 50%) 2-3

44 TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA FIV: inseminación de los ovocitos en gotas de cultivo con los espermatozoides ICSI: microinyección de un espermatozoide dentro de un ovocito

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58 40 0,61 Recogida 6 Recogida (10 ) litros ,53 0,46 Precio (Euros/litro) 10 0 E Precio F M A M J J A S O N D MES 0,38 0,30 Diferencia de precio = 0,20 Euros/litro (+53%) Variaciones mensuales de la recogida de leche de cabra por los industriales y del precio pagado al productor (Francia) 1. INTERÉS DE CONTROLAR LA REPRODUCCIÓN CAPRINA (Chemineau et al 1995).

59 Transferencia directa vs tradicional de embriones congelados (congelación lenta) Método de Cabritos nacidos/ Cabritos nacidos/ transferencia Receptoras Partos Embriones transf. Embriones (%) descongelados Tradicional * a 46 c 36 Directa b 34 d 34 *80% (112/140) de los embriones descongelados fueron considerados transferibles Baril et al. 2004