Desarrollo de métodos bioinformáticos para la identificación de proteínas en mezclas complejas.

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1 UNIVERSIDAD DE LA HABANA FACULTAD DE BIOLOGÍA Desarrollo de métodos bioinformáticos para la identificación de proteínas en mezclas complejas. Tesis presentada en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Biológicas. Autor: Ing. Yasset Pérez Riverol Tutores: Dr. Aniel Sánchez Puentes Dr. Lázaro H. Betancourt Núñez Dr. Juan Antonio Vizcaíno CENTRO DE INGENIERÍA GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA 2013

2 ABREVIATURAS EMPLEADAS EN EL DOCUMENTO Por orden alfabético: 2D-PAGE Electroforesis bidimensional BSA Albúmina de suero bovino COFRADIC Fractional Diagonal Chromatography DF-PAGE Doble fraccionamiento en geles de poliacrilamida ESI Ionización por electronebulización FDR Porciento de identificaciones incorrectas entre todas las identificaciones juzgadas como correctas HCD Disociación de alta energía realizada en la trampa C HPLC Cromatografía líquida de alta resolución ICAT Marcador de afinidad con marcaje isotópico ICR Resonancia ciclotrónica de iones IEF Focalización isoeléctrica IT Analizador tipo trampa de iones (tridimensional) LC Cromatografía líquida LC-ESI-MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con ionización por electronebulización LC-MS/MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en sucesión LTQ Analizador tipo trampa de iones (en dos dimensiones) LTQ-FT-ICR Analizador híbrido formado por un analizador tipo trampa de iones (en dos dimensiones) uno de resonancia ciclotrónica de iones con transformada de Fourier LTQ-Orbitrap Analizador híbrido formado por un Orbitrap y uno tipo trampa de iones (en dos dimensiones) m/z Relación masa/carga MALDI Desorción e ionización por láser asistido por matriz MRM Monitoreo de Reacciones Múltiples MS Espectrometría de masas MS/MS Espectrometría de masas en tándem MudPIT Tecnología multidimensional para la identificación de proteínas OGE Focalización isoeléctrica fuera de gel PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida pi Punto isoeléctrico PITC Isotiocianato de fenilo ppm Partes por millón QQQ Analizador híbrido formado por tres analizadores tipo cuadrupolo QTOF Analizador híbrido formado por un analizador tipo cuadrupolo y uno de tiempo de vuelo RP Cromatografía de fase reversa RP-HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia por fase reversa Rt Tiempo de retención SCX Cromatografía de intercambio catiónico fuerte SDS Dodecil sulfato de sodio SDS-FREE- PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida en ausencia de dodecil sulfato de sodio SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio TOF Analizador por tiempo de vuelo

3 Síntesis El presente trabajo describe el desarrollo y aplicación de tres nuevos métodos bioinformáticos para la identificación de proteínas en mezclas complejas a partir del análisis in silico de bases de datos de proteínas. El primero de los métodos permitió el diseño y creación de bases de datos centradas en péptidos en sustitución de las bases de datos de proteínas. Los resultados del proceso de identificación de péptidos y proteínas de dos líneas celulares humanas (Huh7 carcinoma de hígado), (H125 cáncer de pulmón) demostraron un aumento del número de proteínas identificadas comparado con los métodos de búsqueda en bases de datos de proteínas. El segundo método permite la identificación de péptidos modificados con isotiocianato de fenilo, con la asignación del residuo N- terminal y el empleo también de bases de datos centradas en péptidos. El desarrollo de dos programas bioinformáticos (SIM y HI-bone) de identificación posibilita la aplicación del método en experimentos de proteómica de alto flujo. La cantidad de espectros y proteínas identificadas son superiores a los alcanzados con los programas informáticos de identificación más utilizados actualmente por la comunidad científica. A partir de los resultados anteriores se exploraron las bases teóricas de un tercer método de identificación de péptidos y proteínas con el empleo de diferentes propiedades químico-físicas. El análisis in silico de seis proteomas y de una muestra compleja de péptidos de Drosophila melanogaster demuestra que la combinación del punto isoeléctrico, el tiempo de retención, la masa de los péptidos y el aminoácido N- terminal puede ser empleada como criterio de identificación. Los resultados indican que el número de identificaciones es significativamente mayor cuando el método se combina con bases de datos centradas en péptidos.

4 Índice Índice Introducción...1 I. Revisión bibliográfica...7 I.1 Introducción a la proteómica...7 I.2 Métodos electroforéticos...7 I.3 Métodos Cromatográficos y de aislamiento selectivo de péptidos...8 I.3.1 Péptidos con cisteína... 9 I.3.2 Péptidos con metionina... 9 I.3.3 Péptidos delimitados por residuos de Arginina y que no presentan Lisina I.3.4 SCAPE: Péptidos no cargados I.3.5 Péptidos multicargados I.4 Espectrometría de masas I.4.1 Espectro de Masas I.4.2 Incremento de la eficiencia de fragmentación a través de modificaciones químicas I.5 Proteómica computacional y bioinformática I.5.1 Análisis in silico de proteomas I.5.2 Diseño de bases de datos centradas en péptidos para estudios de proteómica I.5.3 Estimación de propiedades químico-físicas de péptidos y proteínas I.5.4 Identificación de proteínas basada en la interpretación de espectros de masas I.5.5 Validación de la identificación de péptidos y proteínas I.5.6 Validación de péptidos identificados empleando propiedades químico-físicas (punto isoeléctrico y tiempo de retención) I.5.7 Estandarización de los datos de proteómica II. Artículos Originales Artículo I.Charge state-selective separation of peptides by reversible modification of amino groups and strong cation-exchange chromatography: Evaluation in proteomic studies using peptide-centric database searches Artículo II.Peptide fractionation by acid ph SDS-FREE electrophoresis Artículo III.Evaluation of phenylthiocarbamoyl-derivatized peptides by electrospray ionization mass spectrometry: selective isolation and analysis of modified multiply charged peptides for liquid chromatography-tandem mass spectrometry experiments Artículo IV.Hi-bone: a scoring system for identifying phenylthiocarbamoyl-derivatized peptides based on precursor mass and high intensity b one (b 1 ) fragment ions Artículo V.Effectively addressing complex proteomic search spaces Artículo VI.Pride inspector: a tool to visualize and validate ms proteomics data Artículo VII. In silico analysis of accurate proteomics, complemented by selective isolation of peptides Artículo VIII. Isoelectric point optimization using peptide descriptors and support vector machines. 84 III. Discusión General III.1 Diseño de bases de datos centradas en péptidos para la identificación de proteínas en mezclas complejas III.1.1 Optimización de método de aislamiento selectivo de péptidos y aplicación de bases de datos centradas en péptidos. Prueba de concepto en una línea celular humana de carcinoma de hígado III.1.2 Optimización del método de electroforesis en geles de poliacrilamida en ausencia de dodecil sulfato de sodio y aplicación de bases de datos centradas en péptidos. Prueba de concepto en una línea celular humana de cáncer de pulmón... 94

5 Índice III.2 Identificación de proteínas con el empleo del ion fragmento b 1 de los péptidos multicargados aislados selectivamente y con modificados isotiocianato de fenilo. Prueba de concepto en mezcla compleja de proteínas de Escherichia coli III.3 Identificación de proteínas empleando el aminoácido N- terminal e iones fragmentos en el espectro de masas de los péptidos modificados con isotiocianato de fenilo. Prueba de concepto en mezcla compleja de proteínas de Escherichia coli III.3.1 Identificación empleando patrones de fragmentación y etiquetas de secuencia. Herramienta Bioinformática: HI-bone III.3.2 Identificación empleando iones fragmentos teóricos. Herramienta Bioinformática: SIM III.4 Identificación de proteínas empleando métodos de aislamiento selectivo de péptidos en combinación con propiedades químico-físicas de los péptidos. Prueba de concepto en experimento de proteómica sobre mezcla compleja de proteínas de Drosophila melanogaster III.5 Estimación de punto isoeléctrico de péptidos empleando máquinas de soporte vectorial y propiedades experimentales de aminoácidos IV. Conclusiones V. Recomendaciones VI. Referencias Bibliográficas VII. Bibliografía del Autor VII.1 Publicaciones del autor relacionadas con el tema de tesis VII.2 Presentaciones en eventos científicos relacionadas con el tema de tesis VIII.3 Otras publicaciones del autor

6 Introducción Introducción El conjunto de proteínas expresadas por una célula o tejido en un estado fisiológico determinado es conocido como proteoma (Wilkins et al., 1996). La proteómica tiene como objetivo la caracterización y el análisis del proteoma en cuanto a sus interacciones, sus modificaciones postraduccionales y abundancia relativa. Al igual que la genómica, es una de las nuevas tecnologías que más desarrollo ha alcanzado en la rama de las investigaciones biomédicas (Nilsson et al., 2010). La caracterización del proteoma y sus componentes se realiza mediante la integración de cuatro herramientas fundamentales: 1) tecnologías analíticas para la separación de péptidos y proteínas, 2) espectrometría de masas, 3) programas computacionales de identificación y 4) herramientas de visualización y evaluación de la calidad del experimento. La estrategia más eficiente para el análisis de mezclas complejas de proteínas está basada en la hidrólisis enzimática de la mezcla compleja de proteínas, la separación y análisis de mezcla de péptidos resultante mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y espectrometría de masas en sucesión (LC-MS/MS) (Wolters et al., 2001, Link et al., 1999). Los espectros generados para cada péptido (espectro MS/MS) son identificados con diferentes estrategias y algoritmos de identificación. El método más conocido es la identificación de proteínas con la combinación de programas bioinformáticos y bases de datos de secuencias de proteínas (Edwards, 2011). Los programas de identificación en bases de datos de secuencias buscan la mejor correlación entre los espectros experimentales y los MS/MS teóricos generados a partir de las secuencias de la base de datos seleccionada. Las bases de datos de secuencias de proteínas son conjuntos de secuencias de aminoácidos anotadas en ficheros de texto, que han sido obtenidas por algoritmos computacionales o que han sido secuenciadas a través de técnicas analíticas (Apweiler et al., 2004). Estas bases de datos son el componente principal en el proceso de identificación debido a que contienen el péptido y proteína a identificar. El análisis in silico de las bases de datos de secuencias puede definir el diseño experimental de las metodologías y técnicas analíticas para el estudio de proteomas. En muchos de los casos han contribuido de manera decisiva en la creación de métodos analíticos para solucionar problemáticas asociadas a la complejidad de la mezcla de péptidos analizada y la limitada capacidad de análisis de los sistemas cromatográficos y los espectrómetros de masas (Cagney et al., 2003). El estudio in silico de bases de datos permitió dar los elementos necesarios para el establecimiento de los métodos de aislamiento selectivo de péptidos que simplificaron la mezcla 1

7 Introducción de péptidos generada antes de su análisis por LC-MS/MS. Así, es posible la selección de un pequeño grupo de péptidos (3-5 péptidos/proteína) que representan la mayor cantidad posible de proteínas presentes en la mezcla inicial (Domon and Aebersold, 2006). Originalmente estos procedimientos se basaron en la modificación química selectiva de la cadena lateral de aminoácidos poco abundantes y el posterior aislamiento de los péptidos que los contienen, mediante diferentes principios cromatográficos. Los métodos más establecidos emplean el aislamiento selectivo de péptidos que contienen Cisteína (Gygi et al., 1999), Metionina (Gevaert et al., 2002), con Serina o Treonina en el extremo N-terminal (Chelius and Shaler, 2003), y con Arginina en el extremo C-terminal (Foettinger et al., 2005). En el departamento de Proteómica del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) se han desarrollado varias metodologías de aislamiento selectivo de péptidos, basadas en las diferencias producidas en la composición de carga de los péptidos trípticos después de ser modificados los grupos amino y la posterior separación por cromatografía de intercambio catiónico (Betancourt et al., 2005, Sanchez et al., 2006a). Como resultado, la mezcla compleja puede ser fácilmente clasificada en dos grupos de péptidos: los no cargados y los cargados positivamente. Por otra parte, los métodos electroforéticos como la electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) o la focalización isoeléctrica fuera de gel (OGE) (Ramos et al., 2008); también permiten la separación de las mezclas de péptidos en subgrupos más simples y han sido aplicados en experimentos de proteómica. Al igual que los métodos de aislamiento selectivo de péptidos la mezcla de péptidos es dividida en subgrupos más simples lo que permite el análisis de las proteínas menos abundantes. Como resultado experimental se obtiene determinada información de las propiedades electrostáticas de los péptidos identificados (punto isoeléctrico y relación masa/carga). Sin embargo, la utilización de esta información no ha sido eficientemente utilizada para la reducción del espacio de búsqueda de las bases de datos, lo cual pudiera incrementar considerablemente el número de péptidos y proteínas a identificar con los programas de búsqueda. Adicionalmente, las propiedades químico físicas de los péptidos y proteínas identificados en los métodos de fraccionamiento y que pueden ser estimadas con la información de las bases de datos (punto isoeléctrico, relación masa/carga, tiempo de retención, patrón de secuencia del péptido) no se emplean como información complementaria en las estrategias actuales de identificación. Otro de los problemas que enfrenta la proteómica es el bajo porcentaje de espectros MS/MS (obtenidos de una corrida cromatográfica), que pueden ser correctamente asignados. Una de las posibles razones es que durante el análisis por LC-MS/MS muchos de los péptidos analizados no se fragmentan eficientemente (Michalski et al., 2011). Los espectros MS/MS de este tipo de 2

8 Introducción péptidos por lo general contienen muy pocas señales, por lo que disminuye la eficiencia de los algoritmos actuales de identificación que dependen de la calidad del espectro MS/MS. La fragmentación en fase gaseosa mediante disociación inducida por colisiones de péptidos modificados con isotiocianato de fenilo (PITC) permite observar el ión fragmento b1 en un espectro MS/MS con independencia de la secuencia del péptido. Este fragmento contiene el primer residuo de aminoácido (aminoácido N-terminal) y puede ser utilizado como alternativa para aumentar la eficiencia en el proceso de fragmentación e identificación de péptidos en las bases de datos (Summerfield et al., 1997). Sin embargo, la aplicación de esta estrategia como metodología de identificación en experimentos de proteómica de alto flujo requiere del desarrollo de herramientas bioinformáticas especializadas que permitan identificar y visualizar eficientemente los espectros de masas de estos péptidos modificados en bases de datos durante un experimento de proteómica de alto flujo. El presente está focalizado en el desarrollo de métodos y herramientas bioinformáticas para la identificación de proteínas en mezclas complejas por espectrometría de masas. Bajo esta línea de investigación se formuló la siguiente hipótesis: Es posible incrementar el número de identificaciones de péptidos modificados o no con isotiocianato de fenilo mediante la creación de bases de datos centradas en péptidos, el desarrollo de herramientas bioinformáticas y el uso de propiedades químico-físicas como el punto isoeléctrico y el tiempo de retención. A partir de esta hipótesis de trabajo se trazó el siguiente objetivo general: Desarrollar nuevos métodos bioinformáticos para incrementar la identificación de péptidos y proteínas en experimentos de proteómica de alto flujo. Para cumplimentar el objetivo general se diseñaron los siguientes objetivos específicos: I. Desarrollar herramientas bioinformáticas para el estudio in silico de proteomas, el diseño de bases de datos centradas en péptidos y el análisis de los resultados de experimentos de proteómica de alto flujo. Tareas para darle cumplimiento a este objetivo: 3

9 Introducción Desarrollar una herramienta bioinformática para el estudio in silico de bases de datos de secuencias y la creación de bases de datos centradas en péptidos. Desarrollar una herramienta bioinformática para la visualización y análisis de los resultados de los experimentos de proteómica. II. Diseñar y aplicar bases de datos centradas en péptidos a métodos de aislamiento selectivo de separación por carga y de fraccionamiento de péptidos SDS-Free PAGE. Tareas para darle cumplimiento a este objetivo: Diseñar bases de datos centradas en péptidos a partir de patrones de secuencias observados en los subgrupos de péptidos aislados selectivamente y de la distribución teórica del punto isoeléctrico de péptidos fraccionados mediante SDS-Free PAGE. Comparar los resultados del empleo de bases de datos centradas en péptidos con bases de datos de proteínas para la identificación de un extracto de proteínas humanas solubles de la línea celular Huh7 de carcinoma de hígado, analizado por el método de aislamiento selectivo de péptidos y de un extracto de proteínas humanas de la línea celular H125 de cáncer de pulmón, analizado por el método SDS-Free PAGE. III. Desarrollar un método de identificación de péptidos modificados con isotiocianato de fenilo basados fundamentalmente en la asignación del residuo N- terminal en el espectro MS/MS. Tareas para darle cumplimiento a este objetivo: Desarrollar un método de identificación de péptidos modificados con isotiocianato de fenilo en experimentos de proteómica de alto flujo. Evaluar el método propuesto en una mezcla compleja de proteínas de Escherichia coli. Desarrollar algoritmos de identificación en bases de datos de péptidos modificados con isotiocianato de fenilo a partir del método propuesto que empleen: Etiquetas de secuencia y patrones de fragmentación. La asignación de todos los fragmentos teóricos del espectro de masas. Comparar los algoritmos y herramientas bioinformáticas desarrolladas con las herramientas bioinformáticas de identificación Mascot, SEQUEST; comúnmente 4

10 Introducción utilizadas en experimentos de proteómica en una mezcla compleja de proteínas de E. coli. IV. Diseñar un método de identificación de péptidos modificados con isotiocianato de fenilo mediante la asignación del residuo N- terminal, del punto isoeléctrico, el tiempo de retención y la masa molecular en combinación con bases de datos centradas en péptidos. Tareas para darle cumplimiento a este objetivo: Analizar proteomas anotados en bases de datos con el empleo del punto isoeléctrico, tiempo de retención, el aminoácido en el extremo N- terminal, la masa de los péptidos y bases de datos centradas en péptidos para la identificación de péptidos modificados con isotiocianato de fenilo en experimentos de proteómica de alto flujo. Desarrollar de una función de estimación de punto isoeléctrico para péptidos, basada en máquinas de soporte vectorial y propiedades experimentales de los aminoácidos. El análisis de los resultados evidencia varios aportes al conocimiento. En primer lugar, el empleo integrado de los tres métodos de aislamiento selectivo de péptidos (RH0, RH1, RH2) y el diseño de bases de datos centradas en péptidos sobre un experimento de identificación de proteínas humanas solubles de la línea celular Huh7 de carcinoma de hígado demostraron por primera vez la posibilidad de emplear los métodos de aislamiento selectivo en conjunto e incrementar el número de proteínas identificadas con respecto a las metodologías actuales de identificación en bases de datos. El desarrollo de un nuevo método de identificación basado en la asignación de ion fragmento b 1, la masa de los péptidos y los métodos de aislamiento selectivo demostraron la posibilidad de identificar más proteínas que los algoritmos y programas que existen en la actualidad. El análisis in silico de seis proteomas diferentes evidenció la posibilidad de identificar péptidos modificados con isotiocianato de fenilo utilizando el punto isoeléctrico, el tiempo de retención, el aminoácido N- terminal y los métodos de aislamiento selectivo de péptidos. De igual forma se desarrolló e implementó de un nuevo método de estimación del punto isoeléctrico de péptidos y proteínas basado en máquinas de soporte vectorial y descriptores moleculares mucho más preciso que los métodos actuales. Estos hallazgos constituyen novedades científicas de esta tesis. 5

11 Introducción De igual forma, la función de punto isoeléctrico basada en máquinas de soporte vectorial y descriptores moleculares de los péptidos demostró una mejor precisión en la estimación de esta propiedad comparada con todos los algoritmos que existes en el estado del conocimiento. La importancia práctica del trabajo radica en que los métodos y herramientas propuestos son de fácil implementación en cualquier laboratorio dedicado a la proteómica o a la química de proteínas. Los algoritmos propuestos para la identificación de proteínas y el cálculo del punto isoeléctrico superan a todos los de su tipo existentes en la actualidad y se encuentran implementados en herramientas de código libre y no comerciales disponibles a los laboratorios de proteómica. Estos métodos se aplicaron exitosamente en el estudio de proteomas de organismos simples (E. coli) y complejos (Homo sapiens). Las librerías de programas y herramientas bioinformáticas generadas en este trabajo han sido incluidas dentro de la plataforma y repositorio de datos de proteómica PRIDE que almacena datos públicos de la comunidad de proteómica internacional. Este trabajo de tesis presentado en la modalidad de artículos consta de: Introducción (7 páginas), Revisión Bibliográfica (22 páginas), Artículos (1 página), Discusión General (15 páginas), Conclusiones (1 página), Recomendaciones (1 página), Referencias (23 páginas). Los resultados presentados en esta tesis han sido discutidos en varios Congresos Nacionales e Internacionales: 7th HUPO World Congress 2008, 8th Siena Meeting from genome to proteome: Integration and proteome completion, Biotecnología Habana 2009, Biotecnología Habana Además, forman parte de ocho publicaciones científicas, en las revistas internacionales de alto impacto Nature Biotechnology (1 artículo), Bioinformatics (1 artículo), Journal of Proteomics (3 artículos), Analytical Chemistry (2 artículos) y Electrophoresis (1 artículo). La mayor parte del trabajo experimental y bioinformático se realizó en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB) de La Habana. El desarrollo de las librerías para la visualización y lectura de formatos estándares de proteómica se desarrolló en el Instituto Europeo de Bioinformática en colaboración con el grupo PRIDE. 6

12 Revisión Bibliográfica I. Revisión bibliográfica I.1 Introducción a la proteómica El proteoma describe el estado celular o las condiciones externas de la célula. Su análisis puede ser visto como un amplio ensayo geonómico para diferenciar y estudiar estados celulares y determinar el mecanismo molecular que los controla (Haynes et al., 1998). La proteómica constituye el próximo paso, en el esfuerzo por descubrir información acerca de cómo los genes están relacionados con una función biológica o un estado patológico. Dado que la mayoría de los blancos farmacológicos son proteínas, existe un gran interés en las potencialidades de la proteómica en la identificación de nuevos blancos para la intervención y tratamiento de enfermedades (Miao et al., 2012). Proteínas específicas pueden ser identificadas como biomarcadores precisos y sensibles para estadios tempranos de enfermedades, lo que puede asegurar su utilidad en el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades (Schirle et al., 2012). Actualmente, los principales retos de la proteómica lo constituyen: (i) la identificación de las proteínas presentes en mezclas complejas, (ii) la comparación de los perfiles de expresión de las proteínas identificadas, (iii) el análisis de las interacciones de las proteínas. La identificación y validación de las proteínas presentes en una mezcla compleja es uno de los campos de investigación más dinámico y en desarrollo dentro de la proteómica (Angel et al., 2012). Las etapas fundamentales para la identificación de proteínas son: (i) la preparación de la muestra, (ii) la separación de proteínas y péptidos, (iii) su identificación y (iv) el análisis y validación de los resultados obtenidos. La preparación de la muestra es un paso crítico, que define las posibilidades de éxito en las etapas posteriores del experimento (Castellanos-Serra and Paz-Lago, 2002). La mezcla de proteínas y péptidos se pueden separar mediante el uso de técnicas multidimensionales, entre las que se destacan las electroforéticas y las cromatográficas. La identificación de las proteínas se lleva a cabo mediante el empleo de la espectrometría de masas y el uso de herramientas bioinformáticas que posibilitan la identificación de la secuencia de las proteínas bajo estudio. I.2 Métodos electroforéticos La electroforesis bidimensional (2-DE) fue desarrollada independientemente por P. H. O Farrel (O'Farrell, 1975) y J. Klose (Klose, 1975) en el año La 2-DE permite el análisis de muestras proteicas complejas debido a su capacidad de separar miles de proteínas en un solo gel. La metodología se fundamenta con la combinación ortogonal de dos propiedades físico- 7

13 Revisión Bibliográfica químicas: el punto isoeléctrico (pi) y la talla molecular. Cada mancha resultante se corresponde, generalmente, con una proteína de la muestra biológica (O'Farrell, 1975). Sin embargo, proteínas con puntos isoeléctricos y pesos moleculares extremos, y las proteínas hidrofóbicas, están poco representadas en los geles bidimensionales. Se estima que el 30% de las proteínas totales de una célula son de membrana y solamente un 1% de las proteínas integrales de membranas han sido identificadas en geles bidimensionales (Santoni et al., 2000). Por este motivo, generalmente las proteínas hidrofóbicas son separadas mediante electroforesis de geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) (Ornstein, 1964, Laemmli, 1970). En el procedimiento, la mezcla de proteínas se fracciona por SDS-PAGE, el carril se corta en fragmentos y cada fracción de proteínas se digiere en gel con tripsina. La mezcla de péptidos se eluye del gel y se analiza por cromatografía líquida en fase reversa acoplada a espectrometría de masas (RP-LC-MS/MS). El empleo de SDS-PAGE ha demostrado las potencialidades de este método electroforético para la separación y posterior identificación de proteínas de membrana (Simpson et al., 2000). La focalización isoeléctrica fuera del gel (OGE) es un método de reciente aplicación en la proteómica (Ros et al., 2002). Los péptidos focalizan en la solución contenida en la parte superior de las tiras de ph inmovilizado. Una vez concluida la corrida, las fracciones se colectan en cada una de las cámaras en solución y se analizan por LC-MS. Este enfoque permite el fraccionamiento y la rápida identificación de los componentes de muestras complejas. Los péptidos identificados son caracterizados con su punto isoeléctrico experimental y esta propiedad puede ser empleada como criterio de validación de la identificación (Heller et al., 2005, Horth et al., 2006, Reiter et al., 2009, Krijgsveld et al., 2006). I.3 Métodos Cromatográficos y de aislamiento selectivo de péptidos Durante la última década, la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) se ha convertido en una herramienta indispensable para la proteómica (Nilsson et al., 2010). Sin embargo, separaciones de una sola dimensión carecen de suficiente resolución para resolver muestras biológicas complejas (Guiochon, 2006). Por esta razón se requiere la combinación de métodos de separación ortogonales con el fin de proporcionar un análisis exhaustivo de los componentes de la muestra (Nagaraj et al., 2011). La separación multidimensional de proteínas o péptidos de una mezcla compleja tiene en cuenta dos o más propiedades físico-químicas, las más comúnmente utilizadas son la carga, hidrofobicidad e interacciones bioespecíficas. Este enfoque ayuda a la identificación de especies poco abundantes a partir de la obtención de mezclas más simples (Wu and MacCoss, 2002). 8

14 Revisión Bibliográfica En 1999 se publicó una metodología conocida en sus inicios como DALPC (del inglés Direct Analysis of Large Protein Complexes) (Link et al., 1999), que combina la cromatografía de intercambio catiónico fuerte (SCX) y la fase reversa (RP) para la separación de péptidos. Optimizaciones posteriores de este sistema resultaron en la forma actual de la metodología MudPIT (del inglés Multidimensional Protein Identification Technology) (Washburn et al., 2001). A pesar de la excelente resolución de las técnicas cromatográficas de RP y SCX para la separación de péptidos, la complejidad de la muestra excede las capacidades de estos sistemas. Adicionalmente, el número de péptidos que se detectan en un análisis por LC-MS/MS supera la capacidad de fragmentación de los espectrómetros de masas actuales. Una alternativa de simplificación de la muestra surge con la aplicación del concepto de aislamiento selectivo de pocos péptidos por proteína (3-5 péptidos/proteína) (Gevaert et al., 2003). La mayoría de estos procedimientos se basan en la modificación química selectiva de la cadena lateral de algunos aminoácidos y el posterior aislamiento de los péptidos modificados mediante métodos cromatográficos (Domon and Aebersold, 2006). I.3.1 Péptidos con cisteína En la metodología ICAT (del inglés Isotope-Coded Affinity Tags) se procede a la derivatización química de los péptidos con residuos de cisteína en su secuencia. Según el diseño original este tipo de reactivo consta de tres elementos funcionales: un grupo reactivo específico, un brazo espaciador isotópicamente codificado y un marcador de afinidad (biotina). La cromatografía de afinidad biotina-avidina se utiliza para el aislamiento de los péptidos modificados. Esta metodología permite la simplificación de la mezcla a 3-4 péptidos por proteína y cubre entre el 80-90% de los proteomas (Gygi et al., 1999). I.3.2 Péptidos con metionina El método conocido como COFRADIC (del inglés COmbined FRActional DIagonal Chromatography) consiste en dos corridas RP-HPLC de péptidos con una reacción intermedia de modificación química o enzimática. Los péptidos no modificados eluyen en la misma fracción en las dos corridas cromatográficas, mientras que los péptidos derivatizados cambian su tiempo de retención. Este principio puede aplicarse en el aislamiento selectivo de péptidos que contienen Metionina o Cisteína en sus secuencias o péptidos N-terminal de proteínas. De manera similar, se 9

15 Revisión Bibliográfica pueden seleccionar péptidos con modificaciones pos-traduccionales como los fosfopéptidos o péptidos N-glicosilados (Gevaert et al., 2002, Van Damme et al., 2009b, Gevaert et al., 2003). I.3.3 Péptidos delimitados por residuos de Arginina y que no presentan Lisina Sánchez y colaboradores desarrollaron un método para el aislamiento de péptidos delimitados por residuos de Arginina y que no contienen Lisina interna (RRnK) (Sanchez et al., 2006b). En este método las proteínas son digeridas con la enzima lisil endopeptidasa, proteasa que hidroliza específicamente por el extremo C de los residuos de lisina. Los grupos ε- amino de las cadenas laterales de las lisinas y los α-amino de los péptidos generados por la digestión son biotinilados y luego digeridos con tripsina, obteniéndose nuevos péptidos con grupos α- amino libres, algunos de ellos con la presencia de Arginina en el extremo C. Finalmente, se realiza una cromatografía de afinidad utilizando estreptavidina inmovilizada. Todos los péptidos que contienen al menos un grupo amino biotinilado son retenidos en la columna de afinidad. Los péptidos no biotinilados no se retienen y son colectados para su análisis por LC-MS/MS. Esta metodología permite seleccionar (como promedio) de 4 a 5 péptidos por proteína, representativos del 85% al 87% del proteoma. I.3.4 SCAPE: Péptidos no cargados Betancourt y colaboradores propusieron la metodología SCAPE (Betancourt et al., 2005) que se basa en las diferencias producidas en la carga de los péptidos trípticos después de ser modificados los grupos amino. Como resultado, la mezcla compleja puede ser fácilmente clasificada en dos grupos de péptidos: los no cargados y los cargados positivamente. Estos últimos se protonan por la presencia de residuos de Histidina y Arginina en su secuencia. La mezcla de péptidos se aplica a una columna de SCX, donde los péptidos con carga positiva son capturados mientras que las especies no cargadas no se retienen. Los péptidos no retenidos no contienen residuos de Histidina ni Arginina y se denominan péptidos RH0 o (R+H=0) (Betancourt et al., 2005). I.3.5 Péptidos multicargados Sánchez y colaboradores propusieron un método para el aislamiento selectivo de péptidos conocido como RH2. El método desarrollado se basa en la modificación de los grupos aminos primarios de los péptidos (α-y ε-nh2) para restringir la presencia de carga positiva. En presencia de medio ácido, sólo se cargan positivamente los péptidos que contienen Arginina e Histidina, lo 10

16 Revisión Bibliográfica que permite una separación por cromatografía de intercambio catiónico de las especies neutras (R + H=0) y cargadas (R + H > 1) (Sanchez et al., 2006a). I.4 Espectrometría de masas La Espectrometría de Masas es la técnica analítica que permite la generación de iones en fase gaseosa además de su separación y detección. Los espectrómetros de masas se pueden usar para determinar la masa molecular de una proteína o un péptido, así como para determinar su estructura primaria (Aebersold and Mann, 2003). Para ello es necesario seleccionar un ion específico y someterlo a un proceso de fragmentación, conocido como espectrometría de masas en sucesión (MS/MS) (Witze et al., 2007). En un primer espectro se obtiene la masa del compuesto que se ha de analizar, y en un segundo espectro, las masas de los fragmentos obtenidos. Las partes básicas de un espectrómetro de masas son: el sistema de introducción de muestras, la fuente de ionización, el analizador de masas y el detector de iones (de Hoffmann, 2007). En la fuente de ionización, las muestras son llevadas a estado gaseoso y son ionizadas mediante expulsión de electrones, protonación o deprotonación. Los iones formados, pueden ser electrostáticamente dirigidos al analizador, separados acorde con su relación masa/carga (m/z) y finalmente detectados, registrándose el número de iones para cada valor de m/z. El resultado de la ionización, separación de iones y detección es lo que se conoce como espectro de masas, de cuyo estudio se puede extraer información acerca de la masa molecular y de la estructura de los compuestos (de Hoffmann, 2007). La Ionización por Electronebulización (ESI) (Fenn et al., 1989) y la Ionización y Desorción por Láser Asistido por Matriz (MALDI) (Karas and Hillenkamp, 1988) son los dos métodos de ionización más comúnmente usados en el análisis de proteínas y péptidos por espectrometría de masas. Por su parte, el analizador (separador de iones de acuerdo a su m/z) determina parámetros claves como son la sensibilidad, la resolución, la exactitud de las masas y la habilidad para generar información estructural de los péptidos. Los analizadores más comúnmente usados son: los de trampa de iones (IT) (Cooks et al., 1983), los de tiempo de vuelo (TOF) (Vestal and Campbell, 2005), los analizadores tipo cuadrupolo (March, 1997), los de resonancia cincrotrónica de iones con transformada de Fourier (FT-ICR) (Marshall et al., 1998) y los llamados Orbitrap (Hu et al., 2005). Las combinaciones híbridas de estos analizadores son comunes, destacándose los triple cuadrupolos y cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) (Chernushevich et al., 2001). 11

17 Revisión Bibliográfica Los analizadores Orbitrap son los primeros introducidos en el mercado en los últimos 30 años, basado en un nuevo principio físico, la separación de iones en un campo eléctrico oscilante (Tabla 1). Este instrumento posee valores de resolución y exactitud comparables a los FT-ICR y generalmente se comercializa como un espectrómetro híbrido en unión a una trampa lineal (LTQ-Orbitrap). Tabla 1: Diferentes analizadores de masas y relación de los valores resolución y precisión asociados a estos. Trampa TOF FT- Cuadrupolo TOF Orbitrap de iones reflectron ICR Resolución Exactitud 100 ppm 100 ppm 200 ppm 10 ppm < 5 ppm < 5 ppm Los analizadores de masas poseen dos características fundamentales que determinan su eficiencia, ellas son: la resolución y la exactitud. Estas dos propiedades son parámetros claves para seleccionar un espectrómetro de masas y en la definición de los parámetros de la identificación (Mann and Kelleher, 2008, Zubarev and Mann, 2007). La resolución y el poder de resolución del analizador son medidas de la capacidad de distinguir dos picos con valores de m/z muy cercanos (de Hoffmann, 2007). Es deseable un alto poder de resolución para separar iones fragmentos con m/z muy cercanos en el espectro MS/MS. La masa teórica de cada molécula es calculada con la sumatoria de las masas monoisotópicas de la composición elemental de la molécula. El valor de masa experimental consiste en la medición de la masa de cada ion o molécula. La exactitud de masa es una medida de cuan cercano está el valor de masa experimental (obtenido con el instrumento) del teórico (de Hoffmann, 2007). Se define como la relación entre el error de m/z medio y la m/z real, usualmente expresada en partes por millón (ppm 10-6 ). La exactitud está limitada por el tipo de analizador del espectrómetro empleado, y depende del método de calibración y procesamiento de los datos para obtener los valores de m/z. La tabla 1 muestra la exactitud para los diferentes analizadores, donde el valor del Orbitrap (> 5 ppm) es la que ofrece mejores resultados. I.4.1 Espectro de Masas Una de las potencialidades de la espectrometría de masas es que permite determinar la secuencia de péptidos y proteínas. Además posibilita la detección y ubicación de las modificaciones postraduccionales. Para realizar estos análisis es necesario someter a la molécula ionizada a un 12

18 Revisión Bibliográfica proceso de disociación, y de este modo obtener un espectro de masas de los iones fragmentos (MS/MS). Aunque existe una amplia variedad de métodos de fragmentación, el conocido por Disociación Inducida por Colisiones (DIC) (Hayes and Gross, 1990), continúa siendo el más utilizado para analizar este tipo de moléculas. De esta manera en los espectros MS/MS obtenidos con trampas iónicas y QTOFs, predominan las series de iones y n y b n, que se producen por la ruptura del enlace peptídico (Roepstorff and Fohlman, 1984). x 3 y 3 z 3 x 2 y 2 z 2 x 1 y 1 z 1 R 1 R 3 NH 2 CH CO NH CH CO NH CH CO NH CH COOH R 2 R 4 a 1 b 1 c 1 a 2 b 2 c 2 a 3 b 3 c 3 Iones N-terminal Iones C-terminal a 2 : R 1 NH 2 CH CO NH CH + x 2 : + O R 3 C NH CH CO NH CH COOH R 2 R 4 R 1 R b 2 : NH 2 CH CO NH CH C O y 2 : NH 3 CH CO NH CH COOH R 2 R 1 c 2 : NH2 2 CH CO NH CH CO NH 3 + z 2 : + R 4 R 3 + CH CO NH CH COOH R 2 R 4 Figura 1: Iones fragmentos más comúnmente generados por la disociación de los enlaces del esqueleto carbonado de un tetrapéptido hipotético. La Figura 1 muestra los iones fragmentos del esqueleto carbonado de un péptido que pueden producirse durante un experimento de espectrometría de masas. Estos iones pueden ser agrupados en dos grandes familias: iones N-terminales e iones C-terminales en dependencia de cuál de los extremos del péptido ellos conserven. Ambas familias se subdividen en series de fragmentación según el sitio alrededor del enlace peptídico donde ocurre la disociación del ión precursor. El subíndice que acompaña a estas series de iones indica la cantidad de residuos que contiene cada ión fragmento, y los apóstrofes señalan el número de protones ganados por estos en el proceso de fragmentación. El espectro de masas representa la frecuencia y la relación masa/carga de los iones fragmentos detectados por el espectrómetro de masas (de Hoffmann, 2007). Cada altura de pico o señal (intensidad del pico) es proporcional a la frecuencia del ion fragmento a un valor de masa/carga determinado (Figura 2). Los espectros de masas son comúnmente representados como un gráfico 13

19 Revisión Bibliográfica donde el eje de las x representa la relación masa/carga y el eje de las y representa la intensidad relativa de cada pico. La diferencia de masas entre señales consecutivas de iones correspondientes a una misma serie, nos indicará la pérdida de un aminoácido, la posición que ocupa dentro de la secuencia y en el caso en que se obtengan valores de masas inesperados, estos pudieran relacionarse con aminoácidos modificados. De esta forma es posible localizar modificaciones post-traduccionales y determinar la secuencia de péptidos de forma bidireccional, lo que redunda en una mayor confiabilidad en la interpretación del espectro. Una característica particular de los experimentos de DIC, es que cualquiera sea el régimen de energía que se utilice, la eficiencia de la fragmentación del péptido o la proteína en estudio, es dependiente de su secuencia. Esto provoca que aunque se han realizado múltiples esfuerzos, sea prácticamente impredecible en su mayoría la relación de intensidades y la aparición de los fragmentos en el espectro de masas. Figura 2: Espectro de Masas MS/MS obtenido en un analizador TOF de un péptido con secuencia His- Ala-Ala-Xle-Glu-Val-Ala-Pro-Arg. Los iones fragmentos (b n, a n, z n, y n ) se encuentran representados en color azul. La señal (M+2H) 2+ representa la señal del ion precursor. El eje de las x muestra la relación masa/carga para cada ion fragmento y el eje de las y la intensidad relativa del ion fragmento. 14

20 Revisión Bibliográfica I.4.2 Incremento de la eficiencia de fragmentación a través de modificaciones químicas Es posible, mediante modificaciones químicas producir algún patrón de fragmentación en particular o generar iones fragmentos específicos (Wysocki et al., 2005, Michalski et al., 2011). La mayoría de los métodos de derivatización están diseñados para modificar el extremo N de los péptidos. Esto se debe a que el grupo amino del N-terminal se puede modificar de manera más específica que el grupo carboxilo del C-terminal (Ekman et al., 2008). Los grupos aminos α del extremo N y ε de la lisina pueden ser modificados de manera selectiva en dependencia de las condiciones del medio. En cambio la modificación de los grupos carboxilos del C-terminal y de los aminoácidos ácidos Asp y Glu pueden ocurrir en extensiones similares. La modificación de péptidos empleando PITC es una de las estrategias que se utilizan para la obtención de iones fragmentos específicos más intensos (Wang et al., 2009). Cuando un péptido modificado con PITC se fragmenta en fase gaseosa mediante disociación inducida por colisiones a baja energía, ocurre un proceso análogo a la degradación de Edman en fase líquida (Summerfield et al., 1997). Esta fragmentación promueve la formación de los iones complementarios b 1 y y n-1, con elevados rendimientos (70-90%) (Diego et al., 2010). Gaskell y colaboradores emplearon esta reacción para identificar proteínas de levadura presentes en geles de poliacrilamida (Brancia et al., 2001). En otra aplicación a la proteómica, Yao y colaboradores propusieron el empleo de los iones b 1 y y n-1 para la cuantificación absoluta de proteínas mediante Monitoreo de Reacciones Múltiples (MRM) (Wang et al., 2009). I.5 Proteómica computacional y bioinformática El desarrollo de la proteómica y sus técnicas analíticas han estado estrechamente relacionados con la evolución de la bioinformática y en especial de la proteómica computacional (Aebersold, 2011). La proteómica computacional es el conjunto de herramientas informáticas y análisis bioinformáticos que se emplean en los estudios de proteómica (Colinge and Bennett, 2007). Una simple célula de bacteria puede producir más de 4000 proteínas, mientras que el número de proteínas expresadas en eucariontes superiores es 10 veces mayor. Por esta razón, intentar analizar, validar, visualizar y catalogar los datos de proteómica se ha convertido en uno de los mayores retos de la bioinformática y la proteómica computacional (Aebersold, 2011, Martens, 2011). Eric W. Deutsch y colaboradores describen las etapas donde el empleo de las herramientas bioinformáticas son cruciales en un experimento de identificación de proteínas (Deutsch et al., 2008): (i) análisis in silico de proteomas, (ii) identificación de péptidos y 15

21 Revisión Bibliográfica proteínas, (iii) validación de péptidos y proteínas identificadas, (iv) visualización, análisis y almacenamiento de los datos obtenidos (Figura 3). El carácter cíclico de este flujo de etapas se debe a la necesidad de optimizar las condiciones del experimento analítico, conocidos los resultados alcanzados en el experimento. Cuando el diseño experimental ha sido optimizado y el protocolo analítico es conocido no es necesario realizar análisis in silico del proteoma estudiado. Análisis in silico de proteomas Experimento Analítico Identificación de péptidos y proteínas Validación de péptidos y proteínas identificadas Visualización, análisis y almacenamiento de los datos obtenidos Figura 3: Definición de los pasos bioinformáticos más comunes el desarrollo de metodologías de identificación de proteínas en experimentos de proteómica de alto flujo. I.5.1 Análisis in silico de proteomas El análisis in silico de proteomas permite predecir la eficiencia del diseño experimental en términos de cantidad y calidad de los péptidos y proteínas identificadas. El estudio de las propiedades de los péptidos y proteínas como la hidrofobicidad, carga eléctrica, masa y punto isoeléctrico posibilitan ajustar las variables experimentales para producir mejores resultados (Cagney et al., 2003). Cebrat y colaboradores realizaron un estudio profundo de la relación del punto isoeléctrico con la taxonomía, el tamaño de las secuencias, y la localización celular de las proteínas (Kiraga et al., 2007). El estudio demostró la distribución bimodal que presenta el punto isoeléctrico de proteínas y péptidos para la mayoría de las taxonomías. El análisis in silico de 16

22 Revisión Bibliográfica proteomas se subdivide en dos grandes componentes: bases de datos de secuencias de proteínas y plataformas bioinformáticas que permitan el procesamiento de estas bases de datos (Cagney et al., 2003, Colinge et al., 2006). La identificación de proteínas está basada comúnmente en el empleo de programas de búsqueda en bases de datos (Edwards, 2011). Las bases de datos de secuencias de proteínas son conjuntos de secuencias de aminoácidos anotadas en ficheros de texto, que han sido obtenidas por algoritmos computacionales o que han sido secuenciadas a través de técnicas analíticas (Apweiler et al., 2004). Estas bases de datos son anotadas en ficheros de texto con diferentes estructuras como los archivos estándares XML o ficheros FASTA (ficheros texto donde se anotan solo las secuencias de aminoácidos y los identificadores de las proteínas). Entre las bases de datos de secuencias de proteínas más empleadas en proteómica se encuentran: (i) UniProt KnowledgeBase (SWISS-PROT/TrEMBL), (ii) la base de datos no redundante de NCBInr (del inglés National Center for Bioinformatics Information), (iii) el índice internacional de proteínas (IPI del inglés International Protein Index) (Kersey et al., 2004). UniProt (SWISS-PROT/TrEMBL) El repositorio central de secuencias de proteínas Uniprot está integrado por dos fuentes fundamentales: (i) SWISS-PROT y (ii) TrEMBL (Magrane and Consortium, 2011). La diferencia principal entre estas dos bases de datos radica en el proceso de curación manual al cual es sometida SWISS-PROT. Todas las entradas (secuencias) en SWISS-PROT han pasado un riguroso control manual por biólogos y curadores expertos. Durante el proceso de curado diversas fuentes de información son consultadas y verificadas de forma cruzada con el objetivo de establecer las anotaciones que están claramente soportadas sobre solidas evidencias biológicas y experimentales. Obviamente, el proceso de curación es intenso en términos de recursos humanos y tiempo, lo que limita su crecimiento. TrEMBL fue creada con el objetivo de complementar esta debilidad, lo que hace de forma eficiente. TrEMBL está dividida en dos secciones, llamadas SP-TrEMBL y REM-TrEMBL. SP-TrEMBL contiene todos los registros que van a ser incorporados a UniProt/SwissProt. Por el contrario, REM-TrEMBL (del inglés REMaining TrEMBL) contiene secuencias sintéticas, truncadas, y otros fragmentos de proteínas que no son anotados por los mantenedores de UniProt/SwissProt. Adicionalmente, para cada proteína, UniProt contiene un conjunto de anotaciones sobre las modificaciones postraduccionales, función y proceso celular, etc. Otros recursos como las bases de datos UniParc (Leinonen et al., 2004) y UniRef (Suzek et al., 2007), herramientas de procesamiento y búsqueda son provistos por este recurso central. 17