11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12N 15/ Agente: Carpintero López, Francisco

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : C12N 1/00 C12N 7/00 A01N 43/04 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación: Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Vectores que tienen la secuencia repetitiva terminal del virus de Epstein-Barr. Prioridad: US Titular/es: Bayer Corporation 0 Bayer Road Pittsburgh, Pennsylvania 1, US 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Cho, Myung-Sam y Chan, Sham, Yuen 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Vectores que tienen la secuencia repetitiva terminal del virus de Epstein-Barr. 1 Solicitudes relacionadas: La solicitud de Cho denominada MSB-7241 (Nº Serie en EE.UU. 09/99), Célula Híbrida Humana Hospedadora para la Expresión de Genes de Mamíferos, y la solicitud de Cho y col. designada MSB.72 (Nº de Serie en EE.UU. 09/9916), Sistema de expresión del factor VIII, contienen materia relacionada con esta temática. Ambas solicitudes fueron presentadas el de diciembre de Antecedentes de la invención Campo: Esta invención se refiere, de forma general, a la producción de proteínas biológicamente activas a partir de líneas celulares de mamífero manipuladas genéticamente. En concreto, la invención consiste en un nuevo vector de expresión que contiene una secuencia repetitiva terminal del virus de Epstein-Barr, que potencia la integración de los vectores de expresión en el ADN genómico de líneas hospedadoras de células de mamífero. Antecedentes: Se han realizado muchos intentos para aumentar la eficiencia de integración estable de los vectores de expresión en el ADN genómico, mediante la integración específica de sitio La integración aleatoria y no homóloga del ADN introducido en el genoma de la célula hospedadora se produce con una frecuencia más de 0 veces superior que la recombinación homóloga dirigida (Thomas y col., 1987, Cell 1: 03-12). Sin embargo, se ha demostrado que la recombinación homóloga que utiliza puntos calientes, por ejemplo, el ADN minisatélite hipervariable, se produce de forma más frecuente que la recombinación aleatoria entre dos plásmidos defectivos en las células de mamífero (Wahls y col., 1990, Cell : 9-3). La proteína celular autoantigénica fue aislada por Sun y col. (1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: ). Esta proteína se identificó como una proteína de unión a regiones repetitivas terminales, o PURT. Dos sitios de unión a regiones repetitivas terminales (SURT1 y SURT2) para la proteína de unión a regiones repetitivas terminales también fueron identificados por Sun y col. Observaron que PURT se une a secuencias presentes en el ADN repetitivo de la célula, por ejemplo, las regiones con repeticiones en tándem en número variable (RTNV) y de cambio de clase de la cadena pesada de inmunoglobulina. La proteína de unión a regiones repetitivas terminales se une a las regiones ricas en G de las repeticiones terminales del virus de Epstein-Barr (RT-VEB). La RT-VEB participa en el procesamiento y empaquetamiento del ADN del virión (Zimmermann y col., 199, J Virol 69: ). Las RTs-VEB están implicadas en la integración dentro del ADN cromosómico (Matsuo y col., 1984, Science 226: ) y en el fenómeno de circularización del genoma después de la infección. Estas secuencias son los elementos esenciales para el corte y empaquetamiento del ADN de los viriones de VEB (Hammerschmidt y col., 1989, Nature (Londres) 3: ; Zimmermmann y col., J Virol. 199, 69: ). Estos datos indican el importante papel de la secuencia de RT-VEB en los fenómenos de recombinación. Por todo ello, hemos examinado la RT-VEB respecto a los fenómenos de integración en clones derivados de las células transfectadas. El documento FR describe un vector de expresión que expresa una proteína heteróloga, y que comprende una secuencia de ADN mitocondrial que interviene en la integración del vector de expresión en el ADN genómico de la célula de mamífero hospedadora. El problema que hay que resolver es la obtención de un vector de expresión alternativo que exprese una proteína heteróloga que se integre en el ADN genómico de la célula de mamífero hospedadora. El problema es resuelto por un vector de expresión tal como se describe en la reivindicación 6, que comprende una secuencia repetitiva terminal del virus de Epstein-Barr, mostrada en ID SEC Nº: 1. La técnica anterior citada no señala ningún indicador que indicara al experto en la técnica que produjera dicho vector de expresión. Resumen de la invención Hemos descubierto que las células transfectadas con un vector de expresión que contiene un marcador de selección y una secuencia RT-VEB muestran un aumento de cinco a diez veces superior en el número de células resistentes al agente de selección, en comparación con las células transfectadas con el mismo vector de expresión sin una secuencia RT-VEB, bajo las mismas condiciones de selección. La mayor proporción de supervivencia bajo la selección con fármacos indica que los vectores con RT pueden aumentar la frecuencia de integración de los vectores en el ADN genómico. Los vectores de expresión de esta invención engloban una secuencia RT-VEB y un marcador de selección, como es la reductasa de dihidrofolato (rdhf). La secuencia RT-VEB preferida es una secuencia de 2 pb (mostrada en la figura 1), la cual incluye la parte central de la región de unión a PURT, procedente de una línea de células linfoblastoides inmortalizadas 6F11. En la forma de realización preferida, el vector de expresión de genes de mamífero comprende un potenciador y un promotor de CMV, una secuencia intrónica (SIM, según se describe en la Patente de EE.UU. 821 de Cho y col.) derivada del virus de Epstein-Barr, un sitio exclusivo de la enzima de restricción HpaI que permite la inserción de una secuencia codificante de proteína, y una región de poli-a, además del esqueleto del plásmido, con un marcador de selección de fármacos y una secuencia RT-VEB señalada en la figura 1. Este vector se denomina psh131 (véase la figura 2). Este vector se usa para introducir la secuencia de ADN codificante apropiada, perteneciente a la 2

3 1 2 3 proteína de interés, en las células de mamífero con el fin de estabilizar la expresión de la proteína en un cultivo de larga duración, en un medio sin suero. En la forma de realización preferida, se clonó la secuencia de una muteína de IL-4 en el psh131, y el vector resultante es psh13. La secuencia RT-VEB también se ligó directamente al pcis2d (vector para expresar FVIIIr con deleción del dominio B, denominado FVIII-DDB), y el vector resultante es pcis2dtr. El marcador de amplificación elegido es la reductasa de dihidrofolato (rdhf), aunque puede ser sustituido por otros marcadores, como la sintetasa de glutamina (sg) y el gen de resistencia múltiple a fármacos (rmf). Estos marcadores de amplificación (rdhf, sg y rmf) también son marcadores de selección. El marcador de selección elegido es neo (fosfotransferasa de aminoglucósido, para la resistencia a la neomicina); no obstante, puede ser sustituido por otros marcadores, como phh (fosfotransferasa de higromicina B) y Dhis (deshidrogenasa de histidinol). La célula hospedadora a transfectar puede ser cualquier célula de mamífero. Son óptimas las líneas celulares que se sabe que aceptan la integración de genes de selección en su ADN cromosómico; por ejemplo, las células embrionarias humanas de riñón (por ejemplo, las células 293S), el híbrido humano originado a partir de 293S y células B (por ejemplo, HKB11; depósito de la ATCC nº CRL 1268, véase la solicitud de Patente de EE.UU. de Cho designada MSB-7241, Célula Híbrida Humana Hospedadora para la Expresión de Genes de Mamíferos, presentada el mismo día que la solicitud actual, e incorporada como antecedente en esta invención), ovario de hámster chino (OHC), riñón de hámster recién nacido (RHR-21), mieloma de ratón, y células B humanas. Como un ejemplo del trabajo, mostramos que las células OHC (rdhf-) transfectadas con un vector de expresión que contiene rdhf y una secuencia RT-VEB presentaban un aumento de, aproximadamente, cinco a diez veces superior en el número de células resistentes de metotrexato (MTX), en comparación con las células transfectadas con el mismo vector de expresión sin RT-VEB, bajo las mismas condiciones de selección. Según se usan en esta memoria, las condiciones sin suero implican unas condiciones en las que se produce crecimiento celular en medios que carecen de cualquier suero añadido. Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de la secuencia RT-VEB utilizada en el vector de expresión, en los ejemplos. (ID SEC Nº:1). Se ha escrito en cursiva un elemento de 9 pb (GTGTTGGCG), y en negrita, un elemento acortado de 11 pb (GGTCATGGGG; pb). Se ha subrayado una repetición de 11 pb (GGCGGGTCATG). La figura 2 muestra los vectores de expresión usados para comparar los cocientes de selección. Todos los plásmidos se construyen a partir del esqueleto de pbr322, y contienen una unidad de expresión de rdhf. Todos los genes que codifican proteínas de interés se encuentran bajo la regulación del potenciador/promotor de CMV (p/pcmv), y el intrón en (SIM o SIC) se situó en el extremo de los genes. La figura 3 muestra el efecto de la secuencia RT-VEB sobre la expresión de una muteína de IL-4 procedente de psh134 y psh13, en pruebas de transfección transitoria repetidas cuatro veces, usando células OHC y HKB. Formas de realización específicas Construcción de vectores de expresión que contienen RT-VEB Se obtuvo un fragmento de 381 pb de la secuencia RT-VEB descrita en la figura 1, la cual abarca la secuencia de ADN desde la posición hasta la de los datos de secuenciación de VEB B9/8 (P.J.Farell, Epstein- Barr Virus Genome, en Advanced Viral Oncology; editado por G. Klein; Raven Press, Ltd: Nueva York 1989, págs ) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a partir de un ADN molde procedente de las células 6F11 (ATCC CRL962), una línea de células linfoblastoides que fue inmortalizada por VEB. Se confeccionaron dos cebadores ( -GGCAATGGAGCGTGACGAAG-3 y -CTCATCACGGTCACGCATGG-3, fragmentos derivados de ID SEC:1) con el fin de amplificar el fragmento de 381 pb de la secuencia RT-VEB en el ADN de las células 6F11. Los productos de la PCR fueron fosforilados y ligados al vector de expresión psm97, tras eliminar un fragmento de 3 pb escindido mediante la endonucleasa de restricción NaeI. El vector resultante fue psh131 (figura 2), que se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo con la referencia ATCC Los datos de secuenciación del ADN de la secuencia RT-VEB en psh131 (2 pb) fueron mayores que el tamaño esperado (381 pb). La principal diferencia es una repetición de 11 pb (GGCGGGTCATG) que consta de 4 pb procedentes de un elemento de 9 pb (GTGTTGGCG) y de 7 pg procedentes de un elemento de pb (GGTCATGGGG). Ambos extremos de la molécula de ADN en la RT-VEB descrita por Zimmermann y col. (1996, J Virol 69: ) constan de un elemento de 9 pb (GTGTTGGCG) y otro de 11 pb (GGGTCATGGGG) (todos los fragmentos derivan de la ID SEC Nº:1). El elemento de 11 pb en psh131 carecía de 1 pb; por ello, solo observamos pb. El motivo de la repetición del elemento de 11 pb que se observó podría ser que la secuencia RT-VEB en psh131 (2 pb) se produjo usando el ADN de 6F11, no el de B9/8. Las células 6F11 se inmortalizan mediante un VEB, y tienen una forma concatenada de ADN-VEB (Cho y Tran, 1993, Virology 194: ), mientras que VEB B9/8 es un virus infectivo. Por ello, la secuencia RT-VEB en psh131 (2 pb) derivó de este ADN-VEB concatenado. 3

4 Se insertó una secuencia de ADN que codifica una muteína doble de IL-4 (mdil-4) en el sitio HpaI de psm97 y psh131. Los plásmidos resultantes son psh134 (mdil-4 en psm97) y psh13 (mdil-4 en psh131). La mdil- 4 que se usó se describe, en esencia, en la Patente europea BI de Sebald, incorporada como antecedente en esta invención. Esta mdil-4 es un derivado de la IL-4 no modificada que tiene los aminoácidos de la posición 121 (arginina) y 124 (tirosina) sustituidos por ácido aspártico. El producto de PCR de la secuencia RT-VEB también se insertó en el sitio SalI de pcis2d, que es un vector de expresión que codifica el factor VIII con deleción del dominio B (FBI-DDB). El plásmido resultante es pcis2dtr. Los cuatro vectores de expresión, psh134 y psh13, pcis2d y pcis2dtr, presentan el mismo gen funcional rdhf. Véanse los mapas en la Figura 2. Ejemplo Efecto de RT-VEB sobre la expresión de un gen indicador en pruebas de transfección transitoria Se transfectaron por separado dos millones de células OHC (negativas para rdhf) y de HKB (una línea de células híbridas humano-humano; ATCC CRL-1268) con µg de ADN plasmídico (psh134 y psh13), en una placa de seis pocillos, utilizando el reactivo de liposomas catiónicos DMRIE-C (Life Technologies, Rockville, MD), según el protocolo suministrado. Dos o tres días después de la transfección de las células OHC y HKB con ambos vectores de expresión, se examinaron los sobrenadantes respecto a la expresión de md-il-4, mediante un ELISA. Tal como se muestra en la Figura 3, los niveles de expresión de mdil-4 procedente de psh134 fueron muy similares a los de psh13, obtenidos de dos transfectantes distintas en diversas pruebas de transfección transitorias. Estos resultados demuestran que RT-VEB no tiene influencia sobre la expresión del gen indicador mdil-4. Estos resultados indican que RT-VEB podría no tener ninguna función de potenciación de la expresión génica en los vectores, como por ejemplo rdhf. Esto implica que la presencia de RT-VEB aumenta las proporciones de supervivencia mediante un mecanismo distinto al del aumento del nivel de expresión del gen rdhf, es decir, el mecanismo puede implicar el aumento de integración del vector. Ejemplo 2 Selección por fármacos de las células transfectadas con un vector que contiene RT-VEB Se transfectaron por separado células OHC (rdhf-) con µg de psh134 y µg de psh13, utilizando el reactivo de liposomas catiónicos DMRIE-C, según el protocolo suministrado por Life Technology. Se seleccionaron las células transfectadas ( x células por cada placa de 96 pocillos) en un medio sin suero complementado con insulina-r, transferrina y MTX 0 nm carente de hipoxantina y timidina. Se hizo el recuento de los pocillos con crecimiento positivo al cabo de 2 semanas después de la selección inicial, en un medio selectivo con MTX 0 nm. Ningún clon resistente a MTX derivó de falsas células transfectadas. Los resultados se muestran en la Tabla 1. El Ejemplo 1 (mdil- 4) se llevó a cabo en el medio sin suero que carecía de hipoxantina y timidina, y complementado con metotrexato 0 nm. El Ejemplo 2 (md-il-4) se llevó a cabo en medio selectivo con suero (%), complementado con metotrexato 0 nm. Los Ejemplo3 (FVIII-DDB) y Ejemplo 4 (FVIII-DDB) se llevaron a cabo en el mismo medio selectivo sin suero que en el Ejemplo 1. 4 (Tabla pasa a página siguiente) 0 6 4

5 TABLA 1 Cociente de selección por fármacos de las células OHC (rdhf-) transfectadas utilizando los vectores de expresión mdil-4 y FVIII-DDB ligados con y sin RT-VEB Se usaron para la transfección vectores de expresión carentes de RT-VEB. 2 Se usaron para transfección vectores de expresión que contienen RT-VEB. 3 Este cociente indica cocientes de crecimiento + de las células transfectadas con el vector que tiene RT-VEB respecto a las células transfectadas con el vector carente de RT-VEB. 4 El número real de colonias con crecimiento positivo es mucho mayor que las cifras de crecimiento positivo obtenidas de cada pocillo, debido a crecían múltiples colonias en muchos pocillos con crecimiento positivo. 4 0 Dos semanas después de recoger las células del medio selectivo, las células transfectadas con psh13 (con RT-VEB) mostraban un cociente de selección, aproximadamente, veces superior que aquellas transfectadas con psh134 (sin RT-VEB), aunque RT-VEB no demostró ninguna función de potenciación sobre la expresión de IL-4 (Figura 3). Las células OHC (rdhf-) también fueron transfectadas con µg de pcis2d y µg de pcis2dtr, utilizando el reactivo DMRIE-C. Se seleccionaron las células bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Las células transfectadas con pcis2dtr mostraron un cociente de selección de aproximadamente 3 a 16 veces mayor que aquellas transfectadas con pcis2d (Tabla 1). Estos resultados indican que esta secuencia de RT-VEB en el vector de expresión puede utilizarse para aumentar la integración del vector en la terapia génica in vivo. Ejemplo 3 Selección de líneas celulares con alta producción bajo condiciones sin suero Las células OHC (negativas para rdhf) transfectadas con psh13 fueron sembradas en placas de 96 pocillos ( x células por placa), utilizando un medio selectivo sin suero, complementado con transferrina, insulina recombinante, y metotrexato (0 nm). El medio selectivo carece de hipoxantina y timidina. Después de tres meses de amplificación (MTX 0 y 0 nm), una de las poblaciones iniciales, denominada 1G9, se adaptó a un cultivo en suspensión usando un frasco de agitación. Se observó que continuaba el alto de productividad de md-il-4 ( pg/c/d) durante un mínimo de semanas en un medio sin suero ni albúmina, complementado con transferrina e insulina recombinante. 6

6 Ejemplo 4 Integración estable Se examinó uno de los clones de OHC que secretan FVIII-DDB, el cual derivaba de células OHC transfectadas con pcis2dtr, tal como se describe en el Ejemplo 2, respecto a su estabilidad de producción ante la ausencia del fármaco de selección (MTX). Este clon continuó secretando FVIII-DDB durante un periodo de crecimiento de 6 meses, en un medio carente de MTX. Todos los clones de células individuales derivados de este clon también mostraban una secreción positiva. Estos resultados indican que la integración de los vectores que contienen una secuencia RT-VEB es estable. Conclusiones 1 2 La consecución de líneas celulares estables que secreten altos niveles de proteínas es una tarea muy tediosa y laboriosa. Esto se debe, en parte, a la baja probabilidad de integración estable y amplificación del gen de interés. Generalmente, se necesita realizar el escrutinio de grandes cantidades de clones resistentes a fármacos, con el fin de obtener clones con alta secreción. Por ello, hemos descrito en esta invención que los vectores que tienen una secuencia RT-VEB dan lugar a un aumento en el cociente de selección del fármaco, lo que indica un alto cociente de integración de los genes transferidos. Tal como se muestra en la Tabla 1, fue posible seleccionar y amplificar las células transferidas, incluso bajo condiciones sin suero. Con los ejemplos presentados, se pretende ilustrar la invención, y se piensa que los expertos en la técnica harán variaciones. Según lo expuesto, se entiende que el ámbito de la invención debería estar limitado únicamente por las reivindicaciones expuestas más adelante

7 REIVINDICACIONES Un procedimiento de introducción de un vector de expresión en las células de mamífero, que comprende las etapas de: a) poner en contacto las células de mamífero con el vector de expresión bajo condiciones que permiten la asimilación del vector de expresión por parte de las células, comprendiendo el vector de expresión una primera secuencia de ADN que codifica una proteína heteróloga, una segunda secuencia de ADN que codifica un marcador de amplificación, y una tercera secuencia de ADN que se describe en ID SEC Nº: 1 b) hacer crecer las células obtenidas de la etapa a) en un medio selectivo, bajo condiciones que permiten la selección de células resistentes; y c) recuperar las células obtenidas de la etapa b) que expresan la proteína heteróloga. 2. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además la etapa de: d) hacer crecer las células recuperadas en la etapa c), bajo condiciones que permiten realizar su selección posterior. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la segunda secuencia de ADN codifica un marcador de amplificación elegido de entre el grupo constituido por la reductasa de dihidrofolato, la sintetasa de glutamina, y el gen de resistencia múltiple a fármacos. 4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la primera secuencia de ADN codifica una proteína heteróloga elegida a partir del grupo constituido por el factor VIII, derivados del factor VIII, interleuquina-4, y derivados de IL- 4.. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que se produce, al menos, uno de las etapas b) y d) bajo condiciones sin suero. 6. Un vector de expresión que comprende una primera secuencia de ADN que codifica una proteína heteróloga, una segunda secuencia de ADN que codifica un marcador de amplificación, y una tercera secuencia que comprende la secuencia de ADN mostrada en ID SEC Nº: Un vector de expresión según la reivindicación 6, en el que el marcador de amplificación es la reductasa de dihidrofolato. 8. Un clon de OHC que expresa la muteína doble de IL-4 derivado de células transfectadas con un vector de expresión según la reivindicación 6, en el que la primera secuencia de ADN codifica una muteína doble de IL Una línea celular según la reivindicación 8 designada 1G9, que produce aproximadamente pg/c/d de muteína doble de IL

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11 LISTA DE SECUENCIAS 1 <1> Cho, Myung-Sam Chan, Sham-Yuen <1> Vectores que tienen la Secuencia Repetitiva Terminal del Virul de Epstein-Barr <1> MSB-724 <1> <141> <1> 1 <170> Patente In Ver <2> 1 <211> 2 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <2> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Derivada del Virus de Epstein-Barr <0>