Validación del método de cuantificación de Carbonato de Calco en el polvo de SupleCal
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- Mario Lara Acuña
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1 Validación del método de cuantificación de Carbonato de Calco en el polvo de SupleCal Validation of the method of quantifying calcium carbonate in the powder of SupleCal Clara E. Becquer Romagoza 1, Gisela Paredes Varela 1, Iala Rodríguez Calero 1, Osmara Rodríguez Cristobol 1 y Ana M. Sánchez Hechavarría 1 1 Departamento de Gestión de la Calidad. Dirección de Química. Centro Nacional de Investigaciones Científicas. clara.becquer@cnic.edu.cu 1
2 Validación del método de cuantificación de Carbonato de Calco en el polvo de SupleCal ABSTRACT Introduction: The calcium is indispensable for the health of bones, teeth and muscles. Many enzymes depend on calcium to function properly, and it is also important for the functioning of the nervous system, heart and blood clotting. A new nutritional supplement of calcium carbonate was developed starting from coral powders. For the development of a new product, it is necessary to validate analytical methods to quantify the active ingredient with a high degree of reliability. It was validated the technique described in the USP 27 for controlling the quality of powder Suplecal and ensure reliability of the results. Materials and methods: We developed a new nutritional supplement of calcium carbonate from coral powders. The SupleCal powder is a product obtained from the purification of the calcium carbonate variety aragonito that is present in the exoskeletum of the marine corals and that has been sifted until obtaining a particle size between 40 and 100 µm. The analytic method is based on the determination of the active principle using for it the method of valuation for formation of complex with solution of EDTA 0.05 mol/l and blue hidroxinaftol as indicator. Results and disscusion: Parameters like linearity, precision and accuracy were determined. The analytic method developed demonstrated to be lineal R=0.9985, precise (CV=0.5%) and exact in the selected range of concentrations ( mg). Conclusions: The applicability of the analytic method is demonstrated in the formulation designed for this product. Keywords: Validation; SupleCal ; Calcium carbonate; Quantification method. RESUMEN Introducción: El calcio es indispensable para la salud de huesos, dientes y músculos. Muchas enzimas dependen del calcio para funcionar adecuadamente, así como también es importante para el funcionamiento del sistema nervioso, cardiaco y la coagulación sanguínea. Para el desarrollo de un nuevo producto, es necesaria la utilización de métodos analíticos validados que permitan cuantificar el principio activo con un alto grado de confiabilidad. Se desarrolló un nuevo suplemento nutricional de carbonato de calcio a partir del polvo de coral. El polvo para obtener el suplemento nutricional SupleCal es un producto obtenido de la purificación del carbonato de calcio variedad aragonito presente en el exoesqueleto de los corales marinos Poritesporites. El objetivo de este trabajo fue la validación de la técnica descrita en la USP 27 para realizar el control de la calidad del polvo para SupleCal y garantizar la confiabilidad de los resultados. Materiales y métodos: S tamizo el polvo hasta obtener un tamaño de partícula entre 40 y 100 µm. El método analítico se basa en la determinación del principio activo empleando para ello el método de valoración por formación de complejo con solución de EDTA 0.05 mol/l e hidroxinaftol azul como indicador. Resultados y discusión: Fueron determinados parámetros como linealidad, precisión y exactitud. El método analítico desarrollado demostró ser lineal R=0,9985 preciso (CV=0.5%) y exacto en el rango de concentraciones seleccionado ( mg). Conclusiones: Se demostró la aplicabilidad del método analítico en la formulación diseñada para este producto. Palabras claves: Validación; SupleCal ; carbonato de calcio; método de cuantificación. 2
3 INTRODUCCIÓN La validación es la confirmación mediante el suministro de evidencias objetivas que se han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista. Proporciona un alto grado de confianza y seguridad del método analítico y se realiza con carácter obligatorio cuando se desarrolla un nuevo procedimiento, ya que permite asegurar que el método propuesto cumple su objetivo de Buenas Prácticas de Producción (1). Las normas de Buenas Prácticas de Fabricación y Control de la Calidad plantean que la validación debe aplicarse tanto a los procesos de fabricación como a los métodos analíticos (2). Es necesario señalar que los métodos descritos en farmacopeas u otros textos oficiales se consideran validados, pero es necesario adecuarlos a las condiciones reales de trabajo (3). La validación interna de un método es el proceso de verificar, dentro de un laboratorio, que un método previamente validado en otro ámbito conduce a resultados fiables (4). El carbonato de calcio, presente como componente fundamental en el polvo del Suplecal, es una sal inorgánica adquirida de una fuente natural, los corales marinos variedad aragonito. El calcio, es un mineral abundante e importante en el cuerpo humano, niveles adecuados del mismo, garantizan un óptimo funcionamiento del organismo. Este producto es indispensable para la salud de los huesos, dientes y músculos, para el buen funcionamiento del sistema nervioso, el tratamiento de la osteoporosis, depresión, etc. Algunas causas de cáncer, pueden deberse a deficiencia de minerales, incluyendo el calcio (5,6). El la USP 27 se reporta el método de ensayo aplicado a la materia prima carbonato de calcio (CaCO 3 ) de la variedad calcita. El objetivo del presente trabajo es la validación interna del método analítico reportado en la USP 27 para la determinación del contenido de CaCO 3 variedad aragonito en el polvo de SupleCal. MATERIALES Y METODOS Equipos Balanza analítica Sartorius ( ± 0,0001g) y estufa marca HS 32A Reactivos Se utilizó una disolución de EDTA como agente valorante, a una concentración de 0,05N; como indicador el hidroxinaftol azul y como patrón de referencia CaCO 3 reactivo MERCK con certificado de calidad. El HCl concentrado se empleó en la disolución de las muestras y el NaOH IN para garantizar el medio básico en la valoración. Todos estos reactivos utilizados fueron de calidad puro para análisis. PARTE EXPERIMENTAL Linealidad: Se analizaron tres curvas patrones en un rango de 160 a 240 mg a partir del patrón de CaCO 3 para cinco valores de concentración en un rango de %, que fueron preparadas de forma independiente en un mismo ensayo. La linealidad se verificó mediante el análisis estadístico de los datos a través de los coeficientes de correlación y de determinación, la prueba de proporcionalidad y la de significación de la pendiente ajustada por el método de los mínimos cuadrados. Precisión intermedia: En el caso de la repetibilidad, este estudio se realizó % de la cantidad teórica declarada; mientras que para la reproducibilidad, se analizó la misma muestra homogénea de concentración única que representa el 100 %, y se efectuaron las valoraciones por 3 analistas en 3 días diferentes. La precisión se 3
4 verificó mediante el coeficiente de variación total (CV) que establece como requisito para los métodos químicos un CV menor del 3%. Exactitud: Se realizó un análisis repetitivo a 6 porciones de la misma muestra de patrón de referencia de CaCO 3 de la Merck. Se pesó 200 mg de CaCO 3 previamente secado en la estufa a C, por 4h. Se humedeció con agua destilada y se disolvió en HCl 3N. Se llevó a un erlenmeyer de 250 ml y se añadió agua destilada hasta 50 ml aproximadamente, se añadieron 15 ml de disolución de Hidróxido de sodio 1N y 300 mg de hidroxinaftol azul, para valorar posteriormente con disolución de EDTA 0,05N. Se calculó el contenido de CaCO 3 según la ecuación 1: %= (V EDTA * F * meq * 100)/P muestra (1) Donde: V: ml de disolución de EDTA consumido; F: factor de corrección de la disolución; P: pesada de la muestra: 5,004: Mequivalente gramo; 100: factor matemático. El factor de corrección es el valor obtenido de la relación entre la normalidad obtenida experimentalmente y la teórica reportada. RESULTADOS Y DISCUSION Linealidad del sistema: La relación entre la concentración de calcio y el volumen de disolución de EDTA consumido, se describen por un modelo lineal cuya curva se representa en la figura 1. La curva de calibración resultó ser lineal en el intervalo de concentraciones comprendidos entre 160 y 240 mg. Al aplicar el método de los mínimos cuadrados a los resultados registrados se obtuvo la ecuación de la recta que se expresó según V (EDTA)/ ml = -1, , mg (CaCO 3 ). El coeficiente de correlación lineal fue de 0, y el valor de la t-student experimental tiene asociado un valor de p mucho mayor que 0,05. En el análisis de ANOVA para la regresión, el valor obtenido para F indica la alta significación de la pendiente (b 0) al ser la p< 0,05 e incluso p< 0,01, existiendo una relación estadísticamente significativa entre el volumen de disolución de EDTA y la concentración de CaCO 3 con un nivel de confianza del 99%. V (EDTA) c (Carbonato de Calcio) Figura 1. Relación entre la concentración de carbonato de calcio y el volumen de EDTA consumido. Precisión del método: En la Tabla 1 se exponen los resultados correspondientes al estudio de la repetibilidad. El valor obtenido de 0,41 % para el coeficiente de variación se considera aceptable para el límite establecido de un 3 %. En el ensayo de reproducibilidad los resultados de la comparación a través del análisis de varianza (ANOVA) para los factores analistas y día; muestran que no existen 4
5 diferencias significativas en % para un nivel de confianza del 95,0%, dado que ningún P-valor es inferior a 0,05, (tabla 2). Se obtiene un CV T =0,5% para la variable dependiente correspondiente al % de CaCO 3, que es un valor menor al 3 % según lo establecido para este tipo de método (tabla 3). Los resultados de la comparación a través del análisis de varianza (ANOVA) para los factores analistas y día; muestran que no existen diferencias significativas en % para un nivel de confianza del 95,0%, dado que ningún P-valor es inferior a 0,05, (tabla 2). Tabla 1. Resultados experimentales para evaluar la repetibilidad. M(muestra)/mg V (EDTA)/mL % (CaCO 3 ) 200,5 200,2 200,4 200,3 200,3 200,3 38,7 38,5 38,9 38,8 38,8 38,5 100,4 100,1 101,0 100,8 100,8 Xm=100,5 S= 0.41 CV=0,41 Tabla 2. Análisis de Varianza para el %CaCO 3. Factores: Analista y Día. Fuente A: Analista B: Día Residual Total (Corr) Suma de Cuadrados 0, ,2374 5, , gl Cuadrado medio 0, , , F P 1,94 0,1610 2,26 0,1016 Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual 5
6 Tabla 3. Resultados de los cálculos estadísticos para evaluar la reproducibilidad intermedia. Analista 1 Analista 2 Analista 3 Día % % % 99,2 99,6 98,8 1 99,7 99,7 99,3 99,3 99, ,2 100,2 98,8 100,8 3 98,9 99,7 100,2 99,8 4 99,1 100,1 99,0 99,7 99,8 100,1 100,4 Xm S CV 0,4572 0,5 0,2215 0,2 99,8 0,5931 0,6 Xm= 99,8 S= 0,4603 CV T = 0,5 % Exactitud: Las pruebas de hipótesis realizadas (Tabla 4), muestran que no existen diferencias estadísticamente significativas entre el valor del contenido de CaCO 3 obtenido experimentalmente y el intervalo de valores asumido como verdadero según las especificaciones del patrón utilizado (%CaCO 3 = 98,5-100,5), con nivel de confianza de un 95%.Los resultados experimentales se muestran en la tabla 5, calculados según la ecuación 1. Tabla 4. Prueba de hipótesis. Criterios de aceptación y resultados. Criterio de aceptación Resultados Prueba de hipótesis t exp <t teo ; p>0,05 Hipótesis nula: media=98,5 Alternativa: menor que t exp <t teo ; p-valor=0, Hipótesis nula: media=100,5 Alternativa: mayor que t exp <t teo ; p-valor= 0,
7 Tabla 5. Resultados experimentales para evaluar la exactitud. m (muestra)/mg V(EDTA)/ ml % CaCO 3 200,1 39,7 100,3 200,2 39,6 200,6 39,7 200,3 39,9 100,7 200,6 39,8 100,3 200,0 39,9 100,8 Xm=100,35 S= 0,34 CV=0,34% CONCLUSIONES Se comprobó el cumplimiento de la linealidad del método en el intervalo de concentraciones de 160 a 240 mg. No se observaron diferencias significativas entre los factores analista y día para un nivel de confianza del 95,0%, para p> 0,05 lo que demostró que el método presenta buena reproducibilidad. El ensayo de exactitud demostró que no existe diferencia significativa entre el valor obtenido experimentalmente y el teórico reportado para el patrón de CaCO 3. Estos resultados demostraron que el método complejométrico reportado en la USP 27 para la determinación del contenido de CaCO 3 es válido en la producción de SupleCal. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Sección catalana de la AEFI. Comisión de normas de buena fabricación y control de calidad Validación de métodos analíticos. Monografía. Sept., 1989: EURACHEM (1998) The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM Secretariat, Teddington, Middlesex, 3. United Stated Pharmacopoeia. 27.NF22. Inc Rockville. Mack Printing; vol.27: IUPAC. International Unión of Pure and Applied Chemistry (1995) Nomenclature in Evaluation of Analytical Methods including Detection and Quantification Capabilities, Puré Appl. Chem., 67, Federico Leighton e Inés Urquiaga Alimentación, antioxidantes y envejecimiento. Colección Adulto Mayor, Pontificia Universidad Católica de Chile, Ph.D Robert Owen.Why Calcium - A summarized report on the roll of calcium in human health; Health Digest Publishing Co.,Cannon Beach, OR,
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