CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI AISLADAS DE CANALES DE POLLO OBTENIDAS DE RASTRO, MERCADOS PÚBLICOS Y SUPERMERCADOS

Transcripción

1 CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI AISLADAS DE CANALES DE POLLO OBTENIDAS DE RASTRO, S PÚBLICOS Y SUPERS Ramírez Gómez Perla Marlen 1, Castañeda Serrano María del Pilar 2, Eslava Campos Carlos Alberto 3, Navarro Ocaña Armando 3, Delia Licona Moreno 3, Morales Espinosa María del Rosario 4, Rosario Cortés Cecilia 1. 1 Departamento de Producción Animal: Aves, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. Circuito Exterior s/n Ciudad Universitaria, cp México D.F 2 Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Avícola CEIEPAv. Manuel M. López s/n, Avenida Tláhuac, km 21.5, Colonia Zapotitlán, Delegación Tláhuac, en México, D.F.3Departamento de Salud Pública, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Circuito Interior s/n Ciudad Universitaria, cp Mexico D.F. 4 Departamento de Parasitología y Microbiología Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Circuito Interior s/n Ciudad Universitaria, cp México D.F. Introducción La presencia de microorganismos patógenos durante la crianza y procesamiento de las aves, así como durante su transporte y comercialización son factores que favorecen la presencia de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA); las cuales constituyen uno de los principales problemas de salud pública en el mundo (1,2). La contaminación microbiana puede ocurrir durante el procesamiento de las canales de pollo en los rastros, como consecuencia de los procedimientos que se emplean. En cada etapa del proceso, existe la oportunidad para la contaminación de la canal por los microorganismos presentes en las instalaciones o por contaminación cruzada de otras aves (3). Por otro lado, en México la comercialización del pollo en mercado público ocupa el 20% y en supermercado es del 15% (4). Durante el transporte de las canales de pollo a los diferentes puntos de venta y al llegar a estos lugares, la manipulación del producto muchas veces es inadecuada, además de que no cumplen con las medidas de higiene necesarias, no se conserva la cadena fría durante el transporte y venta del producto, lo que contribuye a deteriorar su calidad microbiológica, pues cabe destacar que no existe una normatividad que especifique las condiciones de higiene necesarias para su manipulación y las medidas para conservar el producto. Como ya se ha mencionado, la seguridad microbiológica de los productos cárnicos es un problema de salud pública importante. En particular, los reportes de E. coli como causa potencial de diarreas graves han aumentado (2). Las cepas diarrogénicas de E. coli en conjunto, son la principal causa de gastroenteritis en niños en países en vías de desarrollo, y son responsable del 30 al 40% de todos los casos de diarrea en niños (5, 6). Aunque la mayoría de los productos cárnicos deben estar adecuadamente cocinados antes de su consumo, la presencia de E. coli en la carne pone a los consumidores en situación de riesgo, ya que puede ocurrir una contaminación cruzada de manos, utensilios o superficies a productos que no recibirán tratamientos térmicos antes de su consumo (2). Se ha clasificado en tres grupos de importancia biológica para el humano: cepas comensales, cepas intestinales y cepas extraintestinales (8, 9). Es un habitante normal de la biota intestinal de animales, incluyendo aves y humanos. Por ello, se utiliza como el indicador principal para detectar y medir la contaminación fecal en la evaluación de la inocuidad del agua y alimentos. Por lo que se transmite a través de de la contaminación fecal de los alimentos y del agua, así como también a través de la contaminación cruzada o por contacto directo durante la preparación de los alimentos (7). Hay diversas clonas de E. coli que han adquirido atributos específicos de virulencia, los cuales le confieren la habilidad de adaptarse a nuevos nichos, permitiéndole causar un espectro amplio de enfermedades. Esta persistencia exitosa de las combinaciones de factores génicos

2 relacionados con virulencia ha llevado a la clasificación de las E. coli en patotipos específicos que son capaces de causar enfermedades intestinales y extraintestinales; tales como diarrea, infecciones del tracto urinario, septicemia y meningitis neonatal (10, 11, 12). En el caso de aquéllas que ocasionan enfermedades digestivas, se han descrito cinco grupos basados en sus rasgos de virulencia (13, 14), Enterotoxigénica (ETEC), Enteropatógena (EPEC), Enteroinvasiva (EIEC), Enteroagregativa (EAEC) y Enterohemorrágica (EHEC) (14). Debido a que la carne de pollo es el producto de origen animal con mayor demanda en nuestro país, es necesario evaluar la calidad microbiológica de las canales de pollo para definir la importancia epidemiológica que tiene el pollo en la transmisión de patógenos, utilizando como modelo a E. coli, ya que este es un patógeno importante que afecta tanto a aves como a humanos, por lo que el objetivo del presente trabajo fue realizar una evaluación sobre las características que tienen las cepas de E. coli aisladas a partir de canales de pollo obtenidas de rastro, mercados públicos y supermercados ya que en nuestro país no existe información sobre la situación sanitaria del pollo y la presencia de grupos diarreogénicos de E. coli durante su procesamiento y comercialización. Material y Métodos Se realizó un estudio con la finalidad de evaluar la calidad microbiológica de las canales de pollo del rastro y de los puntos de venta utilizando a Escherichia coli como modelo de estudio. Para ello, se tomaron 10 canales de pollo de un rastro TIF ubicado en el centro del país, 10 canales de 3 mercados públicos y 10 canales de 3 supermercados ubicados en la ciudad más cercana a la planta de procesamiento; las canales de rastro, se tomaron después de que salieron del tanque de enfriamiento; mientras que las de mercado público y supermercado fueron adquiridas en los puntos de venta y se mantuvieron en refrigeración para su posterior evaluación en el laboratorio. Para determinar la calidad microbiológica de las canales antes de la salida del rastro y en los puntos de venta se utilizó la técnica de lavado de canales, para ello, se colocó cada canal eviscerada en una bolsa de plástico estéril a la cual se le agregaron 100 ml de solución amortiguadora de fosfatos (PBS) 1x estéril y se realizó el lavado de la canal durante 1 minuto cubriendo con el PBS las superficies internas y externas de la canal; posteriormente, se tomó 1 ml del lavado de las canales a partir de la cual se realizaron 4 diluciones décuples seriadas y de cada una se sembró un mililitro en una microplaca de cultivo para aerobios totales y coliformes totales RIDA COUNT. Las microplacas se incubaron 48 horas a 37 C para su posterior contabilización. Por cada muestra se tomaron 5 alícuotas del PBS (1ml), cada muestra se sembró en 10 ml de caldo nutritivo, posteriormente se incubaron a 37 C durante 24h, y se tomó una asada para sembrarla en Agar MacConkey. Por cada muestra se seleccionó una colonia para su posterior identificación mediante pruebas bioquímicas (urea, SIM, citrato, TSI, LIA). Se aislaron un total de 150 cepas de E. coli, 5 cepas por cada canal de pollo. La identificación serológica se realizó mediante la técnica empleada en el laboratorio de Bacteriología del Departamento de Salud Pública de la Facultad de Medicina de la UNAM de acuerdo con Orskov y Orskov (15), mediante la utilización de sueros monovalentes específicos (SERUNAM) obtenidos de conejo Nueva Zelanda blanco. Para la determinación de genes de virulencia mediante PCR se usaron nueve secuencias específicas para el análisis de genes relacionados con factores de virulencia de los 5 grupos diarreogénicos de E. coli. En la cuadro 1 se mencionan los genes y las secuencias que se utilizaron.

3 Cuadro 1. Genes y secuencias de los grupos diarreogénicos. Para la identificación de los grupos filogenéticos, se utilizó un PCR múltiple descrito por Clermont 18. La amplificación de chua+, yjaja+, corresponden al grupo filogenético B2; chua+, yjaja- corresponde al grupo D; chua-, TSPE4.C2 + al grupo B1 y chua-, TSPE4.C2 grupo A. En el cuadro 2 se mencionan los genes y las secuencias que se utilizaron. Gen o Amplicon fragmento de DNA Nombre Secuencia de iniciadores 5-3 chua Gen necesario para el transporte del grupo hemo en O157: H7 de E. coli EHEC. ChuA.1 ChuA.2 GACGAACCAACGGTCAGGAT TGCCGCCAGTACCAAAGACA 279 yjaja Gen identificado en el genoma de E. coli K-12, (no se conoce su función). YjaA.1 YjaA.2 TGAAGTGTCAGGAGACGCTG ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC 211 TSPE4.C2. Asociado a cepas que causan meningitis neonatal. Fragmento de 14.9kb. TspE4C2.1 TspE4C2.2 GAGTAATGTCGGGGCATTCA CGCGCCAACAAAGTATTACG 152 Cuadro 2. Genes y secuencias para determinar los grupos filogenéticos de E. coli.

4 Resultados y discusión Calidad microbiológica de las canales En el cuadro 3 se muestra el promedio de UFC/ml log 10 de mesófilos aerobios y coliformes totales de las canales según su origen. Las canales muestreadas en mercados públicos presentaron los valores más altos, a diferencia de rastro y supermercados en donde no hubo diferencia estadística significativa (P > 0.05). El uso del conteo de mesófilos aerobios y coliformes totales son una herramienta para el control de la calidad de productos de origen animal y un conteo alto nos indica malas prácticas de higiene y también una inadecuada temperatura de almacenaje. Por ello, el hecho de que en mercados públicos se obtuvieron canales con cuentas elevadas de mesófilos aerobios y coliformes totales, muestra las deficiencias que se presentan en estos lugares, como la excesiva manipulación, la falta de refrigeración y el contacto de las canales al medio ambiente. Este hecho, subraya la posibilidad de que estas canales pudieran estar contaminadas por microorganismos patógenos, ya que éstos son mesófilos. Por otro lado, la vida de anaquel de las canales está determinada por la carga bacteriana inicial, temperatura de almacenamiento y el ambiente alrededor del producto; es decir que cuentas elevadas de mesófilos aerobios disminuyen la vida de anaquel. PROMEDIO DE MESÓFILOS AEROBIOS Y COLIFORMES TOTALES POR ORIGEN ORIGEN MESÓFILOS UFC/ml Log 10 COLIFORMES UFC/ml Log 10 SUPER a a b b PÚBLICO RASTRO a a Cuadro 3. Promedio de promedio de UFC/ml log 10 de mesófilos aerobios y coliformes totales. Literales iguales en la misma columna nos indica que no existe diferencia estadística significativa (P>0.05). Escherichia coli estuvo presente en todas las canales muestreadas en este estudio, lo cual no es raro pues esta bacteria es parte de la biota intestinal de humanos y animales, como ya se mencionó, su presencia en los alimentos es considerada un indicador de la contaminación fecal directa o indirecta. La calidad microbiológica de las canales, es un reflejo de la carga microbiana de las aves vivas de corral y de la calidad de los procesos que se llevan a cabo en los rastros. Las aves que se incorporan a la cadena de sacrificio se pueden contaminar con microorganismos transportados en los intestinos, en la piel y entre las plumas. Estos incluyen tanto las bacterias entéricas y organismos derivados del medio ambiente. Se tipificaron las 150 cepas de Escherichia coli, de las cuales se identificaron 48 serogrupos diferentes, siendo O8 (16.5%), O7 (13.5%), O48 (13.5%), ONT (13.5%), O103 (12%), O11 (12%), O15 (12%) y O6 (10.5%) los más frecuentes. También se identificaron 26 antígenos flagelares diferentes y 14 cepas no móviles. Los antígenos flagelares más frecuentes fueron H21 (12.67%), H16 (8%) y H4 (7.33%).

5 SEROGRUPOS Rastro Supermercado mercado público TOTAL O O O O? O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O88, O165, O99, O26, O O85, O45, O128ab, O73, O154, O157, OR, O102, O65, O111ab, O35, O O119, O4, O TOTAL Cuadro 4. Serogrupos según el origen de las canales. Los serogrupos marcados con gris son aquellos que se aislaron en más de un sitio de muestreo

6 En un estudio realizado en nuestro país por Rosario et al. (19) se aislaron cepas de los serogrupos O8, O103, O15, O84 en muestras de aves con infección de saco vitelino de una granja avícola, por otro lado Morales et al (20), aislaron cepas de los serogrupos O8, O7, O15 de aves de traspatio del Estado de Veracruz. Estos serogrupos coinciden con los reportados en este trabajo, lo que nos sugiere que algunas de las cepas encontradas en las canales de este estudio pudieran tener su origen desde granja. De las cepas de E. coli aisladas de canales de pollo procedentes de los tres mercados públicos, se encontraron 30 serogrupos diferentes. En estos puntos de venta se encontró una mayor cantidad de serogrupos a diferencia de los supermercados y del rastro en donde se encontraron 19 serogrupos en ambos. Esta información coincide con los mencionado anteriormente, que en los mercados públicos existen malas prácticas de higiene, lo que hace que aumenten la cantidad de serogrupos en estos lugares y aumente el riesgo para la salud del consumidor. Cabe mencionar que dentro de los serogrupos encontrados en las canales de mercados públicos hubo un aislamiento del serogrupo O157, el cual de acuerdo a los reportes es poco común en nuestro pais y en aves, por ello, este hecho sugiere que la contaminación pudiera ser de origen humano. Las cepas del serotipo O157:H7 han sido descritas dentro del grupo EHEC, en cual ha estado implicado en brotes de colitis hemorrágica, e incluso en muertes ocasionadas por el síndrome urémico hemolítico. Sin embargo cabe mencionar que la cepa que se aisló no perteneció a este grupo ya que fue no movil. Por otra parte, de los 19 serogrupos de E. coli que se aislaron de las canales de pollo del rastro TIF, 12 serogrupos también se encontraron ya sea en canales de mercados públicos o de supermercados, lo que podría indicar que la contaminación está presente desde granja o rastro. En total se obtuvieron 78 serotipos diferentes. Los más frecuentes fueron O103:H21 (8), O11:H6 (8) y O7:H4 (7). Algunos de ellos se aislaron más de una vez en la misma canal, lo que indica una colonización de las aves. De acuerdo a la clasificación serológica de las 150 cepas de E. coli; el grupo diarreogénico STEC (E. coli productora de Shiga toxinas) fue el más común en los tres lugares muestreados, seguido por ETEC y EPEC. Sin embargo, en la búsqueda de genes de virulencia (stx1, stx2, st, lt, eae, bfp, ipah, aap, aggr), el 5.3% (8 cepas) fueron positivas al gen stx2, en de las cuales 6 se aislaron de canales de supermercados y 2 de mercados públicos(cuadro 5). Por otro lado, 6 cepas de E. coli presentaron el gen eae, estas cepas fueron aisladas de canales de pollo de mercados públicos (5 cepas) y solo una se aisló del rastro. En resumen, de los 150 aislamientos solo 14 dieron positivos a genes de virulencia. Por lo que probablemente indica que las E. coli aisladas de las canales de pollo son consecuencia de una contaminación fecal por cepas comensales del tracto digestivo de las aves o de humanos. ORIGEN IDENTIFICACIÓN GEN VIRULENCIA GRUPO FILOGENÉTICO Cuadro 5. Cepas positivas a los genes de virulencia stx2 y eae. SEROTIPO SUPER 1-1 stx2 (+) D O26:H25 SUPER 1-4 stx2 (+) A O?:NM SUPER 2-2 stx2 (+) B1 O71:H? SUPER 3-1 stx2 (+) D O40:H? SUPER 5-5 stx2 (+) A O6:H16 SUPER 6-5 stx2 (+) D O36:H4 PÚBLICO 12-5 eae (+) D O111ab:H? PÚBLICO 13-1 eae (+) B1 O7:H17 PÚBLICO 15-2 eae (+) D O15:H6

7 PÚBLICO 16-3 stx2 (+) D O138:NM PÚBLICO 16-5 stx2 (+) D O138:NM PÚBLICO 18-1 eae (+) D O102:H6 PÚBLICO 18-3 eae (+) B1 O184:H7 RASTRO 26-1 eae (+) B1 O159:H? En cuanto a los resultados de los grupos filogenéticos, de las 150 cepas de E. coli, 48 cepas (32%) pertenecieron al grupo A, 61 cepas (40.67%) al grupo B1, 5 cepas (3.33%) al grupo B2 y 36 cepas (24%) al grupo D. De las cepas que presentaron el gen stx2, 5 pertenecieron al grupo D, 2 al grupo A y 1 al grupo B1. El análisis de grupos filogenéticos es una herramienta utilizada para diferenciar cepas comensales (A y B1) de cepas patógenas extraintestinales (B2 Y D). En los aislamientos del estudio mostraron pertenecer principalmente al filogrupo de comensales. De acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio, podemos concluir que la presencia de conteos elevados de mesófilos aerobios y coliformes totales en las canales de pollo son un indicativo de algunos problemas de manejo durante el procesamiento de las aves y en los puntos de venta, aunque podemos destacar que en marcados públicos se deben de tomar medidas necesarios de higiene Es importante destacar que las cepas presentes en las canales de rastro, no presentaron genes de virulencia, salvo una cepa, pero podría representar un riesgo para el consumidor. Este es el primer trabajo que se realiza sobre el tema, es importante ampliar la información, y realizar muestreos en los diferentes Estados de la Republica, para tener un panorama más amplio de la calidad microbiológica de las canales. Bibliografía 1. Richardson RI, Mead GC. Ciencia de la carne de ave. Zaragoza, España. Acribia, Lee GY, Jang HI, Hwang IG, Suk M; Prevalence and classification of pathogenic Escherichia coli isolated from fresh beef, poultry, and pork in Korea. Int J Food Microbiol 2009; 134: Thomas CJ, McMeekin TA. contamination of broiler carcass skin during commercial processing procedures: an electron microscopic study. Appl Environ Microbiol 1980; 40: Unión Nacional de Avicultores. Compendio de Indicadores Económicos del Sector Avícola Ed. Dirección de Estudios Económicos. México (D.F) 5. O'Ryan M, Prado V, Pickering LK. A millennium update on pediatric diarrheal illness in the developing World. Semin Pediatr Infect Dis 2005;16(2): Parashar U, Umesh D, Bresee JS, Joseph S, Glass RI, Roger I, The global burden of diarrhoeal disease in children. Bulletin of the World Health Organization 2003; 81: Arzú OR, Peiretti HA, Rolla RA, Walter R. Evaluación de riesgo microbiológico en superficies inertes y vivas de manipuladores en áreas de producción de un supermercado del Nordeste Argentino. 8. Croxen MA y Finlay BB. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nat. Rec. Microbiol 2010; 8(1): Russo TA, Johnson JR. Proposal for a new inclusive designation for extraintestinal pathogenic isolates of Escherichia coli: ExPEC. J. Infect. Dis 2000; 181: Kaper JB, Nataro JP, y Mobley HL. Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol 2004; 2: Clermont O, Olier M, Hoede C, Diancourt L, Brisse S, Keroudean. Animal and human pathogenic Escherichia coli strains share common genetic backgrounds. Infec Genet Evol 2011; 11: Escobar-Páramo P, Sabbagh A, Darlu P, Pradillon O, Vaury C, Denamur E, y Lecointre G, Decreasing the effects of horizontal gene transfer on bacterial phylogeny: the Escherichia coli case study. Mol Phylogenet Evol 2004; 30: López-Saucedo C, Cerna JF, Villegas-Sepulveda N, Thompson R, Velazquez R, Torres J, Tarr P, y Estrada-García T. Single Multiplex Polymerase Chain Reaction To Detect Diverse Loci Associated with Diarrheagenic Escherichia coli; Emerg Infect Dis 2003; 9 (1): Nataro JP, KaperJB. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 1998;11(1):

8 15. Orskov F, Orskov I. Serotyping of Escherichia coli In: Method of Microbiology vol.14. London: T. Bergen. Academic Press, 1984; 36 (4): Navarro A, Eslava C, Perea L, Inzunza A, Delgado G, Morales R, Cheasty T, Cravioto A. New enterovirulent Escherichia coli serogroup showing antigenic and genotypic relationships to Shigella boydii 16. J Med Microbiol, 2010; 59: Huang D, Mohamed JA, Nataro JP, DuPont LH, Jiang Z. Virulence characteristics and the molecular epidemiology of enteroaggregative Escherichia coli isolates from travellers to developing countries. J Med Microbiol. 2007; 56: Clermont O, Bonacorsi S, Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl Environ Mibrobiol 2000; 66: Rosario CC, López CC, Téllez IG, Navarro OA, Anderson RC, Eslava CC. Serotyping and virulence genes detection in Escherichia coli isolated from fertile and infertile eggs, dead-in-shell embryos, and chickens with yolk sac infection. Avian Dis 2004; 48: Morales DA, Detección de cepas diarreogénicas de Escherichia coli y Salmonella entérica en aves de traspatio de la comunidad Agua Escondida del Municipio de Zentla Veracruz (Tesis de Maestría). México D.F; UNAM 2009.