DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ISO- -ÁCIDOS PRESENTES EN LA CERVEZA LAGER MEDIANTE VOLTAMPEROMETRÍA DE REDISOLUCIÓN CATÓDICA

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1 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ISO- -ÁCIDOS PRESENTES EN LA CERVEZA LAGER MEDIANTE VOLTAMPEROMETRÍA DE REDISOLUCIÓN CATÓDICA Caballero I.*, Blanco C.A., Sancho D. Departamento de Ingeniería Agrícola y Forestal (Área de Tecnología de los Alimentos). ETS Ingenierías Agrarias, Universidad de Valladolid, Avda. Madrid s/n, Palencia, España icaballe@iaf.uva.es Palabras clave: Cerveza, amargor, métodos electroquímicos. RESUMEN La cerveza es una de las bebidas alcohólicas más antiguas conocidas. Es una bebida fermentada elaborada con malta y aromatizada con lúpulo. Durante el proceso de elaboración de la cerveza, los -ácidos presentes en el lúpulo se transforman en iso- ácidos, responsables del sabor amargo de la cerveza. Estos iso- -ácidos y sus variantes modificadas químicamente juegan un papel importante en la calidad de la cerveza. En los últimos años los métodos de voltamperometría de redisolución han sido muy utilizados en el análisis de alimentos, debido a que son técnicas muy adecuadas, versátiles y rápidas para la determinación de metales y otros compuestos, como los iso- -ácidos, en matrices complejas, eliminando la posible contaminación de la muestra y la pérdida de analitos. Al mismo tiempo, esta técnica presenta una alta sensibilidad llegando a detectar ppb. En este trabajo se ha determinado la concentración de iso- -ácidos presentes en cerveza mediante Voltamperometría de Redisolución Catódica (CSV), para lo cual se han analizado 15 cervezas comerciales (negras, rubias y sin alcohol). Los resultados obtenidos han puesto de manifiesto que el contenido de iso- -ácidos en las cervezas analizadas varía ente y ppm. De los resultados obtenidos se puede concluir que la técnica CSV resulta válida para determinar la concentración de iso- -ácidos en cervezas lager. INTRODUCCIÓN La cerveza es una de las bebidas alcohólicas más antiguas conocidas. Es una bebida fermentada elaborada con malta y aromatizada con lúpulo (Llario et al., 2006). Durante el proceso de elaboración de la cerveza, los α-ácidos, inicialmente insolubles son isomerizados en la etapa de cocción del mosto, y convertidos en iso-α-ácidos solubles, que son los responsables del amargor de la cerveza terminada (De Cooman et al., 2000). El término iso- -ácidos comprende una mezcla de 6 compuestos diferentes isocohumulonas, isohumulonas and isoadhumulonas en sus formas cis- y trans-. (Figure 1). Figura1. Estructura de la humulona y sus isómeros cis y trans

2 La concentración de iso -ácidos presente en la cerveza depende de varios factores como son; la variedad de lúpulo elegida, la cantidad de lúpulo utilizada y las condiciones empleadas durante la elaboración de la cerveza (Hughes et al., 1996). Los productos del lúpulo usados en cervecería son comercialmente presentados en varias formas, entre las que se encuentran los conos, en polvo, en extractos y en extractos isomerizados. (Lewis and Young, 1995; Moir, 2000). Además de aromatizar y aportar el amargor a la cerveza poseen otras propiedades: - Mejoran la estabilidad de la espuma, debido a que son compuestos muy tensioactivos (Kunimune and Shellhammer 2008). - Inhiben el desarrollo de los microorganismos en la cerveza, aumentando su estabilidad biológica. embargo no es una actividad bacteriostática lo suficientemente grande como para sustituir las medidas necesarias para la conservación del producto (Blanco et al., 2007; Caballero et al., 2009). La voltamperometría de redisolución, tiene el límite de detección más bajo de las técnicas electroanalíticas comúnmente usadas. Las técnicas voltamperométricas de redisolución están basadas en la preconcentración de un analito presente en disolución. La principal ventaja de esta técnica frente al análisis voltamperométrico directo, es la preconcentración de la especie objeto. El análisis electroquímico de redisolución, comprende dos etapas: - Primera etapa: El analito se deposita electroquímicamente sobre el electrodo de gota de mercurio. - Segunda etapa: Tiene lugar una electrólisis inversa, o redisolución, en la cual el analito depositado se retira del electrodo. Cada especie electroquímica se redisuelve a un potencial característico (Hobart et al, 1991). En este estudio se ha determinado la concentración iso-α-ácidos y sus derivados reducidos en muestras comerciales de cervezas lager con y sin alcohol mediante voltamperometría de redisolución catódica. MATERIAL Y MÉTODOS Materiales Baño de ultrasonidos (ELMA Model Transsonic 700/H) para la desgasificación de las muestras de cervezas.ph-metro (CRISON 2002) para la medición del ph.refractómetro (COMECTA, Model C-2) para la medición del grado Brix.El análisis voltamperométrico se ha llevado a cabo con un 746 VA TRACE ANALYZER que consta de dos partes; Metrohm 746 VA Trace Analyzer y Metrohm 747 VA Stand. Se ha utilizado un electrodo estacionario de gota colgante de mercurio (HMDE) como electrodo de trabajo, un electrodo Ag/AgCl, KCl sat como electrodo de de referencia y un electrodo de platino como electrodo auxiliar. Muestras Se analizaron quince cervezas lager comerciales; 6 con alcohol y 9 sin alcohol. Método El análisis se dividió en tres etapas: Preparación de las muestras

3 Las muestras de cervezas seleccionadas, fueron compradas y almacenadas a temperatura de 5,5 ºC en una cámara frigorífica. Dichas muestras fueron codificadas.posteriormente, las cervezas se introdujeron en viales y se midió el ph (mediante un ph-metro), el grado alcohólico (según el método de análisis del B.O.E. 23/10/1985) y el grado Brix (mediante un refractómetro). Las muestras de cerveza fueron desgasificadas en un equipo de ultrasonidos durante 15 minutos para evitar el problema que podría originar la espuma a la hora de realizar las determinaciones. Además, durante el análisis tuvo lugar la eliminación del O 2 disuelto en el agua, antes de la etapa de preconcentración, realizándose una purga durante 10 minutos con un gas inerte (N 2 ), que burbujeaba en la disolución saturándola de dicho gas. Previamente al análisis de las muestras se optimizaron las condiciones de medida mediante la realización de varios ensayos, parar optimizar las medidas sobre las muestras de cervezas sin la interferencia de materia orgánica, ya que en altas concentraciones puede provocar problemas en la determinación de los iso- -ácidos. Estos compuestos orgánicos se adsorben en la superficie del electrodo e impiden la deposición y/o el proceso de redisolución (Carvajal et al., 1991). Optimización de la etapa de medida voltamperométrica La purga con nitrógeno se fijó en 600 segundos en la etapa previa al análisis y 30 segundos entre la realización de las adiciones de disolución estándar de los iso- -ácidos. Se estudió la influencia del tiempo de deposición, el tamaño de gota y el número de adicciones. El volumen total de disolución en la celda de medida fue de 25 ml y las adiciones de patrón iso- -ácidos fue de 100 l. El análisis cuantitativo y la calibración se realizaron mediante el método de las adicciones patrón. Antes de proceder al análisis de las muestras de cerveza se determinó el límite de detección y de cuantificación de los iso-α-ácidos. También se procedió a la validación del método para lo cual se estudió la repetibilidad y la reproducibilidad. Análisis voltamperométrico de las muestras Una vez establecidos todos los parámetros (tiempo de deposición, tamaño de gota y número de adiciones) y los volúmenes de cada reactivo y muestras, se procedió a su análisis de la concentración de iso-α-ácidos mediante voltamperometría de redisolución catódica. Tratamiento estadístico El estudio estadístico de los datos se efectuó mediante el paquete estadístico STATGRAPHICS Plus 5.1. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Determinación de las condiciones óptimas Tiempo de deposición Se realizaron diversas pruebas a diferentes tiempos de deposición (Td) en el intervalo de 30 a 120 segundos. Las condiciones de la disolución fueron: 24 ml de agua ultrapura, 1 ml de disolución tampón, ph=5 y 450 μl de disolución estándar. El tiempo seleccionado fue de 60 segundos ya que se consigue una señal óptima y además un tiempo menor no es aconsejado. La figura 2 muestra la variación de la intensidad con el tiempo de deposición. (Figura 2).

4 Figura 2.- Variación de la intensidad con el tiempo de deposición Volumen solución tampón y ph Se utilizaron tres soluciones diferentes, AcH/AcONa ph=3,12, AcH/AcONa ph=5, KH2PO4/KOH ph=8.04. Las condiciones de la disolución fueron: 24 ml de agua ultrapura y 1 ml de solución tampón. Se realizaron cinco adicciones de disolución patrón de 50µl y otras cinco de100 l. La figura 3 muestra las rectas de calibrado obtenidas para las diferentes disoluciones empleadas. (Figura 3). La disolución tampón utilizada fue la de AcH/AcONa, para determinar el parámetro del ph nos fijamos en el valor de R2 obtenido en la recta de calibrado. Para ph= 5, el valor de R2 es el más cercano a 1, por lo tanto los resultados obtenidos son mejores para este ph. Figura 3.-Líneas de calibración obtenidas para las diferentes soluciones empleadas

5 La tabla 1 muestra un resumen de las condiciones del proceso voltamperométrico previamente optimizado. Posteriormente a la determinación de las condiciones óptimas para la determinación de los iso -ácidos en la cerveza se determinaron los parámetros de calibración, así como los límites de detección y cuantificación I=a+bC, donde I= intensidad relativa C= concentración R 2 = a= b= s y/x (desviación estándar del blanco)= LD (Límite de Detección)= LQ (Límite de Cuantificación)= Tabla 1. Condiciones optimizadas para la medida de iso- -ácidos mediante CSV en cerveza. Tiempo de deposición 60 s ph de solución tampón 5 Volumen de cerveza 100 L Volumen de agua 24 ml Volumen de solución estándar 50 µl Número de adicciones 8 Validación del método Antes de proceder a la determinación de la concentración de iso- -acidos presentes en la cerveza se determinaron la reproducibilidad y repetitividad del método. La tabla 2 muestra los resultados obtenidos. Tabla 2. Repetitividad y reproducibilidad del método voltamperométrico. Media σ DSR (%) Repetitividad 1, ,846 Reproducibilidad 1, ,712 σ: desviación estándar DSR: desviación estándar relativa (100 σ /media) Voltamperometría de Redisolución catódica (CSV) Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que el contenido de iso- -acidos en las 15 cervezas lager analizadas varía ente y ppm (Tabla 3).

6 Tabla 3. Resultados obtenidos para cervezas analizadas. MUESTRA ORIGEN TIPO ph BRIX ALCOHOL Iso-α-ácidos (%) (%) (ppm) 1 Nacional Rubia 5,5 5,8 4,08 90,49 2 Nacional 3,96 5,2 0,0 113,36 3 Nacional Rubia 4,12 6,8 6,5 122,56 4 Nacional 4,03 5,0 <1 95,64 5 Nacional Rubia 4,20 5,1 4,8 93,52 6 Nacional 4,16 4,6 0,0 44,06 7 Nacional Rubia 4,23 6,0 5,5 103,04 8 Nacional 4,01 4,8 <1 75,08 9 Nacional Rubia 4,21 6,2 5,4 80,96 10 Nacional Rubia 4,04 6,0 5,4 82,84 11 Nacional 3,95 3,0 0,0 99,48 12 Nacional 3,99 6,0 0,0 101,76 13 Importación 4,19 6,0 <1 95,00 14 Importación 4,13 4,2 0,3 102,72 15 Importación 4,16 5,8 <1 95,72 Análisis de componentes principales (ACP) El objetivo de esta técnica es realizar una reducción de dimensionalidad, es decir, del número de variables (ph, % alcohol, % Brix y concentración de iso- -ácidos) y evaluar las cervezas mediante esas variables principales que resulten. Tabla de análisis de componentes principales: En la tabla 4 se muestra el resultado del análisis, de la que se extraen los autovalores mayores de 1 (autovalor mínimo fijado), que como se puede comprobar son 2 y juntos explican el 74,578 % de la variabilidad de los datos originales COMPONENTE NÚMERO Tabla 4.- Análisis de Componentes Principales. AUTOVALOR PORCENTAJE DE VARIANZA PORCENTAJE ACUMULADO 1 1, ,780 46, , ,798 74, , ,993 89, , , ,000 El sumatorio de los autovalores es igual al número de variables iniciales (4 en este caso). El espacio de dimensión cuatro ha sido reducido a un espacio de dimensión dos, en el cual la primera variable tendría una importancia de 1,87 sobre 4 y la segunda tendría un autovalor de 1,11 sobre 4.

7 Distancia Clasificación de las muestras de cervezas Dendograma (Análisis Cluster de las muestras) El método que se va a utilizar para realizar el Dendograma (Figura 4), será el Método Ward, que se basa en juntar los grupos que tengan medias cercanas Figura 4. Dendograma Los cluster y sus caracterísicas serán los siguientes: Cluster 1: La muestra de cerveza 1, presenta un ph alto, brix medio-alto, una concentración de iso- -ácidos baja, y alto contenido en alcohol. Cluster 2: Lo componen las cervezas 2, 4, 6, 8, 11, 12, 13, 14, 15. Se caracteriza por tener niveles bajos de alcohol, niveles bajos de ph y grado brix, y concentración de iso- -ácidos media. Lo forman las cervezas sin alcohol. Cluster 3: Formado por las muestras de cerveza 3, 5, 7, 9, 10. Son cervezas con niveles altos de alcohol, ph medios, grados brix altos y concentración de iso- -ácidos elevada. CONCLUSIONES Según los resultados obtenidos mediante voltamperometría de redisolución catódica, el contenido de iso- -ácidos en las cervezas lager analizadas varía entre y ppm, valores que se encuentran dentro del intervalo de concentraciones que aparecen reflejadas en la bibliografía (Benitez et al., 1997). Por lo cual la CSV se puede considerar un método apropiado para determinar el contenido de iso- -ácidos en cervezas lager. BIBLIOGRAFÍA Benitez J. L., Forster A., De Keukeleire D., Moir M., Sharpe F. R., Verhagen L. C. and Westwood K. T., (1997) Hops and Hop Products (EBC-Manual of good practice) pp. 41 Hans Carl-Verlag, Nürnberg. Blanco C. A, Rojas A. and Nimubona D., (2007). Effects of acidity and molecular size on bacteriostatic properties of beer hop derivates. Trends in Food Science and Technology, 18, Caballero I, Agut M, Armentia A and Blanco CA,. (2009). Importance of tetrahydroisohumulones on microbiological stability of beer. J. AOAC International, 92(4): Carvajal, A., Ubeda, V. y Maestre, M. A. (1991). Metrohm Monografías: Polarografía, voltamperometría de redisolución. Fundamentos y aplicaciones. Gomensoro S. A. Madrid, España. De Cooman L., Aerts, G., Overmeire H. and De Keukeleire D., (2000). Alterations of the profiles of iso-α-acids during beer ageing, marked instability of trans-iso-α-acids and implications for beer bitterness consistency in relation to tetrahydroiso-α-acids. Journal of

8 the Institute of Brewing, 106, Hobart H. Willard; Lynne L.; Merritt; John A.; Dean (1991). Métodos instrumentales de análisis. México. Compañia Editorial Continental. México. 1965, 722. Hughes, P.S.; Simpson, W.J. Bitterness of Congeners and Stereoisomers of Hop-Derived Bitter Acids- found in Beer. Journal of the American Society of Brewing Chemists. 1996, 54(4), Kunimune, T. and Shellhammer, T. H., (2008). Foam-stabilising effects of cling formation patterns of iso- -acids and reduced iso-α-acids in lager beer. The Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, Lewis, M.J.; Young, T.W. (1995). Brewing. London: Chapman and Hall Llario R., Iñón F. A., Garrigues S. and De la Guardia M., (2006). Determination of quality parameters of beers by the use of attenuated total reflectance-fourier transforms infrared spectroscopy. Talanta, 69, Moir M. (2000). Hop- a millennium review. Journal of the American Society of Brewing Chemists. 58(4),