MECANISMOS DE ACTIVACION Y REGULACION DE LA VIA ERK1/2 POR EL FACTOR LIBERADOR DE CORTICOTROPINAS

Transcripción

1 Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C. 13 al 18 noviembre 2005; Oaxaca, Oaxaca. MECANISMOS DE ACTIVACION Y REGULACION DE LA VIA ERK1/2 POR EL FACTOR LIBERADOR DE CORTICOTROPINAS Mariana Fuentes González 1, Judith Hernández Aranda 1, Richard Hauger 2 y Jesús Alberto Olivares Reyes 1 1 Departamento de Bioquímica, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Av. Instituto Politécnico Nacional 2508 Col. San Pedro Zacatenco, México, D. F., México y 2 VA and Department of Psychiatry, University of California, San Diego, USA INTRODUCCION Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs, de sus siglas en ingles G Protein Coupled Receptors) constituyen la mayor superfamilia de receptores de la superficie celular en el genoma humano, en donde representan al menos 600 genes distintos. Aunque todos los GPCRs comparten entre sí una estructura común que consisten en una cadena polipeptídica cuya estructura posee siete hélices α transmembranales unidas por asas alternadas intracelulares y extracelulares, todos ellos difieren tanto en su secuencia primaria como en el tamaño y complejidad de las asas intra-y extra-celulares. Esta diversidad les permite responder a una extraordinaria variedad de estímulos, desde neurotransmisores y hormonas peptídicas hasta moléculas odorantes y fotones de luz (1). Todos los GPCRs una vez activados por su ligando interaccionan con proteínas heterotriméricas recambiadoras de nucleótidos de guanina (o proteínas G). En su estado inactivo la subunidad α de las proteínas G tiene unido GDP (α-gdp). La unión del ligando a los GPCRs estabiliza al receptor en una conformación activa, permitiendo el contacto entre los dominios intracelulares del receptor y la subunidad α-gdp de la proteína G heterotrimérica. Esta interacción cataliza el recambio de GDP por GTP en la subunidad α y permite la disociación de la subunidad α-gtp del heterodímero βγ. Una vez disociados, ambos, la subunidad α y el dímero βγ regulan la actividad de efectores enzimáticos como la adenilato ciclasa, la fosfolipasa C y canales iónicos. Aunque el papel central de los GPCRs en la neurotransmisión y en la regulación del metabolismo intermediario está bien establecido, la apreciación de su participación en el control de la proliferación y en la diferenciación celular es conocida desde hace un poco más de una década. El descrubrimiento de que mutaciones que mantienen activos de manera constitutiva a los GPCRs y a las subunidades α están relacionados a ciertas formas de neoplasia, establecieron el potencial oncogénico de los GPCRs. Gracias a un extenso estudio, ahora se reconoce que los GPCRs transmiten señales que influencia el crecimiento celular o la diferenciación en un número importante de desórdenes clínicos 1

2 comunes, entre ellos la hipertrofia prostática, la hiperplasia del músculo liso vascular y la hipertrofia cardiaca. En muchos caso estos efectos se ejercen a través del control de las cinasas reguladas por señales extracelulares (o ERK1/2, extracellular signal-regulated kinases), enzimas pertenecientes a la familia de la proteinas cinasas activadas por mitógeno (MAPK, mitogen-activated protein kinases). El factor liberador de corticotropinas (o CRF, corticotropin-releasing factor) fue aislado y caracterizado en 1981 como el principal factor encargado de la respuesta endocrina al stress en mamíferos (2). El CRF pertenece a una familia de péptidos compuesta por al menos por 9 péptidos relacionados con el CRF. Todos ellos constan de una sola cadena polipeptídica de aproximadamente 41 residuos de aminoácidos, algunos de los cuales han sido aislados de diferentes grupos de vertebrados y teniendo funciones similares. De manera interesante estudios recientes han demostrado que estos péptidos presentas afinidades distintas por receptores específicos de la membrana plasmatica, denominados como receptores para CRF tipo 1 y 2 (receptores CRF 1 y CRF 2, respectivamente). Los receptores CRF 1 y CRF 2 existen en formas variantes por splicing y se expresan diferencialmente en cerebro y tejidos periféricos (3, 4). Ambos receptores pertenecen a la familia de los GPCRs y sus acciones se han identificado predominantemente en cerebro, corazón, miometrio, piel y sistema circulatorio. La activación de los receptores para el CRF y su familia de péptidos resulta en su asociación y activación con las proteínas G. Existen múltiples proteínas G que se pueden acoplar con los receptores para el CRF, sin embargo solo dos han sido bien caracterizadas, los cuales son la proteína GS, que permite la estimulación de la enzima adenilato ciclasa, la cual conlleva a la producción del segundo mensajero AMP cíclico y a la activación de la proteína cinasa A (PKA); y la proteína Gq, que permite la activación de la enzima fosfolipasa C (PLC) generando dos segundos mensajeros el inositol trifosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG). La elevación de calcio intracelular por acción del IP3 y del DAG activan a la proteína cinasa C; dicha activación es importante en diversas respuestas celulares (Fig1) (3). 2

3 Fig.1 Vías de señalización de receptores para CRF (Tomada de Dautzenberg y Hauger 2002) Recientemente se ha demostrado que la activación de los receptores para el CRF estimulan la vía de las MAPK, en particular a las ERKs1/2. La activación de ambas cinasas por el CRF y sus ligandos varía de acuerdo al tipo celular y al tipo de receptor que se active. La activación de las ERK1/2 por el CRF se ha asociado a la citoprotección, la diferenciación celular y posiblemente con la contractilidad del miometrio. Existe un número limitado de estudios sobre los mecanismos que llevan a la activación de los ERK1/2 por acción del CRF. En algunos tipos celulares, como en neuronas de hipocampo de rata que expresan receptores endógenos CRF 1, esta activación está mediada por la PKA y la PKC (5). En contraste en células de ovario de hamster chino (CHO) que expresan de manera estable tanto a receptores CRF 1 como CRF 2, la activación de las ERK1/2 es independiente de la PKA(6). Sin embargo, aún es poco claro los mecanismos activados por el CRF a través de sus receptores que llevan a la activación de la vía de las ERKs. Estudios iniciales sobre los mecanismos de activación de las ERK1/2 por los GPCRs daban evidencia de que los mecanismos de activación de estas cinasas no se podían explicar del todo en base al modelo clásico de señalización de los GPCRs. Sin 3

4 embargo, estudios recientes han evidenciado que los GPCRs emplean aparentemente distintos mecanismos de activación que varían en función del tipo celular y del receptor. En muchos casos la activación de las ERKs por los GPCRs se asemeja a la señalización empleada por los receptores con actividad de tirosina cinasa para factores de crecimiento, como el receptor para el factor de crecimiento epidérmico (EGF, epidermal growth factor) o el receptor para el factor derivado de plaquetas (PDGF, platelet-derived growth factor). Un hallazgo importante para descifrar parte del mecanismo que emplean los GPCRs para activar vías proliferativas, fue el descrubrimiento de que los GPCRs son capaces de transactivar a al menos dos receptores para factores de crecimiento: al receptor para el EGF y al receptor para el PDGF. En el caso de la activación de la vía de las ERK1/2 por acción de los receptores para el CRF no existen claras evidencias del mecanismo involucrado en dicha activación. En el presente trabajo presentamos evidencias de que en células COS-7 transfectadas con el receptor CRF1, el CRF lleva a la transactivación del receptor para el EGF y que a demás la activación de la PKC juega un papel crucial en la regulación de la actividad de las ERK. Objetivos El presente trabajo tiene como objetivo general, estudiar los mecanismos por los cuales el factor liberador de corticotropinas, a través de la activación del receptor CRF 1, regula la actividad de las ERK1/2 en células COS-7 Objetivos particulares Identificar la o las vías involucradas en la regulación de la actividad de la ERK1/2 por el CRF. Identificar el papel de la PKA y la PKC, importantes mediadores de las acciones del CRF, en la regulación de las ERK1/2. Estudiar el papel de la transactivación del receptor para el factor de crecimiento epidérmico como posible regulador de las acciones del CRF sobre la regulación de la actividad de las ERK1/2 4

5 Materiales y Métodos Cultivo Celular Para la realización del presente proyecto se utilizó como modelo celular a las células COS-7 (ATCC), fibroblastos provenientes de hígado de mono verde africano Cercopithecus aethiops. Las células COS-7 fueron cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% (v/v) de suero fetal de bovino, 100µg/ml de estreptomicina y 100IU/ml de penicilina (medio completo). Las células fueron mantenidas en una atmósfera húmeda con 5% de CO 2 a 37 C. Todos los reactivos empleados fueron obtenidos de la compañía Invitrogen/GIBCOBRL. Transfección Celular Las células COS-7 fueron transfectadas en cajas de 10 cm con una confluencia de entre 70 y 80 %, con el plásmido pcdna3.1/crf 1 R que contiene la secuencia del receptor CRF 1, empleando la técnica de liposomas catiónicos utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen/GIBCOBRL), siguiendo las especificaciones del fabricante. 24 horas después de la transfección las células fueron resembradas en cajas de 6 pozos y utilizadas para experimentos 24 horas después de la resiembra. Detección de PMAPK El día del experimento, a las células transfectadas se les retiró el medio completo y se mantuvieron en medio sin suero por 6 horas. Transcurrido este tiempo se realizaron estimulaciones con los agonistas indicados (CRF y EGF) por diferentes tiempos y concentraciones. Cuando se emplearon específicos inhibidores para diferentes cinasas, estos fueron incubados por 30 minutos a las concentraciones indicadas antes de los estímulos con los agonistas. Después de los estímulos el medio fue removido y las células se lavaron dos veces con PBS frío y lisadas con 100 µl de buffer Laemmli. Las muestras fueron sonicadas, y se calentaron a 95 C por 5 minuntos. Los sobrenadantes se cargaron en geles de poliacrilamida al 10% y realizó una electroforesis durante 1:30hrs. Al término de la corrida las proteínas se transfirieron a membranas PVDF por medio de una cámara de transferencia semiseca por 1:30 hrs, a 15 am. Las membranas fueron incubadas con los anticuerpos primarios durante toda la noche a 4 C y posteriormente se lavaron las membranas 3 veces con buffer TBST (Tris-base, NaCl y Tween20), antes de su incubación con anticuerpos secundarios conjugados con la peroxidasa de rabano por una hora a temperatura ambiente. Las membranas fueron 5

6 visualizadas con ECL (enhanced chemiluminescence reagent, Pierce) y cuantificadas con un densitómetro. Para la detección de las ERK1/2 activas y fosforiladas, se utilizó como anticuerpo primario phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) a una dilución 1:1000 (Cell Signaling Technology) y como anticuerpo secundario anti mouse IgG, a una dilucion 1:2000 (Amersham Bioscience). 6

7 Resultados Preeliminares y Discusión La activación del receptor CRF 1 expresado en células COS-7 con 100 nm de CRF induce una rápida activación de las ERK1/2, con efecto máximo a los 5 minutos y se mantiene hasta los 10 minutos para posteriormente disminuir después de 15 minutos de estimulación (Figura 1A). Este efecto fue también dependiente de la concentración de estimulación. Como se observa en la figura 2A CRF induce una clara activación de la ERK1/2 a partir de 1 nm, alcanzando la máxima estimulación a una concentración de 100nM (Figura 2A). Como un control positivo de la funcionalidad del sistema celular y del efecto de CRF, se evaluó también el efecto del EGF, para el cual las células COS-7 expresan de manera endógena receptores para EGF. Como se observa en las figuras 1B y 2B, respectivamente, el EGF induce una clara activación de las ERK1/2 en función del tiempo y de la concentración (Figuras 1B y 2B). En base a los resultados obtenidos en el presente estudio, CRF induce la activación de la vía de las MAP cinasas, lo cual tiene implicaciones relevantes debido a que la vía de las MAP cinasas esta involucrada con componentes de vías que controlan la embriogénesis, la diferenciación celular, la proliferación celular y la muerte celular. Existe un número limitado de estudios sobre los mecanismos involucrados en la activación de la vía de la MAP cinasas por acción del CRF. En función del tipo celular se ha identificado que la activación de las ERK1/2 es dependiente de la activación de la PKC y de la PKA, como es el caso de neuronas de hipocampo de rata (5). Sin embargo, también se ha demostrado que en células CHO transfectadas con receptores CRF 1 o CRF 2, el efecto sobre la activación de ERK1/2 no depende de PKA sino a través de una vía que depende de la PLC, Ca 2+ y PI3K (6). Por otro lado, la activación de ERK1/2 mediada por los GPCRs, frecuentemente involucra la generación de señales que llevan a la transactivación y fosforilación en tirosina del receptor para el EGF. En muchos tipos celulares los efectos promotores del crecimiento de los GPCRs son mediados principalmente por la transactivación del receptor para el EGF, con la subsiguiente activación de vías de señalización como la cascada de Ras/Raf/MEK/ERK/RSK y la de PI3K/Akt (7, 8). Para determinar que vía o vías están involucradas en la activación de las ERK1/2 por el CRF, se evaluó el efecto de diferentes inhibidores sobre las acciones del CRF. En la figura 3A se muestra que la fosforilación de las ERK1/2 mediada por CRF es completamente bloqueada por acción del AG1478, efecto que además depende de la concentración del inhibidor (Figura 4). El 7

8 AG1478 es un inhibidor específico de la actividad de tirosina cinasa del receptor para el EGF, sugiriendo que el efecto del CRF sobre la vía de la ERK1/2 es mediado por la transactivación del receptor para el EGF. De manera interesante también se encontró que el CRF induce la fosforilación en tirosina del receptor para EGF, un evento indispensable para su activación (datos no mostrados). Por otra parte, un inhibidor específico de la PKA, el H89, no tuvo efecto alguno sobre la fosforilación de ERK1/2 mediada por CRF, lo que sugiere que la activación de las ERK1/2 es independiente de la activación de la PKA. Además, se observó que un inhibidor específico de la PI3K, la wortmannina, disminuye de manera notable la fosforilación de las ERK1/2 (Figura 3A), sugiriendo que la activación de la vía de PI3K/Akt también se encuentra involucrada en la activación de las ERK1/2 por CRF. Esto reforzaría la hipótesis de que la activación del receptor CRF 1 por CRF lleva a la transactivación del receptor para el factor de crecimiento epidermal (EGF), dado que la activación de la vía de PI3K/Akt puede ser mediada también por la activación del receptor para el EGF. Sin embargo, un resultado revelador que nos indica que posiblemente la activación de la vía de PI3K/Akt, es independiente de la transactivación del receptor para el EGF, fue el hecho de que la activación de las ERK1/2 por efecto del EGF no es bloqueada por la wortmannina (Figura 3B), lo que sugiere la activación de PI3K por CRF es independiente de la transactivación del receptor de EGF. Actualmente estamos investigando los mecanismos de activación de PI3K por CRF. Otro dato muy interesante obtenido hasta el momento, nos indica que la inhibición de la PKC potencia el efecto del CRF sobre la activación de las ERK1/2 (Figura 3A). Es muy probable que la activación de esta cinasa regule de manera negativa la activación de la vía de la MAP cinasas. Actualmente se esta realizando una caracterización mas completa del efecto de la PKC en la regulación de la actividad de las ERK1/2. Los resultados que tenemos hasta el momento nos sugieren que las acciones del CRF a través de la activación del receptor CRF 1 sobre la activación de la vía de las MAP cinasas involucran la transactivación del receptor para el EGF y una vía independiente que depende de la activación de PI3K. Además, el sistema parece estar regulado por la PKC, cuya inhibición induce una potenciación de la señal de ERK1/2. Actualmente se continúa con la realización de este proyecto. 8

9 Figuras A) 2000 curso temporal de CRF MAPK phosphorylation (% of basal) Time (min) B) CURSO TEMPORAL DE EGF MAPK phosphorylation (% of control) Time (min) Figura 1. Detección de fosfo-erk1/2 en células COS-7 transfectadas con el receptor CRF 1. Cursos temporales CRF y EGF. Se utilizaron cultivos celulares en cajas de 6 pozos, previamente transfectadas con CRFR1, la cuales fueron estimulas por los siguientes tiempos: control, 2min, 5min, 10min, 15min, 30min; para el caso de CRF se utilizó a una concentración de [100nM] y en el caso de EGF a una concentración de [10ng/ml]. La gráfica representa el promedio de entre 3-5 experimentos ± el error estándar. Una imagen representativa de cada experimento se muestra a la derecha de cada gráfica. 9

10 A) DOSIS RESPUESTA DE CRF Fosforilación de MAPK (% del basal) CRF [nm] B) DOSIS RESPUESTA DE EGF Fosforilación de MAPK (% del control) EGF [ng/ml] Figura 2. Detección de fosfo-erk/1/2 en células COS-7 transfectadas con el receptor CRF 1. Se realizaron dosis respuesta, para ello se utilizaron cajas de seis pozos previamente transfectadas con CRFR 1 las cuales fueron estimuladas con las siguientes concentraciones para CRF 1nM, 1nM, 10nM, 100nM, 1000nM, por 5 min (A). En el caso de factores de crecimiento epidermal (EGF) se utilizaron 0.01ng/ml, 0.1ng/ml, 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml por 5 min (A). Cada gráfica representa el promedio de entre 3-5 experimentos ± el error estándar. Una imagen representativa de cada experimento se muestra a la derecha de cada gráfica. 10

11 A) INHIBIDORES ERK ½ 42/44 kda FOSFORILACION DE MAPK (% del control) C CRF 5 BIM H89 AG WORT INHIBIDORES+CRF100nM B) FOSFORILACION DE MAPK (% del control) C EGF BIM H89 AG1478WORT INHIBIDORES+EGF 10ng/ml ERK ½ 42/44 kda Figura 3. Detección de fosfo-erk1/2 utilizando inhibidores específicos de cinasas. A) se realizaron estimulaciones en cajas de seis pozos con células COS-7 transfectadas con el receptor CRF 1. Se realizaron preincubaciones de 30 min con los inhibidores BIM[1Um], H89 AG1478[100nM] y Wortmaninna [100nM]; transcurrido el tiempo se le adiciono a cinco pozos exceptuando el control CRF[100nM] durante 5 min. B) Se realizaron también estimulaciones en células Cos-7 transfectadas con CRFR1. Se realizaron preincubaciones de 30 min con los inhibidores BIM, H89 AG1478[100nM] y Wortmaninna [100nM]; transcurrido el tiempo se le adiciono a cinco pozos exceptuando el control EGF[10ng/ml] durante 5 min. Cada gráfica representa el promedio de entre 3-5 experimentos ± el error estándar. Una imagen representativa de cada experimento se muestra a la derecha de cada gráfica. 11

12 Dosis respuesta AG1478+CRF FOSFORILACION DE MAPK (% del control) C CRF 5 1nM 10nM 100nM 1uM AG1478+CRF100nM Fig 4. Detección de fosfo-erk1/2 utilizando el inhibidor AG1478. Se realizaron Dosis respuesta en células COS-7 transfectadas con CRFR1, utilizando un inhibidor especifico de la actividad de tirosina cinasa del receptor para el EGFR (AG1478), con una preestimulación de 30 min a diferentes concentraciones y posteriormente estimuladas con 100 nm de CRF durante 5 min. La gráfica representa el promedio de entre 3-5 experimentos ± el error estándar. Una imagen representativa de cada experimento se muestra a la derecha de cada gráfica. Bibliografía 1. Luttrell LM 2005 Composition and function of g protein-coupled receptor signalsomes controlling mitogen-activated protein kinase activity. J Mol Neurosci 26: Vale W, Spiess J, Rivier C, Rivier J 1981 Characterization of a 41-residue ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and betaendorphin. Science 213: Dautzenberg FM, Hauger RL 2002 The CRF peptide family and their receptors: yet more partners discovered. Trends Pharmacol Sci 23: Charmandari E, Tsigos C, Chrousos G 2005 Endocrinology of the stress response. Annu Rev Physiol 67: Pedersen WA, Wan R, Zhang P, Mattson MP 2002 Urocortin, but not urocortin II, protects cultured hippocampal neurons from oxidative and excitotoxic cell death via corticotropin-releasing hormone receptor type I. J Neurosci 22: Rossant CJ, Pinnock RD, Hughes J, Hall MD, McNulty S 1999 Corticotropinreleasing factor type 1 and type 2alpha receptors regulate phosphorylation of calcium/cyclic adenosine 3',5'-monophosphate response element-binding protein and activation of p42/p44 mitogen-activated protein kinase. Endocrinology 140: Shah BH, Catt KJ 2003 A central role of EGF receptor transactivation in angiotensin II -induced cardiac hypertrophy. Trends Pharmacol Sci 24:

13 8. Eguchi S, Dempsey PJ, Frank GD, Motley ED, Inagami T 2001 Activation of MAPKs by angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Metalloproteasedependent EGF receptor activation is required for activation of ERK and p38 MAPK but not for JNK. J Biol Chem 276: