La coordinación de las funciones fisiológicas en todo

Transcripción

1 Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T 3 La coordinación de las funciones fisiológicas en todo el organismo depende de la capacidad de células individuales para detectar cambios en su ambiente y para mostrar respuesta de manera apropiada. Una de las principales rutas mediante las cuales una célula interpreta su entorno es por medio de la unión de moléculas de señales a proteínas receptoras asociadas a la célula. Una molécula que se une a un receptor es un ligando. La unión no covalente de un ligando a su receptor puede inducir alteraciones en el receptor mismo, en su estado de polimerización, o en el ambiente de ese receptor, o en varios de estos factores a la vez; estos cambios actúan para transmitir o transducir la señal de unión a ligando hacia el interior de la célula, lo que lleva a alteraciones de las funciones celulares. En el sistema nervioso las moléculas transmisoras de señales se llamarían neurotransmisores, y en el sistema endocrino, hormonas. En el sistema inmunitario, las moléculas extrañas que indican la presencia de entidades no propias son antígenos y las moléculas pequeñas que se comunican entre las diversas poblaciones de células inmunitarias son las citocinas. Las citocinas especializadas que inducen quimioatracción o quimiorrepulsión se denominan quimiocinas. En este capítulo se proporciona una introducción general a la unión de receptor-ligando, y a los conceptos y estrategias a los que están por debajo de la transducción de señal. A continuación la exposición se enfoca de manera específica en los antígenos y receptores del sistema inmunitario adaptativo; se introducen los receptores de célula B y de célula T y los eventos de emisión de señales intracelulares que se producen en el momento de unión al antígeno. Dado que las células del sistema inmunitario están distribuidas en todo el cuerpo algunas residen en tejidos fijos y otras circulan por los diversos tejidos linfoides, la sangre y los linfáticos, la capacidad de estas células para comunicarse con otra y para emitir señales hacia otra por medio de mensajeros moleculares citocinas y quimiocinas solubles, es esencial para su función. En el capítulo 4 se describen los eventos de transmisión de señales que se producen cuando las citocinas y quimiocinas se unen a sus receptores cognados (que coinciden con ellas). En el capítulo 5 se incluye una descripción de los receptores de reconocimiento de patrones (prr) del sistema inmunitario innato, y de los eventos de emisión de señales iniciados por su unión a antígeno. Todos los eventos de señalización empie zan con una interacción complementaria entre un ligando y un receptor. En esta figura se des cribe la interacción molecular entre las regiones variables de una molécula de anticuerpo (las cadenas ligera y pesada se muestran en azul y rojo, respectivamente) y el extremo de la molécula de hemaglutinina del virus de la influenza, que se muestra en amarillo. [Ilustración basada en datos de cristalografía de rayos X recabados por.m. olman y W.R. Tulip de GJVH Nossal, 1993, cientific American 269(3):22.] Interacciones receptor-ligando Estrategias comunes usadas en muchas vías de señalización Vías de señalización que se encuentran con frecuencia La estructura de los anticuerpos Transducción de señal en células B Receptores de células T y señalización Los conceptos esenciales que son la base de la señalización celulares en el sistema inmunitario pueden resumirse como sigue: Una señal celular es cualquier evento que da instrucciones a una célula para que cambie su estado metabólico o proliferativo. Las señales suelen ser generadas por la unión de un ligando a un receptor unido a la célula complementaria. Una célula puede hacerse más o menos susceptible a las acciones de un ligando al incrementar (regular en dirección ascendente) o disminuir (regular en dirección descendente) la expresión del receptor para este ligando. 65

2 66 s e c c i ó n I Introducción El ligando puede ser una molécula soluble, o puede ser un péptido, carbohidrato o lípido presentado sobre la superficie de una célula. Desde su punto de entrada, el ligando puede viajar largas distancias por el cuerpo en el torrente sanguíneo o los linfáticos antes de que llegue a una célula que porta el receptor adecuado. La unión de ligando-receptor es no covalente, aunque puede ser de afinidad bastante alta. La unión de ligando al receptor induce un cambio molecular en el receptor. Este cambio puede ser en la forma de una alteración conformacional en el receptor, dimerización o agrupación de receptor, un cambio de la ubicación del receptor en la membrana, o una modificación covalente. Esas alteraciones de receptor ponen en marcha cascadas de eventos intracelulares que incluyen la activación de enzimas, y cambios de las ubicaciones intracelulares de moléculas importantes. El resultado final de la transmisión de señales celulares a menudo, mas no siempre, es un cambio del programa de transcripción de la célula blanco. A veces una célula debe recibir más de una señal por medio de más de un receptor para que se llegue a un resultado particular. La integración de las señales recibidas por una célula ocurre en el ámbito molecular dentro de la célula receptora. Interacciones receptor-ligando Los receptores de antígeno del sistema inmunitario adaptativo son proteínas transmembrana situadas en la membrana plasmática. La unión del ligando a su receptor cognado normalmente se produce por medio de interacciones no covalentes específicas entre el ligando y la porción extracelular del receptor de membrana. Aunque un linfocito individual sólo expresa un tipo de receptor de antígeno, también puede expresar muchas moléculas receptoras diferentes para señales como citocinas y quimiocinas y, por ende, una célula sana debe integrar las señales que provienen de todos los receptores que están ocupados en un momento dado. La unión de receptor-ligando ocurre por medio de múltiples enlaces no covalentes La superficie de una molécula de receptor se une a la superficie de su ligando complementario por medio de los mismos tipos de enlaces químicos no covalentes que usan las enzimas para unirse a sus sustratos, los cuales comprenden enlaces de hidrógeno y enlaces iónicos, e interacciones hidrofóbicas y Van der Waals. La clave para que la interacción receptor-ligando sea significativa es que la suma total de estas interacciones de unión se mantengan juntas, con suficiente energía de unión y durante suficiente tiempo, las dos superficies que están interactuando, a fin de permitir que una señal pase del ligando a la célula que porta el receptor. Dado que estas interacciones no covalentes son individualmente débiles, se requieren muchas interacciones de ese tipo para formar una conexión receptor-ligando biológicamente significativa. Además, puesto que cada una de estas in teracciones no covalentes sólo opera en una distancia muy corta por lo general alrededor de 1 Angstrom (1 Å = m), una interacción de alta afinidad entre receptor y ligando depende de un ajuste, o grado de complementariedad, muy cercano, entre el receptor y el ligando (figura 3-1). ómo se cuantifica la fuerza de interacciones receptor-ligando? onsidérese un receptor, R, que se une a un ligando, L. Es posible describir su reacción de unión de acuerdo con la ecuación que sigue: R + L k 1 RL (Ec. 3-1) k 1 en la cual RL representa el complejo de receptor-ligando unido, k 1 es la constante de tasa hacia adelante o de asociación, y k 1 es la constante de tasa de reversa o de disociación. La proporción de k 1 /k 1 es igual a Ka, la constante de asociación de la reacción, y es una medida de la afinidad del par de receptor-ligando. La constante de asociación se define como la relación entre la concentración del producto de la reacción, Ligando H 2 NH 2 H H 2 H 2 H 2 H 2 NH 3 + H 2 H H H 3 H 3 H 3 H 3 H 3 H 3 H H 2 H H H 3 H 2 H 2 Receptor Enlace de hidrógeno FigurA 3-1 La unión de receptor-ligando obedece las reglas de la química. Los receptores se unen a ligandos usando toda la gama de interacciones de enlace no covalente, incluso enlaces iónicos y de hidrógeno, e interacciones de Van der Waals e hidrofóbicas. ara que se emitan señales, los enlaces deben ser suficientemente fuertes como para mantener el ligando y el receptor en estrecha proximidad durante suficiente tiempo como para que se inicien eventos torrente abajo. En la señalización de células B y T, las interacciones activadoras también requieren agrupación de receptor. En un ambiente acuoso, las interacciones no covalentes son débiles y dependen de la complementariedad estrecha de las formas del receptor y el ligando. Enlace iónico Interacciones hidrofóbicas Interacciones de Van der Waals H 2 +H 3 N H 2 Enlace iónico

3 Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T a p í t u l o 3 67 [RL], y el producto de las concentraciones de reactantes [R], multiplicado por [L]. or consiguiente, las unidades de afinidad son M 1. Mientras más alta es la Ka, más alta es la afinidad de la interacción. Ka [RL] = (Ec. 3-2) [R][L] El recíproco de la constante de asociación, la constante de disociación, Kd, a menudo se usa para describir las interacciones entre receptores y ligandos. e define como: Kd [R][L] = (Ec. 3-3) [RL] Las unidades de la constante de disociación están en molaridad (M). La inspección de esta ecuación revela que cuando la mitad de los sitios receptores están ocupados con ligando es decir, [R] = [RL], la Kd es igual a la concentración de ligando libre [L]. Mientras más baja es la Kd, más alta es la afinidad de la interacción. ara propósitos de comparación, es útil considerar que los valores de Kd de muchas interacciones enzima-sustrato se ubican en el rango de 10 3 a 10 5 M. Los valores de Kd de interacciones antígeno-anticuerpo al principio de una respuesta inmunitaria normalmente son del orden de 10 4 a 10 5 M; sin embargo, puesto que los anticuerpos generados en el momento de la estimulación con antígeno son mutados y seleccionados en el transcurso de una respuesta inmunitaria, las interacciones antígeno-anticuerpo en etapas tardías de una respuesta inmunitaria pueden alcanzar una Kd tan baja como de M. En estas condiciones, si un antígeno está presente en solución a una concentración tan baja como de M, la mitad de los sitios de unión a anticuerpo disponibles estará ocupada. Ésta es una interacción extraordinariamente fuerte entre receptor y ligando. Las interacciones entre receptores y ligandos pueden ser multivalentes Muchos receptores biológicos, incluso receptores de célula B, son multivalentes es decir, tienen más de un sitio de unión a ligando por cada molécula. uando tanto los receptores como los ligandos son multivalentes como ocurre, por ejemplo, cuando un receptor de inmunoglobulina bivalente sobre la superficie de una célula B se une a dos antígenos repetidos idénticos sobre una superficie bacteriana, la interacción de unión general entre la célula bacteriana y el receptor de célula B está notoriamente aumentada en comparación con una interacción similar, pero univalente. De esta manera, múltiples interacciones receptor-ligando concurrentes aumentan la fuerza de unión entre dos superficies celulares. Note que la unión por medio de dos sitios receptores idénticos a dos ligandos idénticos sobre la misma célula puede ser un poco menos de dos veces tan firme como la unión por medio de un sitio receptor único. Esto se debe a que la unión de ambos sitios receptores a dos ligandos sobre un antígeno único puede tensar un poco las características geométricas de la unión en uno de los sitios o en ambos y, por ende, interferir un poco con el ajuste de las interacciones individuales. Gran parte del beneficio de la multivalencia depende del hecho de que las interacciones de unión no covalente son inhe- rentemente reversibles; el ligando pasa parte del tiempo unido al receptor, y parte del tiempo en un estado no unido, o inactivo (figura 3-2a). uando está involucrado más de un sitio de unión, es menos probable que todos los sitios receptores estén simultáneamente en el estado inactivo y, por ende, que el receptor libere el ligando (figuras 3-2b y 3-2c). El término avidez se usa para describir la fuerza general de las interacciones de unión colectivas que ocurren durante unión multivalente. Durante las fases tempranas de la respuesta inmunitaria adaptativa a antígenos multivalentes, las células B secretan anticuerpo IgM, que tiene 10 sitios de unión a antígeno disponibles por cada molécula. or ende, la IgM tiene capacidad de unión a antígenos a una magnitud importante desde el punto de vista biológico, incluso si la afinidad de cada sitio de unión individual por su antígeno es baja, debido a la avidez de la interacción antígeno-anticuerpo entera. De igual modo, cuando un receptor unido a célula se une a un ligando unido a célula, su interacción puede ser funcionalmente multivalente, incluso si las moléculas receptoras individuales son monovalentes, porque múltiples moléculas receptoras pueden agruparse en la membrana celular y participar en la interacción receptor-ligando. Además, otras interacciones con correceptor también pueden contribuir a la avidez general de la unión entre una célula y su antígeno (véase más adelante). La afinidad de las interacciones receptor-ligando puede medirse mediante técnicas como diálisis de equilibrio o resonancia de plasmón de superficie (spr). Estos dos métodos se describen en el capítulo 20. a) Activo Inactivo FigurA 3-2 Unión monovalente y bivalente. a) Unión monovalente. El receptor existe en equilibrio con su ligando, representado aquí como un círculo. arte del tiempo está unido (la unión se encuentra en el estado activo ), y parte del tiempo está no unido (la unión se encuentra en el estado inactivo ). La proporción del tiempo que se pasa en el estado activo en contraposición con inactivo determina la afinidad de la interacción de receptor-ligando, y se relaciona con la fuerza de la suma de las interacciones de unión no covalente entre el receptor y el ligando. (ontinúa)

4 68 s e c c i ó n I Introducción b) c) FigurA 3-2 (continuación) b) Unión bivalente. Aquí se visualiza un receptor bivalente, que se une a dos sitios en un ligando multivalente único. Esto podría representar, por ejemplo, una molécula de anticuerpo bivalente que se une a una bacteria que tiene antígenos repetidos sobre su superficie. En esta representación, ambos sitios están ocupados. c) En esta representación, el receptor bivalente se ha separado momentáneamente de uno de sus sitios, pero aún está fijo al ligando con el otro. Las proteínas grandes, como los anticuerpos, vibran y respiran continuamente, lo que da lugar a esa cinética de activo-inactivo. La unión bivalente o multivalente ayuda a asegurar que cuando un sitio libera momentáneamente el ligando, la interacción no se pierde por completo, como se pierde en la parte a). La expresión de receptor y ligando puede variar en el transcurso de una respuesta inmunitaria Una de las características más notorias de la lógica molecular de las respuestas inmunitarias es que los receptores para algunos factores de crecimiento y citocinas sólo se expresan según se re quiere. or ejemplo, casi todos los linfocitos expresan una forma de baja afinidad, heterodimérica (de dos cadenas), del receptor para la citocina interleucina-2 (IL-2), que inicia una señal que promueve la proliferación de linfocitos (esta citocina y su receptor se cubren con mayor detalle en el capítulo 4). Esa forma de baja afinidad del receptor es incapaz de unirse a la IL-2 a concentración fisiológica de citocina. on todo, cuando un linfocito es activado por unión a antígeno, la señal que proviene del receptor unido a antígeno causa un incremento de la expresión de una tercera cadena del receptor de IL-2 en la superficie celular (figura 3-3). La adición de esta tercera cadena convierte la forma de baja afinidad del receptor de IL-2 en una forma de alta afinidad, capaz de responder a la concentración de citocina que se encuentra en los órganos linfoides. El corolario funcional de esto es que sólo los linfocitos que ya se han unido a antígeno y han sido estimulados por esa unión, tienen receptores de citocina de afinidad suficientemente alta para responder a la concentración fisiológica de citocina. Al esperar hasta que ha interactuado con su antígeno específico antes de expresar el re - ceptor de citocina de alta afinidad, el linfocito conserva energía y evita el inicio accidental de una respuesta inmunitaria contra un antígeno irrelevante. Las concentraciones locales de citocinas y otros ligandos pueden ser en extremo altas Al considerar las interacciones entre receptores y sus ligandos, es importante considerar el ambiente anatómico en el cual están ocurriendo estas interacciones. Los linfocitos y las células presentadoras de antígeno que participan en una respuesta inmunitaria pasan cantidades importantes de tiempo juntos por medio de múltiples interacciones receptor-ligando. Las señales de citocina liberadas por una célula T, por ejemplo, son recibidas por una célula presentadora de antígeno unida en la interfaz entre las células, antes de que la citocina haya tenido tiempo para difundirse hacia los líquidos tisulares. La secreción de citocinas hacia exactamente el sitio donde se necesitan es facilitada por la capacidad de la señalización de receptor de antígeno para inducir redistribución del centro organizador de microtúbulos (mtoc) dentro de la célula T activada. A su vez, la reorientación del mtoc causa la redistribución de los orgánulos secretores (el cuerpo de Golgi y vesículas secretoras) dentro del citoplasma de la célula T, de modo que las citocinas sintetizadas por la célula T son secretadas en la dirección del receptor de célula T que, a su vez, está unido a la célula presentadora de antígeno. El término técnico para este fenómeno es la redistribución vectorial (direccional) del aparato secretor. De este modo, las citocinas son secretadas de manera directa hacia el espacio entre la célula T activada y la célula presentadora de antígeno. La redistribución vectorial del aparato secretor en células dendríticas presentadoras de antígeno también ocurre en el momento de interacción con células T específicas para antígeno. Esto asegura que las citocinas, como la IL-12, que son secretadas por células dendríticas, sean suministradas con eficiencia a las células T que reconocen antígeno. La figura 3-4 muestra la secreción direccional de la citocina IL-12 por una célula dendrítica presentadora de antígeno que participa en la activación de una célula T. Las células efectoras del sistema inmunitario, como las células B, también son capaces de presentar antígenos sobre su superficie celular para reconocimiento por células T auxiliares. Una célula B que ha reconocido de manera específica un antígeno por medio de su propio receptor procesará el antígeno y expresará una concentración en particular alta de los péptidos antigénicos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (mhc) sobre su superficie. or ende, una célula T

5 Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T a p í t u l o 3 69 FigurA 3-3 La expresión de algunos receptores de citocina está regulada en dirección ascendente después de estimulación celular. Leucocitos teñidos con dapi, un colorante que detecta dna (azul), no se trataron (izquierda) o se estimularon con el mitógeno de células T humanas fitohemaglutinina (derecha). En el momento de la estimulación, la cadena alfa del receptor de IL-2 (IL-2Rα) (amarillo) está regulada en dirección ascendente, lo que aumenta la afinidad del receptor de IL-2 por la IL-2. En el momento de estimulación con antígeno se observa una regulación ascendente similar del IL-2Rα. [ortesía de R&D ystems, Inc., Minneapolis, MN, UA.] lugar a una interacción de unión de fuerza y duración suficientes para desencadenar un cambio bioquímico en el receptor, o en sus moléculas asociadas, o en ambos. A su vez, este cambio bioquímico puede causar una diversa gama de consecuencias bioquímicas en la célula (figura 3-5, erspectiva general). Los términos torrente arriba y torrente abajo a menudo se usan para describir elementos de vías de señalización. Los componentes torrente arriba de una vía de emisión de señales son los que están más cerca del receptor; los componentes torrente abajo son los que están más cerca de las moléculas efectoras que determinan el resultado de la vía; por ejemplo, los factores de transcripción o enzimas cuyas actividades son modificadas en el momento en que se recibe la señal. ese a lo discrepantes y complejas que algunas de estas vías de señalización pueden ser, muchas comparten características. En esta sección, para proporcionar un marco para analizar las vías individuales empleadas por las células del sisauxiliar, unida a un antígeno presentado sobre la superficie de una célula B, suministrará una concentración alta de citocinas directamente a una célula B activada, específica para antígeno. or consiguiente, la concentración local de citocinas en las interfases celulares puede ser en extremo alta, mucho más alta que en los líquidos tisulares en general. Estrategias comunes usadas en muchas vías de señalización Una vía de transducción de señal es la ruta molecular mediante la cual una interacción ligando-receptor se traduce en un cambio bioquímico dentro de la célula afectada. La comunicación del mensaje del ligando a la célula es iniciada por la complementariedad de estructura entre el ligando y su receptor, que da FigurA 3-4 ecreción polarizada de IL-12 (rosado) por células dendríticas (azul) en la dirección de una célula T unida (verde). La micrografía con aumento más alto muestra la secreción de paquetes de IL-12 a través de la membrana de la célula dendrítica. [J. ulecio et al., 2010, Journal of Experimental Medicine 207:2,719.]

6 70 s e c c i ó n I Introducción erspectiva general 3-5 onceptos en la señalización de linfocitos Ligando orreceptor Moléculas asociadas a receptor Receptor Tirosina cinasa asociada a receptor I 2 I 3 DAG I 2 I 3 DAG DAG I3 cinasa I 3 Liberación de a 2+ desde el retículo endoplasmático Lγ Adaptador Adaptador Ras-GR Ras Intercambio de GD/GT K Fosforilación Activación de calmodulina y calcineurina NFAT ascada de la MA cinasa NF-κB IκB Ubiquitinación y destrucción itoplasma NFAT A-1 NF-κB Núcleo Activación de gen La unión de ligando a receptores sobre una célula induce diversos efectos torrente abajo, muchos de los cuales culminan en activación de factor de transcripción. Aquí se ilustran algunas de las vías que se abordan en este capítulo. La unión del receptor a ligando induce agrupación de receptores y moléculas emisoras de señales hacia regiones de la membrana denominadas balsas de lípidos (rojo). La unión de receptor a ligando puede acompañarse de unión de correceptores asociados a sus propios ligandos, y causa la activación de tirosina cinasas asociadas con receptor, que fosforilan proteínas asociadas con receptor. La unión de moléculas adaptadoras torrente abajo a los grupos fosfato sobre proteínas adaptadoras crea un andamio en la membrana que permite entonces la activación de diversas enzimas, entre ellas fosfatasa γ (Lγ), I3 cinasa, y otras tirosina cinasas. Lγ divide el fosfatidil inositol bifosfato (I 2 ) para dar trifosfato de inositol (I 3 ), que interactúa con receptores sobre vesículas del retículo endoplasmático para causar la liberación de iones calcio; éstos a su vez activan la calcineurina, que desfosforila el factor de transcripción nfat, lo que le permite entrar al núcleo. El diacilglicerol (dag), que permanece en la membrana después de división de I 2 por Lγ, se une a, y activa, la proteína cinasa (pkc), que fosforila y activa enzimas que llevan a la destrucción del inhibidor del factor de transcripción NF-κB. on la liberación del inhibidor, NF-κB entra al núcleo y activa una serie de genes importantes para el sistema inmunitario. La unión de la proteína adaptadora Ras-GR al complejo de emisión de señales permite la unión y la activación del factor de intercambio de nucleótido guanina (gef ), on of evenless (sos) que, a su vez, inicia la cascada de fosforilación de las vías de la MA cinasa. Esto da pie a la entrada de un tercer grupo de factores de transcripción al núcleo, y activación del factor de transcripción A-1. (Muchos detalles que se explican en el texto se han omitido de esta figura en aras de la claridad.)

7 Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T a p í t u l o 3 71 itosol tema inmunitario, se describen algunas de las estrategias compartidas por muchas vías de emisión de señales. En la sección que sigue se proporcionan tres ejemplos de vías de emisión de señales usadas por el sistema inmunitario, así como por otros sistemas. La unión a ligando puede inducir cambios conformacionales en el receptor, o agrupación del receptor, o ambos El primer paso necesario para la activación de una vía de señalización es que el sitio de unión del ligando a sus receptores de alguna manera induce un cambio físico o químico en el receptor mismo, o en moléculas asociadas a él. En el caso de muchos receptores de factor de crecimiento, la unión a ligando induce un cambio conformacional en el receptor que da lugar a dimerización de receptor (figura 3-6). uesto que las regiones citoplasmáticas de muchos receptores de factor de crecimiento tienen actividad de tirosina cinasa, esto da lugar a la fosforilación recíproca de las regiones citoplasmáticas de cada una de las moléculas receptoras por su pareja de dimerización. tros receptores pasan por cambios conformacionales en el momento de unión a ligando, que dan lugar a órdenes más altos de polimerización de receptor. Los receptores sobre células B son formas unidas a membrana de las moléculas de anticuerpo que la célula B finalmente secretará. En la superficie de células B vírgenes hay dos tipos de receptores de antígeno, que se denominan inmunoglobulinas M y D (IgM e IgD). Estudios estructurales de la forma IgM del receptor han revelado que la unión a ligando induce un cambio conformacional en una parte no de unión a antígeno del receptor, cerca de la membrana, que facilita la agregación de receptores hacia complejos multiméricos, y su movimiento subsiguiente hacia regiones de la membrana especializadas. De modo similar, los receptores de célula T se Dominio de tirosina cinasa Factor de crecimiento Tirosina cinasas receptoras inactivas Actividad de cinasa estimulada por fosforilación cruzada FigurA 3-6 Algunos factores de crecimiento inducen dimerización de sus receptores, seguida por fosforilación de tirosina recíproca de las moléculas de receptor. Muchos receptores de factor de crecimiento poseen actividad de tirosina cinasa en sus regiones citoplasmáticas. La dimerización del receptor ocurre en el momento de unión del ligando relevante y permite fosforilación recíproca en múltiples sitios de las cadenas de receptor dimerizadas, lo que inicia la cascada de señalización. omo un ejemplo, el factor de células madre se une a su receptor, c-kit (D117), sobre la superficie de células del estroma de la médula ósea. agrupan en el momento de unión a antígeno. ersisten las controversias respecto a si pasan o no por un cambio conformacional en el momento de unión a antígeno. Algunos receptores requieren moléculas asociadas a receptor para emitir una señal de activación celular En contraste con los receptores de factor de crecimiento, que tienen actividades enzimáticas inducibles integradas en la molécula de receptor misma, los receptores de célula T y B tienen componentes citoplasmáticos muy cortos y, por ende, necesitan ayuda de moléculas asociadas a receptor intracelulares para desencadenar transducción de señal. El heterodímero Igα/ Igβ (D79α/β) en células B, y el complejo D3 hexamérico en células T, están estrechamente asociados con sus receptores de antígeno respectivos, y se encargan de transmitir al interior de la célula las señales iniciadas por unión a ligando (figura 3-7). Estos dos complejos tienen un par de colas citoplasmáticas largas que contienen múltiples copias del motivo de activación de inmunorreceptor basado en tirosina (Immuno-receptor Tyrosine Activation Motif [itam]). Los itam son motivos de secuencia recurrentes que se encuentran en muchas proteínas emisoras de señales dentro del sistema inmunitario, que contienen tirosinas que quedan fosforiladas después de transducción de señal por medio del receptor asociado. La fosforilación de residuos de itam-tirosina a continuación permite el acoplamiento de moléculas adaptadoras, lo que facilita el inicio de la cascada de señalización. tras moléculas asociadas con los receptores de antígeno de célula B o T también pueden interactuar con el antígeno o con otras moléculas sobre la superficie del agente patógeno. or ejemplo, en el caso de las células B, el complejo de D19/D21 se une a moléculas de complemento fijas de manera covalente al antígeno (figura 3-7a). De modo similar, moléculas de D4 y D8 sobre células T se unen a regiones no polimórficas de la molécula de mhc que presenta antígenos, y ayudan en la transducción de señal (figura 3-7b). or último, el correceptor D28 sobre células T vírgenes debe interactuar con sus ligandos D80 (B7-1) y D86 (B7-2) para que ocurra activación completa de célula T. La agrupación de receptor inducida por ligando puede alterar la ubicación de receptor La agrupación inducida por ligando de receptores de célula B y T lentifica las tasas de su difusión dentro de los planos de sus respectivas membranas celulares, y facilita su movimiento hacia regiones especializadas de la membrana del linfocito conocidas como balsas de lípidos. Estas balsas son regiones de la membrana ricas en colesterol y en esfingolípidos, insolubles en detergente, muy ordenadas, pobladas por muchas moléculas cruciales para la emisión de señales de receptor. El movimiento de receptores y correceptores hacia las balsas de lípidos las hace susceptibles a la acción de enzimas asociadas con esas balsas. En la figura 3-8 se muestra cómo la tirosina cinasa asociada a balsa Lyn inicia la cascada de emisión de señales de célula B al fosforilar las moléculas asociadas con receptor Igα e Igβ. La tirosina cinasa Lck desempeña una función similar en la cascada de señalización de tcr.

8 72 s e c c i ó n I Introducción D21 3d Antígeno migm D4 MH clase II D80 o D86 D81 (TAA-1) D19 δ ε TR ζ ζ γ éptido ε D28 s s lgα/lgβ (D79α,β) ITAM FigurA 3-7 Los receptores de células tanto B como T requieren moléculas asociadas a receptor y correceptores para la transducción de señal. a) Los receptores de célula B requieren Igα/Igβ para transmitir su señal. El correceptor D21, que está asociado con D19, se une a la molécula de complemento 3d, que se une de manera covalente al antígeno. La interacción entre D21 sobre la célula B, y 3d asociada con el antígeno, mantiene el antígeno en contacto con el receptor de célula B, incluso cuando la unión de antígeno-br es relativamente débil. Las bandas de color amarillo sobre las re giones citoplasmáticas de las moléculas asociadas a receptor indican motivos de activación de inmunorreceptor basados en tirosina (Immunoreceptor Tyrosine Activation Motifs [itam]). La fosforilación de residuos tirosina en estos motivos permite la unión de moléculas adaptadoras D3 torrente abajo, y facilita la transducción de señal desde los receptores. Tanto D19 como Igα/Igβ portan itam intracitoplasmáticos y, junto con D81 (TAA-1), participan en eventos de señalización torrente abajo. b) Los receptores de célula T usan D3, un complejo de cadenas δε, γε, y un par de moléculas de cadena ζ o un par de ζν. Los correceptores D4 y D8 se unen a la región no polimórfica de las moléculas del mhc clase II o clase I, respectivamente; esta figura ilustra la unión de D4 a mhc clase II. Dicha unión asegura la conexión entre la célula T y la célula presentadora de antígeno, e inicia también una señal por medio de D4/8. El correceptor D28 proporciona otra señal en el momento de unión a D80 o D86. La unión de D28 a moléculas coestimuladoras sobre células presentadoras de antígeno se requiere para estimulación de células T vírgenes, pero no de memoria. Antígeno BR lgα/lgβ Balsa + Antígeno Lyn Lyn Antígeno BLNK yk Lyn BLNK yk Traducción de señal Internalización de receptor FigurA 3-8 Regiones balsa de lípidos dentro de membranas. En células B en reposo, el receptor de célula B (bcr) es excluido de las balsas de lípidos, que son regiones de la membrana altas en colesterol y ricas en glicoesfingolípidos. La balsa está poblada por moléculas emisoras de señales de tirosina cinasa, como Lyn. En el momento de unión a antígeno, el bcr se multimeriza (forma agrupaciones), y los cambios en la conformación del bcr desencadenados por su multimerización aumentan la afinidad del bcr por los lípidos de la balsa. El movimiento del bcr hacia la balsa lo pone en contacto con la tirosina cinasa Lyn, que fosforila las proteínas asociadas a receptor Igα/Igβ lo que, así, inicia la cascada de activación. Un movimiento similar de tcr hacia balsas de lípidos ocurre en el momento de activación de célula T. [Adaptado de. K. ierce, 2002, Nature Reviews Immunology 2:96.]

9 Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T a p í t u l o 3 73 py508 Inactiva H2 inasa Y397 Y508 Activa H2 inasa py397 FigurA 3-9 Activación de cinasas de la familia rc. Las cinasas de la familia rc son mantenidas en una configuración cerrada, inactiva, por la unión de un residuo de tirosina inhibidor fosforilado (py508 en este ejemplo) con un dominio H2 en la misma proteína. La desfosforilación de esta tirosina abre la molécula, lo que permite que el sustrato tenga acceso al sitio enzimático. La abertura de la cinasa también permite la fosforilación de una tirosina interna diferente (py397), que estimula más la actividad de la cinasa rc. La fosforilación de tirosina es un paso temprano en muchas vías de señalización Muchas vías de emisión de señales, en particular las que emiten señales para el crecimiento de células o la proliferación de estas últimas, se inician con un evento de fosforilación de tirosina. Muchas de las tirosina cinasas que inician la activación de bcr y tcr pertenecen a la familia de enzimas conocida como cinasas de la familia rc. Las cinasas de la familia rc (que en idioma inglés se pronuncia sark ) tienen homología con un gen, c-src, que se identificó por vez primera en aves. e mostró que un virus del sarcoma Rous homólogo de estos genes, activo de manera constitutiva, v-src, induce una forma de cáncer, el fibrosarcoma, en aves. El hecho de que una mutación sencilla en esta forma viral de un gen que codifica para tirosina cinasa podría dar lugar a la aparición de un tumor fue el primer indicio de que los genes que codifican para tirosina cinasa pueden ser importantes en la regulación de la proliferación celular y, de hecho, en muchos aspectos de la señalización celular. Las cinasas de la familia rc son importantes en las etapas más tempranas de activación de células tanto T como B. Lck y Fyn son cruciales para la activación de células T, y Lyn, Fyn y Blk desempeñan los papeles iniciadores correspondientes en células B. uesto que la activación inadvertida de estas enzimas puede llevar a proliferación incontrolada un precursor para la formación de tumor, no sorprende que su actividad esté estrechamente regulada de dos maneras distintas pero interconectadas. Las enzimas tirosina cinasa de la familia rc inactivas existen en una conformación cerrada, en la cual una tirosina fosforilada está estrechamente unida a un dominio H2 (dominio de homología de H2 [rc homology 2]) interno (figura 3-9, cuadro 3-1). (Los dominios H2 en proteínas se unen a residuos de tirosina fosforilados.) Mientras la tirosina inhibitoria esté fosforilada, la cinasa de la familia rc permanece plegada sobre sí misma e inactiva. En linfocitos, la enzima tirosina cinasa sk se encarga de mantener la fosforilación de la tirosina inhibitoria. Aun así, en el momento de la activación celular, una tirosina fosfatasa elimina el fosfato inhibidor, y la cinasa de la familia rc se abre hacia una conformación parcialmente activa. Así, el evento iniciador en la transducción de señal a menudo es el movimiento de la tirosina cinasa hacia una región de la célula o la membrana poblada por una fosfatasa activadora, apropiada, y distante de la cinasa inhibidora sk. A continuación se logra actividad completa cuando la cinasa de la familia rc se fosforila a sí misma en un segundo residuo de tirosina activador. cuadro 3-1 Dominios seleccionados de proteínas adaptadoras y sus motivos blanco de unión Dominio de proteína adaptadora Homología de rc 2 (H2) Homología de rc 3 (H3) Unión a fosfotirosina (TB) Homología de pleckstrina (H) WW ecuencias ricas en cisteína (1) Unión a tirosina cinasa (TKB) Rico en prolina Motivos de unión a Especificidad de unión de dominio adaptador Fosfotirosina específica (py) que contiene motivos en el contexto de tres a seis aminoácidos ubicados en posición carboxilo terminal a la py (se requiere una arginina invariable en el dominio H2 para unión a py) ecuencias ricas en prolina en una hélice de poliprolina zurda (los residuos de prolina por lo general van precedidos por un residuo alifático) Motivos peptídicos que contienen py (DXpY, donde X es cualquier aminoácido) en el contexto de secuencias amino terminal Fosfoinositidas específicas, que permiten que proteínas que contienen H respondan a la generación de segundos mensajeros lípidos generados por enzimas como la I3 cinasa e une a secuencias ricas en prolina (su nombre se deriva de dos residuos de triptófano [W] conservados, con 20 a 22 aminoácidos de separación) Diacilglicerol (DAG) (en asociación con DAG, el dominio 1 muestra afinidad aumentada por la membrana lipídica, lo que promueve el reclutamiento de proteínas que contienen 1 hacia la membrana) Dominio de unión a fosfotirosina divergente de los dominios H2 y TB típicos (consta de tres motivos estructurales [un fascículo de cuatro hélices, una mano EF, y un dominio H2 divergente], que juntos forman un dominio de reconocimiento de fosfoproteína integrado) Tramos de secuencia de aminoácidos ricos en residuos de prolina, capaces de unirse a dominios modulares, entre ellos dominios H3 y WW Residuos de serina fosforilados en el contexto de uno de los dos motivos RXpX y RXXXpXp [egún G.A. Koretsky y.. Myung, 2001, Nature Reviews Immunology 1:95]

10 74 s e c c i ó n I Introducción La fosforilación de tirosina puede desencadenar cambios en una vía de emisión de señales de más de una manera. A veces, la fosforilación de un residuo de tirosina puede inducir un cambio conformacional en la proteína fosforilada misma, que puede echar a andar esta actividad enzimática o desactivarla. De ma - nera alternativa, la fosforilación de tirosina de componentes de un complejo receptor puede permitir que otras proteínas se unan a él por medio de sus dominios H2 o de unión a fosfotirosina (cuadro 3-1), lo que altera sus ubicaciones dentro de la célula. Note que una tirosina fosforilada a menudo se denomina un residuo py. Las proteínas adaptadoras recolectan miembros de vías de señalización Es fácil imaginar el citoplasma como un océano de macromoléculas, con poca estructura u organización, en el cual las proteínas se golpean una a otra a una frecuencia que sólo depende de sus concentraciones citoplasmáticas generales. De cualquier modo, nada podría estar más lejos de la verdad. El citoplasma de hecho es un ambiente intrincadamente organizado, en el cual disposiciones tridimensionales de proteínas se forman y dispersan de una manera dirigida por eventos de emisión de señales celulares. Muchas de estas interacciones reversibles entre proteínas están mediadas por proteínas adaptadoras, así como por interacciones entre miembros de vías de señalización con componentes del citoesqueleto. Las proteínas adaptadoras carecen de función enzimática o de receptor intrínseca; tampoco actúan como factores de transcripción. u función es unirse a motivos o dominios específicos sobre proteínas o lípidos, enlazar uno al otro; poner sustratos al alcance de enzimas, y en general mediar la redistribución de moléculas dentro de la célula. El cuadro 3-1 lista varios dominios adaptadores representativos, junto con sus especificidades de unión. Las proteínas adaptadoras se caracterizan por tener múltiples dominios de superficie, cada uno de los cuales posee una especificidad de unión precisa para una estructura molecular particular. En muchas vías de emisión de señales, múltiples proteínas adaptadoras pueden participar en la formación de un andamio de proteína que proporciona un marco estructural para la interacción entre miembros de una cascada de emisión de señales. Los dominios en particular comunes en proteínas adaptadoras que funcionan en la señalización del sistema inmunitario son el dominio H2 que se une a residuos de tirosina fosforilados (py), el dominio H3 que se une a agrupaciones de residuos de prolina, y el dominio de homología de plecstrina (H) que se une a fosfatidil inositol trifosfato en la membrana plasmática. La unión de proteínas adaptadoras puede simplemente poner en contacto moléculas entre sí, de modo que, por ejemplo, una enzima puede actuar sobre su sustrato. De modo alternativo, la unión de una proteína adaptadora puede inducir un cambio conformacional, que a su vez puede estabilizar la pareja de unión, desestabilizarla o activarla. La transducción de señal puede inducir cambios conformacionales en proteínas que a su vez dan lugar a descubrimiento de uno o más dominios de proteína con afinidad específica por otras proteínas. Esas interacciones pueden ser homotípicas (in - teracciones entre dominios idénticos) o heterotípicas (interacciones entre dominios diferentes). La fosforilación sobre residuos de serina y treonina también es un paso común en vías de señalización En tanto la fosforilación de tirosina suele observarse al inicio de una cascada de emisión de señales, la fosforilación de proteínas en residuos de serina y treonina (figura 3-10) tiende a ocurrir en pasos más avanzados en la activación celular. La fosforilación de serina o treonina puede servir para activar una enzima fosforilada, para inducir la interacción de una proteína fosforilada con un grupo diferente de proteínas, para alterar la ubicación de la proteína dentro de la célula, para proteger la proteína contra destrucción o, en algunos casos importantes, para con- +NH 3 H 2 H H Tirosina + H 3 N H H 2 H erina + H 3 N H H H 3 H Treonina Tirosina cinasa erina/treonina cinasas +NH 3 H 2 H + H 3 N H 2 3 H Fosfotirosina 3-Fosfoserina FigurA 3-10 Tirosina, serina y treonina fosforiladas. + H 3 N H H H Fosfotreonina

11 Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T a p í t u l o 3 75 vertir la proteína fosforilada en un blanco para la destrucción proteosomal. La fosforilación de fosfolípidos de membrana recluta proteínas que contienen dominio H hacia la membrana celular El fosfolípido fosfatidilinositol bifosfato (hosphatidyl Inositol bis-hosphate [I 2 ]) es un componente de la cara interna de membranas plasmáticas de eucariontes. No obstante, el I 2 es mucho más que un fosfolípido estructural; también participa de manera activa en la emisión de señales celulares. La enzima fosfatidil inositol-3-cinasa (hosphatidyl Inositol-3-kinase [I3 cinasa]), activada en el transcurso de la señalización por medio de muchos receptores inmunitarios, fosforila el I 2 para formar fosfatidil inositol trifosfato (hosphatidyl Inositol tris-hosphate [I 3 ]) (figura 3-11). El I 3 permanece en la membrana y sirve como un sitio de unión para proteínas que portan dominios de homología a plecstrina (H) (cuadro 3-1). Así, este evento de fosforilación de lípido sirve para mover proteínas desde el citosol hacia la membrana y proporcionarles un H H FigurA 3-11 El I 2 puede ser fosforilado (rojo) por la I 3 cinasa para crear I 3 durante la activación celular. El I 3 a continuación crea sitios de unión para proteínas con dominios H en la cara interna de la membrana plasmática. sitio de unión en la superficie de la membrana interna. La ubicación de proteínas en la membrana las pone en contacto con otros miembros de una cascada de señalización, lo que permite que las enzimas tengan acceso a nuevos sustratos, y permite la modificación de proteínas adaptadoras, con el montaje subsiguiente de complejos de emisión de señales. La desintegración de I 2 por plc, inducida por señal, causa un incremento de la concentración citoplasmática de ion calcio Además de ser fosforilado por la I3 cinasa, el I 2 también es susceptible a un segundo tipo de modificación bioquímica inducida por señal. Una segunda enzima (más correctamente, una familia de enzimas), la fosfolipasa (hospholipase [plc]), también es activada en el momento de emisión de señales de antígeno de linfocitos (figura 3-12). La plc hidroliza el I 2, lo cual separa el azúcar trifosfato de inositol (I 3 ) desde el esqueleto de diacilglicerol (dag). El dag permanece en la membrana, donde se une a varias enzimas de señalización importantes, y las activa. e libera I 3 hacia el citoplasma, donde interactúa con receptores de I 3 específicos sobre la superficie de vesículas de retículo endoplasmático, lo que induce la liberación de iones calcio (a 2+ ) almacenados hacia el citoplasma. Estos iones calcio a continuación se unen a varias proteínas celulares, y cambian su conformación y alteran su actividad. La doble carga positiva de los iones calcio, y el tamaño de su radio iónico, los hacen en particular idóneos para unión a muchas proteínas; sin embargo, en el campo de la emisión de señales celulares, la calmodulina (am) es indiscutiblemente la proteína de unión a calcio de mayor importancia. La am es una proteína en forma de mancuerna, con dos subunidades globulares separadas por un bastón α-helicoidal (figura 3-13a). ada una de las dos subunidades tiene dos sitios de unión a calcio, de modo que la am tiene la capacidad para unirse a cuatro iones a 2+. En el momento de la unión a calcio, la am pasa por un cambio conformacional notorio (figura 3-13b), que le permite unirse a diversas proteínas celulares diferentes, y activarlas. A medida que se usan iones a 2+ citoplasmáticos en la unión a proteínas citoplasmáticas, y la concentración de ion a 2+ citoplasmática libre disminuye, empiezan a montarse proteínas de canal de a 2+ en la membrana. Finalmente, los canales se abren para permitir la afluencia de más calcio desde el líquido extracelular y completar la activación de las proteínas reguladas por calcio. El montaje de estas llamadas proteínas de canales de calcio operados por depósito es imposible en presencia de calcio intracelular alto. Muchos tipos diferentes de iones se encuentran en una cé - lula, y es razonable preguntar por qué los eucariontes deben haber adquirido por evolución proteínas con actividades que muestran tanta capacidad de respuesta a la concentración de ion a 2+ intracelular. La respuesta a esta pregunta yace en parte en el hecho de que es relativamente fácil alterar la concentración citoplasmática de iones a 2+. La concentración de a 2+ en la sangre y los líquidos tisulares es del orden de 1 mm, mientras que la concentración citosólica en una célula en reposo está más cerca de 100 nm veces más baja que la concentración extracelular. Esta diferencia es mantenida por un sistema de bombas de membrana eficiente (aunque costoso desde el punto de vista energético). Además, hay reservas de a 2+ en concentración más alta dentro de vesículas intracelulares asociadas

12 76 s e c c i ó n I Introducción H H H H Fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (I 2 ) Fosfolipasa H H + H 2 3 H H Diacilglicerol (DAG) (ermanece asociado con la membrana) Inositol 1,4,5-trifosfato (I 3 ) Entra al citoplasma e induce la liberación de ion a 2+ a partir de vesículas del ER FigurA 3-12 El I 2 puede ser hidrolizado por la L para crear DAG e I 3. con el retículo endoplasmático y las mitocondrias. Así, cualquier evento de señalización que abre canales en la membrana del retículo endoplasmático, o en la membrana plasmática, y que permite el flujo libre de iones a 2+ hacia el citoplasma, facilita un aumento rápido de la concentración citoplasmática de ion a 2+. La ubiquitinación puede inhibir la transducción de señal o aumentarla La proteína ubiquitina es una proteína monomérica pequeña, de 76 residuos, altamente conservada. La unión del carboxilo terminal de la ubiquitina a residuos de lisina de proteínas blanco a) b) a 2+ a 2+ almodulina a 2+ 1 La calmodulina se une a iones a NH 3 H a 2+ omplejo de calciocalmodulina 2 La calmodulina cambia de conformación, y se hace activa. roteína blanco itio de unión a calmodulina 3 La calmodulina se une a una proteína blanco. FigurA 3-13 La proteína reguladora de la unión de calcio calmodulina pasa por un cambio conformacional en el momento de unión a calcio, que le permite unirse a otras proteínas y activarlas. [arte a) DB ID 3LN.]

13 Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T a p í t u l o 3 77 a menudo va seguida por polimerización de una cadena de ubiquitinas sobre residuos de lisina seleccionados de la ubiquitina conjugada; esto da lugar a poliubiquitinación de la proteína blanco. La monoubiquitinación o la poliubiquitinación casi siempre sirve como un mecanismo mediante el cual las proteínas marcadas son establecidas como objetivo para destrucción por el proteasoma de la célula. Empero, se sabe que la ubiquitinación en ciertos residuos de proteínas también sirve como una señal activadora y esta función alternativa de la ubiquitina se abordará más adelante conforme se describa la activación del factor de transcripción NF-κB, así como en los capítulos 4 y 5. Vías de señalización que se encuentran con frecuencia El análisis de las rutas bioquímicas mediante las cuales las señales moleculares pasan desde receptores de superficie celular hacia el interior de la célula ha revelado que algunas vías de transducción de señal se utilizan repetidas veces en las respuestas celulares a diferentes ligandos. Estas vías se utilizan, de maneras un poco diferentes, en múltiples sistemas celulares y de órganos, y en muchas especies. El resultado final de casi todas estas vías es una alteración del programa de transcripción de la célula. Aquí se describen brevemente tres de esas vías de particular importancia para el sistema inmunitario adaptativo (figura 3-5, erspectiva general). ada una de estas vías es desencadenada por unión de antígeno al receptor, y conduce a la activación de una familia de factores de transcripción diferente. La generación de estos factores de transcripción activos a su vez inicia la regulación ascendente de una cascada de genes que tienen importancia para la respuesta inmunitaria, incluso los que codifican para citocinas, anticuerpos, factores de supervivencia y señales proliferativas. i bien el marco conceptual de estas vías de emisión de señales es compartido entre muchos tipos de células, pequeñas modificaciones en los intermediarios moleculares y factores de transcripción involucrados permiten que haya variaciones de las identidades de los genes controlados por señales particulares, y que haya mecanismos de control de la transcripción específicos para tipo de célula. or ejemplo, la enzima plc existe en diferentes formas; la Lγ1 se usa en células T, y la Lγ2 en células B. De modo similar, la familia de factores de transcripción factor nuclear de células T activadas (Nuclear Factor of Activated T cells [nfat]) incluye cinco miembros, algunos de los cuales son expresados como variantes empalmadas de manera diferencial y cada uno de los cuales es afectado por disposiciones diferentes de señales moleculares. Además, la activación de la transcripción desde algunos promotores requiere la unión de múltiples factores de transcripción. or ejemplo, la expresión completa del gen que codifica para la interleucina-2 (IL-2) requiere la unión de A-1, NF-κB y nfat, además de varios otros factores de transcripción, al promotor de interleucina. De esta manera, el promotor puede estar parcialmente activado en presencia de algunos de estos factores de transcripción, pero no está por completo activo sino hasta que todos ellos están en su sitio. La sección que sigue se centra en los principios generales que rigen el control de estas tres vías, desde la recepción de una señal de antígeno, hasta la activación de un tipo particular de factor de transcripción. La vía de la plc induce liberación de calcio y activación de pkc Los elementos esenciales de esta vía se presentaron en la exposición sobre las enzimas que modulan el I 2 en el momento de la activación celular (figura 3-12), y ahora se sabe que la plc desintegra la I 2 hacia I 3 y dag; sin embargo, de qué modo la plc queda activada en primer lugar? Aquí se usan células T como ejemplo. omo se mencionó, las células T usan la forma Lγ1 de la enzima. En el momento de la estimulación por antígeno, la fosforilación de tirosina de los residuos de itam del complejo asociado a receptor D3 da lugar a la localización de la proteína adaptadora lat a la membrana (figura 3-14). La lat a su vez es fosforilada, y la Lγ1 a continuación se une a lat fosforilada; esta unión asegura que la Lγ1 se localice a la membrana I 3 Itk almodulina (inactiva) itoplasma D4 Núcleo Lck TR/D3 Retículo endoplasmático a 2+ Lγ1 NFAT NFAT I 2 DAG FigurA 3-14 La activación de la calcineurina por unión del complejo de calcio-calmodulina induce la desfosforilación de nfat y la entrada del mismo al núcleo. almodulina (activa) LAT I 3 alcineurina Activación de factor de transcripción

14 78 s e c c i ó n I Introducción celular, el sitio de su sustrato, I 2. Una vez ubicada en la membrana plasmática, la Lγ1 es más activada por fosforilación de tirosina mediada por la cinasa activada por receptor, Lck, así como por una segunda tirosina cinasa, Itk. La Lγ1 fosforilada y activada a continuación media la división de I 2 hacia I 3 y dag, como se describió. De qué modo estos mediadores secundarios funcionan a continuación para desencadenar la activación de linfocitos? Los iones calcio, liberados a partir de reservas intracelulares de I 3, se unen al intermediario emisor de señales, calmodulina. ada mo lécula de calmodulina se une a cuatro iones calcio, unión que da lugar a una profunda alteración de su conformación (figura 3-13). El complejo de calcio-calmodulina a continuación se une a, y activa, la fosfatasa calcineurina, que desfosforila el factor de transcripción nfat (figura 3-14). Esta desfosforilación induce un cambio conformacional en nfat, que revela una secuencia de localización nuclear, que dirige el nfat para que entre al núcleo y active la transcripción de varios genes blanco importantes de célula T. Los genes activados por la unión a nfat comprenden los que codifican para interleucina-2, una citocina que tiene importancia fundamental en el control de la proliferación de células T. La importancia de la vía de la Lγ1 para la activación de células T es ilustrada por los profundos efectos inmunosupresores del fármaco ciclosporina, que se usa para tratar tanto enfermedad autoinmunitaria mediada por células T como rechazo de trasplante de órgano. En las células T, la ciclosporina se une a la proteína ciclofilina (inmunofilina), y el complejo de ciclosporina/ciclofilina se une a la calcineurina y la inhibe, lo que suspende con eficacia la proliferación de células T. La división de I 2 por plc es una estrategia de emisión de señales en particular eficiente porque ambos productos de la desintegración del I 2 son activos en eventos celulares subsiguientes. El dag, el segundo producto de la desintegración del I 2 (figura 3-12), permanece en la membrana, donde se une a enzimas de la familia de la proteína cinasa (pkc) y las activa. Estas cinasas son serina/treonina cinasas activas en diversas vías de señalización. La proteína cinasa θ, importante en la señalización de células T, sólo requiere unión de dag, mientras que su pariente, la proteína cinasa, también debe unirse a iones a 2+ para quedar activada por completo. El dag también está implicado en la vía Ras (que se describe en la sección siguiente). La cascada de Ras/Map cinasa activa la transcripción por medio de A-1 La vía de emisión de señales Ras se descubrió inicialmente después de que se encontró que una forma viral mutada de la proteína Ras induce cáncer en un modelo de rata. La Ras es una proteína de unión a gtp, monomérica (que se abrevia proteína G). uando Ras se une a gtp, su conformación cambia hacia un estado activo, en el cual es capaz de unirse a varias serina/ treonina cinasas, y de activarlas. Empero, la proteína Ras posee una actividad de GTasa intrínseca que hidroliza gtp hacia gdp, y la forma Ras-gdp de la proteína es incapaz de transmitir una señal positiva a cinasas torrente abajo (figura 3-15); por ende, la activación de la vía Ras depende de la capacidad para mantener Ras en su estado unido a gtp. La modulación entre la forma unida a gtp, activa, y la forma unida a gdp, inactiva, es desencadenada por dos familias de enzimas. Los factores de intercambio de guanina-nucleótido (gef) activan Ras al indu- Inactiva Factores de intercambio de nucleótido guanina (GEF) GD GT i GD Activa GT roteínas activadoras de GTasa (GA) FigurA 3-15 roteínas G monoméricas pequeñas, como Ras, alteran la conformación dependiendo de si están unidas a gtp o gdp. La forma unida a gdp de proteínas G pequeñas, como Ras (verde pálido), es inactiva, y la forma unida a gtp (verde oscuro) es activa. Las proteínas G pequeñas tienen actividad de GTasa intrínseca, que es aumentada por las roteínas Activadoras de GTasa (GTase activating proteins [gap]). Los factores de intercambio de nucleótido guanina (guanine nucleotide exchange factors [gef ]) actúan de una manera opuesta para liberar gdp y promover la unión de gtp. cirla a liberar gdp y aceptar gtp; las proteínas activadoras de GTasa (GTase Activating roteins [gap]) inhiben la actividad de proteína al estimular la habilidad intrínseca de Ras para hidrolizar gtp unido. Al igual que la vía Lγ, la vía Ras es iniciada durante activación de linfocitos tanto B como T y, de nuevo, se usarán las células T como ejemplo. El dag, liberado después de división de I 2 mediada por Lγ1, se une a, y activa, Ras-GR, una proteína adaptadora que a continuación recluta el gef, on of evenless (sos). sos se une a Ras, y la induce para que se una a gtp, momento en el cual Ras adquiere la capacidad para unirse a, y activar, el primer miembro de una cascada de enzimas serina/treonina cinasa que se fosforilan y activan una a la otra. Dado que los miembros de esta cascada se identificaron por vez primera en experimentos en los que se estudió la activación de células por mitógenos (agentes que inducen proliferación), se denominan la cascada de proteína cinasa activada por mitógeno (Mitogen Activated rotein Kinase) o de map cinasa. Los miembros de la cascada son mantenidos en estrecha proximidad uno a otro mediante la proteína adaptadora ksr. En la forma de esta cascada de activación de célula T (figura 3-16), RasGT se une a la map cinasa cinasa cinasa (mapkkk) Raf. La unión de RasGT altera la conformación de Raf y estimula su actividad de serina/treonina cinasa. A continuación Raf fosforila y activa la siguiente enzima en el relevo, una map cinasa cinasa (mapkk). En este caso mek. mek activada a continuación fosforila su sustrato, la cinasa relacionada con señal extracelular (Extracellular signal-related Kinase) o Erk, una map cinasa, que en consecuencia adquiere la capacidad para pasar a través de la membrana nuclear. Una vez dentro del núcleo, Erk fosforila y activa un factor de transcripción, Elk-1, que coopera con una segunda proteína, el factor de respuesta sérica (srf), para activar la transcripción del gen fos. La proteína Fos también es fosforilada por Erk, y junto con su pareja, Jun, forma el factor de transcripción maestro, A-1. Jun es fosforilada y activada por medio de una forma un poco diferente de la vía de la map cinasa. A-1 es otro de los factores de transcripción que facilita la transcripción del gen que codifica para IL-2.

15 Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T a p í t u l o 3 79 eñales mediadas por TR TR/D3 DAG i GD (inactiva) GT Ras-GR DAG GT GD K (activa) Raf (MAKKK) MEK (MAKK) ERK (MAK) ascada de MA cinasa omplejo de TAK1 arma-1 Bcl10 MALT1 TRAF6 itoplasma Núcleo Elk-1 NEM Ub IKK IKK RF Activación de gen Fos Fos Vía de NF-κB NF- B I B Ub itoplasma Jun NF- B Activación de gen Núcleo Jun Fos A-1 Activación de gen 5 3 FigurA 3-17 La fosforilación y ubiquitinación activa IKK, que fosforila IκB y lo desactiva, lo que permite la translocación de NF-κB hacia el núcleo. FigurA 3-16 La vía Ras involucra una cascada de fosforilaciones de serina/treonina, y culmina en la entrada de la map cinasa, Erk, al núcleo, donde fosforila los factores de transcripción Elk-1 y Fos. La vía Ras es un componente de importancia de muchos programas vinculados con el desarrollo, y de activación celular. ada vía usa combinaciones un poco diferentes de proteínas ci nasas torrente abajo, pero todas se apegan al mismo modo general de pasar la señal desde la superficie celular hacia el núcleo por medio de una cascada de reacciones de fosforilación, con la activación resultante de un nuevo programa de transcripción. La pkc activa el factor de transcripción NF-κB El NF-κB pertenece a una familia de factores de transcripción heterodiméricos, y cada dímero activa su propio repertorio de promotores. En las células en reposo, heterodímeros de NF-κB son mantenidos en el citoplasma mediante unión a la proteína Inhibidor de NF-κB (IκB). La activación celular induce la fosforilación de estas proteínas inhibidoras mediante un complejo de IκB cinasa (IKK). La proteína IκB fosforilada a continuación es establecida como objetivo para degradación proteosomal, lo que libera el NF-κB para que entre al núcleo y se una a los promotores de una amplia gama de genes importantes desde el punto de vista inmunitario. NF-κB es importante en el control de la transcripción de proteínas necesarias para el funcionamiento apropiado de muchos tipos de células de los sistemas inmunitarios innato y adaptativo; en general, la transcripción mediada por NF-κB está asociada con eventos proinflamatorios y de activación, más que con procesos reguladores. Diferentes tipos de células y receptores usan diversas formas de activación de proteína cinasa, así como diversas combinaciones de moléculas adaptadoras en la vía que llevan a la activación de NF-κB. on todo, todas estas vías culminan en la fosforilación y la destrucción subsiguiente del inhibidor de NF-κB, IκB. A continuación se describe la vía de activación de NF-κB que es desencadenada por el reconocimiento de antígeno por tcr.

16 80 s e c c i ó n I Introducción En las células T, la activación de NF-κB empieza cuando el dag, generado por Lγ1, recluta la serina/treonina cinasa K a la membrana (figura 3-17). omo se mencionó, Kθ es la forma de la serina/treonina cinasa que se usa en la vía de emisión de señales de receptor de célula T. Una vez unida a dag, la Kθ es activada y fosforila proteínas adaptadoras, incluso arma1, que inician una cascada que finalmente recluta la ubiquitina ligasa TRAF6. TRAF6 ubiquitina y activa parcialmente el complejo ikk, que está constituido de la proteína reguladora nemo, y dos subunidades ikk catalíticas. El complejo ikk sólo es activado por completo cuando está fosforilado y ubiquitinado. (Note que éste es uno de los casos en los cuales la ubiquitinación no da lugar a degradación subsiguiente de proteína, sino más bien a su activación.) tras señales mediadas por células T activan el complejo TAK1, que fosforila ikk, lo que completa su activación y permite que fosforile IκB. En este paso, la fosforilación de IκB emite señales para su degradación, más que para su activación. NF-κB a continuación está libre para moverse hacia el núcleo y activar la transcripción de sus genes blanco, incluso el gen que codifica para IL-2. Además de esta vía de activación de NF-κB mediada por receptor de célula T, la señalización por medio de D28, el correceptor de célula T, también ejerce control positivo de la activación de NF-κB en células T. Estas tres vías juntas ilustran cómo los conceptos amplios antes introducidos en este capítulo pueden aplicarse a entender los mecanismos que subyacen la activación de células T; estos temas recurren en muchas formas en todo el sistema inmunitario. La estructura de los anticuerpos Una vez esbozados algunos de los conceptos generales que constituyen la base de muchas diferentes interacciones receptor-ligando y vías de señalización, ahora se centrará la atención de manera más específica en los receptores de antígeno del sistema inmunitario adaptativo. En el momento de la estimulación con antígeno, las células B secretan anticuerpos que tienen sitios de unión a antígeno idénticos a los que están en el receptor de antígeno de la membrana de célula B. La identidad entre los sitios de unión del anticuerpo secretado y el Receptor de élula B (BR) unido a membrana se demostró por vez primera al sintetizar reactivos que se unieron a anticuerpos secretados por una clona de células B particular, y mostrar que esos reactivos también se unieron a los receptores sobre las células que habían secretado los anticuerpos. Dado que trabajar con proteínas solubles es significativamente más fácil que manipular proteínas receptoras de membrana, la presencia de una forma soluble del receptor facilitó mucho la caracterización de la estructura del receptor de célula B. En consecuencia, los aspectos de bioquímica básica del receptor de célula B se establecieron mucho tiempo antes que los del Receptor de élula T (TR) que, a diferencia del bcr, no se libera en una forma secretada. El recuadro 3-1, Experimento clásico, detalla los experimentos ganadores del remio Nobel que establecieron la estructura de cuatro cadenas de la molécula de anticuerpo. Esta sección empieza con una exposición de la estructura de anticuerpos, y después se describe el receptor de membrana de célula B y sus vías de señalización asociadas. Los anticuerpos secretados y sus formas de receptor unidas a membrana pertenecen a la familia de proteínas inmunoglobulina. Esta familia grande de proteínas, que incluye receptores tanto de célula B como de célula T, moléculas de adhesión, algunas tirosina cinasas y otros receptores inmunitarios, se ca - racteriza por la presencia de uno o más dominios de inmuno - globulina. Los anticuerpos están constituidos de múltiples dominios de inmunoglobulina El dominio de inmunoglobulina (figura 3-18) se genera cuando una cadena polipeptídica se pliega hacia una serie organizada de cadenas con plegamiento β paralelas. Dentro de cada dominio, las cadenas β están dispuestas hacia un par de láminas β que forman un dominio terciario, compacto. El número de cadenas por cada lámina varía entre proteínas individuales. En moléculas de anticuerpo, casi todos los dominios de inmunoglobulina contienen aproximadamente 110 aminoácidos, y cada lámina β contiene de tres a cinco cadenas. El par de láminas β dentro de cada dominio son estabilizadas una respecto a la otra por medio de un enlace disulfuro intracadena. Los dominios vecinos están conectados uno a otro por medio de un tramo de cadena polipeptídica relativamente no estructurada. Dentro de las cadenas β, aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos alternan, y sus cadenas laterales están orientadas en posición perpendicular al plano de la lámina. Los aminoácidos hidrofóbicos sobre una lámina están orientados hacia la lámina opuesta y, por ende, las dos láminas dentro de cada dominio son estabilizadas por interacciones hidrofóbicas entre las dos láminas, así como por el enlace disulfuro covalente. El plegamiento de inmunoglobulina proporciona un ejemplo perfecto de cómo la estructura determina la función, o la facilita, o ambas cosas. En los extremos de cada una de las láminas β, regiones polipeptídicas que muestran plegamiento más laxo enlazan una cadena β a la siguiente, y estas regiones laxamente plegadas pueden dar cabida a diversas longitudes y estructuras de cadena lateral de aminoácidos sin causar alteración alguna de la estructura general de la molécula. or ende, en la molécula de anticuerpo, el plegamiento de inmunoglobulina está muy bien adaptado para proporcionar un andamio único en el cual pueden construirse múltiples sitios de unión diferentes, puesto que los sitios de unión a antígeno pueden simplemente integrarse hacia estas regiones laxamente plegadas de los dominios de unión a antígeno. Estas propiedades explican por qué el dominio de inmunoglobulina se ha usado en tantas proteínas con funciones de reconocimiento o de adhesión. La estructura del dominio esencial proporciona un esqueleto molecular, mientras que las regiones laxamente plegadas se pueden adaptar para que se unan de manera específica a muchas estructuras adhesivas o antigénicas. De hecho, la estructura del dominio de inmunoglobulina es usada por muchas proteínas además de las cadenas de bcr. El receptor de célula T también está constituido de unidades repetitivas del dominio de inmunoglobulina (véase más adelante). tras proteínas en las que se utilizan dominios de inmunoglobulina comprenden receptores Fc; las proteínas accesorias del receptor de célula T D2, D4, D8 y D28; las proteínas asociadas a receptor tanto del tcr como del bcr; moléculas de adhesión, y otras. En la figura 3-19 se ilustran algunas de estas proteínas que contienen dominio de inmunoglobulina. ada

17 Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T a p í t u l o 3 81 a) adenas β Dominio L Dominio V L Asas H Enlace disulfuro NH 2 DR b) rdenamiento de cadena β H H NH 2 NH 2 DR FigurA 3-18 Diagrama de la estructura plegada de inmunoglobulina de los dominios de región variable (V L ) y constante ( L ) de la cadena ligera de anticuerpo. a) Las dos láminas con plegamiento β en cada dominio son mantenidas juntas por interacciones hidrofóbicas y el enlace disulfuro conservado. Las cadenas β que componen cada lámina se muestran en colores diferentes. Las tres asas de cada dominio variable muestran considerable variación de longitud y secuencia de aminoácidos; estas regiones hipervariables (azul) constituyen el sitio de unión a antígeno. Las regiones hipervariables por lo general se llaman regiones determinantes de la complementariedad (cdr). Los dominios de cadena pesada tienen la misma estructura característica. b) Las láminas con plegamiento β están abiertas para revelar la relación de las cadenas β individuales y las asas de unión. Note que el dominio variable contiene dos cadenas β más que el dominio constante. [arte a) adaptada de M. chiffer et al., 1973, Biochemistry 12:4620; reimpreso con autorización; parte b) adaptada de A.F. Williams y A.N. Barclay, 1988, Annual Review of Immunology 6:381.] una de estas proteínas es clasificada como un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina, un término que se usa para denotar proteínas derivadas de un gen primordial común que codifica para la estructura del dominio básica. Los anticuerpos comparten una estructura de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas Todos los anticuerpos comparten una estructura de cuatro cadenas polipeptídicas (figura 3-20), que consta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (heavy [H]) también idénticas. ada cadena ligera está unida a su cadena pesada pareja mediante un enlace disulfuro entre residuos de cisteína correspondientes, así como por interacciones no covalentes entre los dominios V H y V L y los dominios H 1 y L. Estos enlaces permiten la formación de un heterodímero estrechamente asociado (H-L). Múltiples puentes disulfuro enlazan juntas las dos cadenas pesadas a alrededor de la mitad de su longitud, y las partes terminal de las dos cadenas pesadas también participan en interacciones de enlace no covalente entre dominios correspondientes. La molécula de anticuerpo forma una Y, con dos regiones de unión a antígeno en los extremos de la Y (figura 3-21). ada región de unión a antígeno está constituida de aminoácidos derivados de los dominios amino terminal de las cadenas tanto pesada como ligera. Las cadenas tanto pesada como ligera contribuyen con dos dominios a cada extremo de la Y; el dominio no de unión a antígeno de cada cadena sirve para extender el extremo de unión a antígeno. La base de la Y consta de los dominios terminal de la cadena pesada de anticuerpo.

18 experimento clásico La elucidación de la estructura de anticuerpo Los experimentos en los que se identificó por vez primera a los anticuerpos como inmunoglobulinas séricas y después se ca - racterizó su estructura de cuatro cadenas familiar, representan algunas de las mejores adaptaciones de la química de proteína al - guna vez usadas para resolver un problema biológico. rimer grupo de experimentos Arne Tiselius, ers ederson, Michael Heidelberger y Elvin Kabat Desde finales del siglo xix se ha sabido que los anticuerpos residen en el suero sanguíneo, es decir, en el componente de la sangre que queda una vez que se han eliminado células y proteínas de la coagulación. Em - pero, la naturaleza química de esos anticuerpos permaneció como un misterio hasta que Tiselius y ederson de uecia, y Heidelberger y Kabat, en Estados Unidos, hicieron sus experimentos, publicados en Hi - cieron uso del hecho de que, cuando los anticuerpos reaccionan con un antígeno proteínico multivalente, forman un comple jo multimolecular con enlaces covalentes que salen de la solución. Este proceso se conoce como inmunoprecipitación (véanse en el capítulo 20 los usos modernos de esta técnica). Inmunizaron conejos con la proteína ovoalbúmina (el principal componente de las yemas de huevo), extrajeron sangre de los conejos para obtener un antisuero antiovoalbúmina, y después dividieron su antisuero en dos alícuotas. ujetaron la primera alícuota a electroforesis y midieron la cantidad de proteína que avanzó distancias di - ferentes desde el origen en un campo eléctrico. El gráfico azul en la figura 1 describe las cuatro subpoblaciones de proteínas principales resueltas mediante su técnica. La primera y la de mayor tamaño es el pico de albúmina, la proteína más abundante en el suero, que se encarga de transportar lípidos en la sangre. Nombraron a los otros picos globulinas. Dos picos de menor tamaño están denotados como los picos de globulina α y β, y después un tercer pico de globulina, la globulina gamma, claramente representa un grupo de proteínas en concentración alta en el suero. on todo, la parte más notable del experimento ocurrió cuando los investigadores mezclaron su segunda alícuota del suero con ovoalbúmina, el antígeno. Los anticuerpos en el suero se unieron a la ovoalbúmina en un complejo multivalente, que salió de la solución y se precipitó. A continuación el precipitado se extrajo mediante centrifugación. Ahora que habían logrado eliminar los anticuerpos de un antisuero, la pregunta fue qué pico de proteína quedaría afectado? El gráfico de color negro en la figura 1 ilustra sus resultados. e perdió muy poca proteína de los picos de albúmina o de globulina α o β. Aun así, la inmunoprecipitación dio lugar a un decremento notorio del tamaño del pico de globulina γ, lo que de - mostró que casi todos sus anticuerpos antiovoalbúmina podían clasificarse como glo - bulinas γ. Ahora se sabe que casi todos los anticuerpos de la clase IgG de hecho se encuentran en la clase de globulina γ. No obstante, se encuentran anticuerpos de otras clases en los picos de globulina α y β, lo cual puede explicar el decremento leve de la concentración de proteína que se encontró después de inmunoprecipitación en estos otros picos de proteína. egundo grupo de experimentos ir Rodney orter, Gerald Edelman y Alfred Nisonoff onocer la clase de proteína sérica en la cual caen los anticuerpos fue un inicio, pero los inmunoquímicos a continuación necesita- Absorbancia + Albúmina α ron averiguar qué aspecto tenían los anticuerpos. El hecho de que podían formar complejos multivalentes precipitables sugirió que cada anticuerpo tenía la capacidad de unión a más de un sitio en un antígeno multivalente. in embargo, los científicos aún desconocían cómo muchas cadenas polipeptídicas constituyen una molécula de anticuerpo, y cómo muchos sitios de unión a antígeno estuvieron presentes en cada mo lécula. Dos líneas de experimentación llevadas a cabo en un marco de tiempo similar en ambos lados del Atlántico se combinaron para proporcionar las respuestas a estas dos preguntas. Experimentos de ultracentrifugación habían colocado el peso molecular de las moléculas de anticuerpos IgG en aproximadamente daltones. La digestión de IgG con la enzima papaína produjo tres fragmentos, dos de los cuales fueron idénticos, y un tercero que fue claramente distinto (figura 2). El tercer fragmento, de aproximadamente daltones, formó de manera espontánea cristales y, por ende, se nombró el fragmento cristalizable, o Fc. Al demostrar que podían inhibir de manera competitiva la unión de anticuerpos a su antígeno, se mostró que los otros dos fragmentos retienen la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo original. or ende, estos fragmentos se nombraron Fab, o fragmento de unión a Globulinas Distancia de migración FigurA 1 Demostración experimental de que casi todos los anticuerpos están en la fracción de globulina γ de las proteínas séricas. Después de que se inmunizó a conejos con ovoalbúmina (ova), sus antisueros se combinaron y se procesaron con electroforesis, que separó las proteínas séricas de acuerdo con su carga eléctrica y masa. La línea azul muestra el patrón electroforético de antisuero no tratado. La línea negra muestra el patrón de antisuero que se incubó primero con ova para eliminar anticuerpos anti-ova, y después quedó sujeto a electroforesis. [Adaptado de A. Tiselius and E. A. Kabat, 1939, Journal of Experimental Medicine 69:119, con permiso de copyright de Rockefeller University ress.] β γ 82

19 REUADR 3-1 antígeno (Fragment antigen binding). Este experimento indicó que una molécula de an ticuerpo única contenía dos sitios de unión a antígeno y una tercera parte de la molécula que no participaba en la reacción de unión. El uso de otra enzima proteolítica, la pepsina, dio lugar a la formación de un fragmento único de daltones, que contuvo dos sitios de unión a antígeno que aún fueron mantenidos juntos en una molécula bivalente. uesto que la molécula actuó como si contuviera dos fragmentos Fab, pero claramente tuvo un componente adicional que facilitó la combinación de los dos fragmentos hacia una molécula, se nombró F(ab ) 2. La digestión con pepsina no da lugar a un fragmento Fc recuperable, puesto que al parecer lo digiere hacia fragmentos más pequeños. Empero, F(ab ) 2 derivados de anticuerpos se usan a menudo en experimentos en los cuales los científicos desean evitar artefactos originados por la unión de anticuerpos a receptores Fc sobre superficies celulares. En el segundo grupo de experimentos, los investigadores redujeron la molécula de IgG entera usando β-mercaptoetanol, a fin de romper enlaces disulfuro, y produjeron alquilación del producto reducido de modo que los enlaces disulfuro no podían volver a formarse de manera espontánea. A continuación usaron una técnica llamada filtración en gel para separar y medir el tamaño de los fragmentos de proteína generados mediante esta reducción y alquilación. (En la actualidad se usarían geles sds page para hacer este experimento.) De esta manera, se demostró que cada molécula de IgG contenía dos cadenas pesadas, con peso molecular (mw) de y dos cadenas ligeras, con mw de Ahora el desafío fue combinar los resultados de estos experimentos para crear un modelo consistente de la molécula de anticuerpo. ara hacer esto, los científicos tuvieron que determinar cuál de las cadenas estaba implicada en la unión a antígeno, y cuál cadena contribuía a los fragmentos cristalizables. Los inmunólogos a menudo usan medios inmunológicos para responder sus preguntas y ésta no fue la excepción. Eligieron usar fragmentos Fab y Fc purificados a partir de anticuerpos IgG de conejo para inmunizar dos cabras. A partir de estas cabras, generaron anticuerpos anti-fab y anti-fc, que hicieron reaccionar, en experimentos separados, con las cadenas pesada y ligera provenientes de los experimentos de reducción y alquilación. La respuesta fue inmediatamente clara. Los anticuerpos anti-fab se unieron a cadenas tanto pesadas como ligeras y, por ende, el sitio de unión a antígeno de la IgG original de conejo estuvo formado de componentes de cadenas tanto pesada como ligera. on todo, los anticuerpos anti-fc sólo se unieron a las cadenas pesadas, pero no a las cadenas ligeras de la molécula de IgG, lo que demostró que la parte Fc de la molécula sólo estaba constituida de cadenas pesadas. or último, experimentos de química de proteína cuidadosos demostraron que los aminos terminales de las dos cadenas residían en la porción Fab de la molécula. De esta manera, la estructura de cuatro cadenas familiar, con los sitios de unión en los aminos terminales de los pares de cadenas pesadas y ligeras, se dedujo a partir de algunos experimentos clásicos muy bien realizados. En 1972 se otorgó el remio Nobel en Fisiología y Medicina a sir Rodney orter y adena H Digestión con pepsina Digestión con papaína Fab Fab Enlaces disulfuro Fc Gerald Edelman por su trabajo en el descubrimiento de la estructura de las inmunoglobulinas. Edelman, G.M., B.A. unningham, W.E. Gall,.D. Gottlieb, U. Rutishauser, y M.J. Waxdal The covalent structure of an entire gammag immunoglobulin molecule. roceedings of the National Academy of ciences of the United tates of America 63: Fleishman, J., B., R.H. ain, y R.R. orter ep. Reduction of gamma-globulins. Archives of Biochemistry and Biophysics uppl 1: Heidelberger, M., y K.. edersen The molecular weight of antibodies. The Journal of Experimental Medicine 65: Nisonoff, A., F.. Wissler, y L.N. Lipman roperties of the major component of a peptic digest of rabbit antibody. cience 132: orter, R.R. (1972). Lecture for the Nobel rize for physiology or medicine 1972: tructural studies of immunoglobulins. candinavian Journal of Immunology 34(4): Tiselius, A., y E.A. Kabat An electrophoretic study of immune sera and purified antibody preparations. The Journal of Experimental Medicine 69: adena L H F(ab') 2 + Fragmentos Fc Reducción con mercaptoetanol adenas H adenas L FigurA 2 Estructura prototipo de IgG, que muestra la estructura de cadena y los enlaces disulfuro intercadena. e indican los fragmentos producidos por digestión enzimática con pepsina o papaína, o mediante división de los enlaces disulfuro con mercaptoetanol. Las cadenas ligeras (L) están en azul claro y las cadenas pesadas (H) están en azul oscuro. H H H H H H H 83

20 84 s e c c i ó n I Introducción Heterodímero Ig-α/Ig-β V Inmunoglobulina (IgM) V V H V Receptor de célula T V V lase I Moléculas del MH lase II α β β 2 microglobulina Moléculas de adhesión VAM-1 roteínas accesorias de célula T D4 Receptor poli-ig V IAM-1 D64 V V Fcγ RI D2 D3 V IAM-2 LFA 3 γ δ ε V D8 V V V γ γ FigurA 3-19 Algunos ejemplos de proteínas que portan dominios de inmunoglobulina. ada dominio de inmunoglobulina se representa mediante un asa azul y, cuando es importante, está marcado como variable (V) o constante (). La figura 3-21 muestra que la estructura general de la molécula de anticuerpo consta de tres regiones relativamente compactas unidas por una región bisagra más flexible. La re - gión bisagra es en particular susceptible a división proteolítica por la enzima papaína. La división con papaína resuelve la molécu la de anticuerpo hacia dos fragmentos idénticos que retienen la especificidad de unión a antígeno (antigen-binding) del anticuerpo original (que se muestra como las regiones Fab en la figura 3-21), y la región restante de la molécula, que consta de la porción no de unión a antígeno. Esta última región, que es idéntica para todos los anticuerpos de una clase dada, se cristaliza fácilmente y, así, se llama la región Fc (fragmento cristalizable). ada región Fab y región Fc de los anticuerpos media sus propias funciones particulares durante una respuesta de anticuerpos a un antígeno. Las regiones Fab se unen al antígeno, y la región Fc del anticuerpo unido a antígeno se une a los receptores Fc sobre células fagocíticas o citolíticas, o a moléculas efectoras inmunitarias. De esta manera, los anticuerpos sirven como puentes fisiológicos entre un antígeno presente en un agente patógeno, y las células o moléculas que finalmente lo destruirán. Hay una familia de receptores Fc; cada receptor Fc se expresa sobre una gama distinta de células, y se une a una clase diferente de anticuerpos.