Determinación de marcadores para alcaloides presentes en la planta Uncaria Tomentosa

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1 Determinación de marcadores para alcaloides presentes en la planta Uncaria Tomentosa Dr. Eduardo Arguedas, Christian Tenorio Angulo, Darién Matarrita Córdoba Facultad de Farmacia, Universidad de Iberoamérica. San José, Costa Rica. RESUMEN La presente investigación consistió en someter a análisis la muestra de uncaría tomentosa conocida popularmente en el mercado como uña de gato, en la cual se logra la extracción por medio de un método ácido-base desarrollado en el laboratorio de UNIBE. Posteriormente se realiza una separación de los alcaloides presentes en la planta por medio de una columna de separación y las muestras obtenidas se someten a análisis y pruebas de laboratorio como cromatografía de masas e IR. ABSTRACT The present investigation consisted in submitting to the analysis of the sample of a uncaria tomentosa popularly known in the market as "uña de gato", in which the extraction was achieved by means of an acid-base method developed in the UNIBE laboratory. Subsequently, a separation of the alkaloids is carried out in the plant by means of a separation column and the samples are closed and subjected to analysis and laboratory tests such as mass and IR chromatography. 1

2 1. INTRODUCCIÓN La flora y fauna en nuestro país es un de las más ricas de todo el mundo, en ella se encuentran una gran variedad de especies animales y vegetales que difícilmente se pueden ver en una sola región del mundo, por esta razón es importante el estudio de las diferentes plantas que se encuentran en nuestros suelos ya que muchas de ellas presentan muchas propiedades farmacológicas. Tanto los países desarrollados como los que se encuentran en Vía de desarrollo han aumentado la utilización de plantas medicinales o productos derivados de estas sí ven las causas son diferentes. Muchos de los países en vía de desarrollo han tomado durante mucho tiempo las plantas medicinales como tratamientos para diferentes patologías por necesidad, debido a la escasez de fármacos en estas regiones. Tanto en unos como en otros se ha presentado el uso abusivo lo que ha traído consigo un aumento en el interés científico y en la comprobación científica de las propiedades atribuidas a las plantas medicinales. En nuestro país las plantas medicinales han sido utilizadas desde tiempos remotos como nuevos agentes terapéuticos y sus usos han sido transmitidos de generación en generación, bien en forma oral o escrita hasta nuestros días y es esto lo que se conoce como la práctica terapéutica tradicional, el empleo de extractos o principios activos de las plantas la cual ha sido importante en el cuidado de la salud de la población en el primer nivel de atención. Una de las plantas más utilizadas a nivel nacional es la uncaria tomentosa llamada uña de gato en Costa Rica a la cual se le atribuyen según estudios químicos biológicos y farmacológicos efectos inmunoestimulantes antiinflamatorios e inhibidores del crecimiento de las células cancerígenas entre otros. Por lo anterior nació la inquietud de llevar a cabo el presente estudio el cual consistió en la separación de los diferentes alcaloides presentes en la planta. 2. MATERIALES Y METODOS. Reactivos Materiales Cloroformo Reactivo de Dragendorff Metanol Agua Probetas (10, 25, 100mL) Embudo separador (500mL) Balanza granataria. Espátulas. Rota vapor. Vidrio reloj. Beaker (50, 250, 450, 1000mL). Cromatoplacas. Con gel de sílice. Balón (250ml) de fondo plano con boca esmerilada. Papel de filtro. Erlenmeyer (50,100 ml). Agitador Capilares Rociador de vidrio para reactivos Lámparas de luz UV. Tiras reactivas para ph. Gotero. Reactivos HCl Cloroformo Acetato de Etilo Agua destilada Silica gel Etanol Amoniaco Reactivo de draggendorf 2

3 Procedimiento Extracción de los alcaloides presentes en la muestra tomada de la planta de uncaria tomentosa: 1. Se tomó la corteza de uña de gato (proveniente de un laboratorio farmacéutico). 2. Se añadió 15 g de corteza de uña de gato natural previamente triturada en un beaker de 1L. 3. Se agregó 200 ml de agua destilada y se dejó calentar por 10 minutos con agitación constante. 4. Se agregó HCL 3M a la mezcla hasta lograr un ph 2 y se añadió 200 ml de etanol. 5. Dejar calentar la mezcla por 45 minutos más, mientras se añade amoniaco concentrado hasta ph 8, con agitación constante. 6. Se agregó 200 ml de cloroformo a la mezcla caliente y agitándose. 7. Dejar enfriar filtrar y reposar. 8. Se utilizó un embudo separador para obtener las dos fases formadas. 9. La fase orgánica fue introducida en un balón para rota vaporizarlo. 10. El concentrado obtenido fue almacenado en un vial. 11. Se realizó una cromatografía de capa fina utilizando una pequeña cantidad de la muestra concentrada (fase orgánica) obtenida utilizando como fase móvil cloroformo/metanol. 5:5. Se dejó secar para luego aplicar el revelador. 12. Se roció con el reactivo de Dragendorff (agente revelador) Separación por columna del extracto de uña de gato 1. Al igual que con todos los procedimientos anteriores se prepara el instrumento y se lava adecuadamente. 2. Se monta la columna y se reara con algodón en la base, se adhiere 150 gramos de silica gel en polvo y se golea la columna suavemente ara evitar que la silica se divide en fase. 3. Introducir 50 ml de una mezcla 5:5 de cloroformo/metanol (previamente preparado), en la columna para que bañe la silica en polvo. 4. Se prepara el extracto con cloroformo (previamente secado)y se agrega 25 ml de la mezcla de solventes (se agita). 5. Hay que dejar cerrar la columna con la mezcla de solvente y antes que comience a secarse la silica se le adiciona el extracto. 6. Se permite fluir la columna y se descarta la primera muestra que corresponde a los solventes que se agregaron al inicio. 7. Hay que continuar agregando solvente ara que la fase estacionaria no se seque. 8. Extraer hasta que la muestra pase totalmente por la columna, donde ha sido recolectado en diferentes tubos de ensayo con la misma cantidad de gotas de muestra cada uno. 3. RESULTADOS. Cromatografía de placa Se realizaron varias cromatografías de placas, donde se puede ver en principio la presencia de los alcaloides identificados por dragendorff. 3

4 Cromatografía de capa fina (TLC) , no sin antes también decir que en una banda correspondiente al sistema forano también presente en los alcaloides I-887-2/ CHCl3 120, I-887-2/ CHCl ,3 754, ,7 1470,0 Se puede observar la presencia de varios metabolitos secundarios que a la hora de aplicarles el dragendorff sobre la placa podemos asegurar la presencia de alcaloides. 80 %T I-887-2/ CHCl ,8 1238,5 1188,1 1113, , ,0 3800, ,0 cm-1 Unión del segundo grupo de alcaloides. Este grupo nos permite observar la presencia de los NH en , vemos la presencia del grupo amidas cíclico en y posiblemente 2018-I-887-2/ CHCl3el éster correspondiente en los 1735, además se puede observar en 818 el sistema aromático y en 1040 el sistema furanosa. Espectroscopia infrarroja Unión del primer grupo de alcaloides. A la hora de realizar la espectroscopia infrarroja podemos observar una banda ancha en los que corresponde a las interacciones NH, una banda pequeña en los 2940 que representa a los grupos alquenos, una banda en los que corresponde a las amidas cíclicas, en 1618 bandas correspondientes a los vibraciones de NH, y el sistema aromático en 105, %T I-887-3/ CHCl3 2358,3 818,2 1040,6 1708,6 1250,0 3382, ,0 3800, ,0 cm-1 4

5 Cromatografía de masas Con el interés de verificar la presencia de los metabolitos secundarios se realiza la cromatografía de gases asociada a masas, al realizar la cromatografía de gases relacionadas con las fracciones separadas nos damos cuenta que en la muestra uno tenemos fracciones importantes a los minutos, minutos, minutos y a los , datos que se procesaran posterior mente. Con un tiempo de retención de minutos y un aria porcentual y un m/z que corresponde a , tenemos moléculas relacionadas con las estructuras de los alcaloides existentes, como las famosas Uncarina F, Mitrafilina, Isomitrofilia, Isopteropodina y Pleropodina. Pasamos analizar la espectroscopia de masas del producto que corresponde a la fracción Número 1. Con un tiempo de retención de minutos, un área porcentual de 7.71 y un m/z de fracciones que corresponden al rompimiento de los ciclos de los alcaloides presenten en la Uncaria Tomentosa. En la cromatografía de gases que corresponde a la segunda fracción vemos un pico importante que es prácticamente el 100 % en minutos y un aria porcentual del 100% y tenemos como pico m/z 385, en 405 con m/z 405 que corresponde a la molécula de clorhidrato de la molécula correspondiente. 5

6 En el cromatograma de gases que corresponde a la tercera fracción y se pueden observar picos importantes en minutos. Posteriormente al leer la cromatografía de masas asociada a gases podemos ver a minutos un aria porcentual y un m/z 382 lo cual corresponde a sistemas semi hidrolizados de la amida cíclica presente en la uña de gato. solución concentrada con los alcaloides presentes en la planta. Se determinó la presencia de alcaloides de Uncaria tomentosa, mediante corridos cromatografía y revelado con el reactivo de dragendorff, del producto macrobiótica que se conoce en nuestro país como uña de gato y de la corteza de la planta. Los resultados obtenidos en la cromatografía de capa fina, concuerdan con los obtenidos en la cromatografía de columna, específicamente en los grupos dos y tres recolectados en tubos de ensayo. Se estandarizo otros métodos analíticos IR, UV, Gases, entre otros. El método de análisis por cromatografía de columna, espectroscopia de masa y espectroscopia infrarroja permite detectar la estructura y separación de alcaloides en la Uncaria tomentosa que en trabajos previos no se habían logrado. 5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 4. Conclusiones Se logró generar patrones en los cuales se pueda determinar los alcaloides presentes en la untaría tomentosa, los cuales se tomarán como marcadores de análisis. Se recopilo información de varias fuentes, las cuales brindaron información importante, referente a la planta en estudio "untaría tomentosa". La extracción de untaría tomentosa (uña de gato) por medio del método acido-base, permitió obtener una 1. Mann J. Secondary Metabolism. Second Edition. Oxford Science publications p Alonso, J. Tratado de fitofármacos y nutraceuticos. Primera reimpresión editorial.rosario(argentina): Corpus; Castillo Garcia E. Martinez Solis I. Manual de fitoterapia. Editorial EL SEVIER MASSON; Barcelona, España Laboratorios Alpha Natura SAC. HERBAL DIETARY & NUTRITIONAL SUPPLEMENTS (natura uña de gato) 5. Fessender, Ralhp, Joan. Quimica organica. Segunda edición. Grupo editorial iberoamericana. Mexico,DF Bernard, M. Plantas Medicinales para Enfermedades reumáticas. Editorial complutense. Madrid, España

7 6. Recomendaciones Incentivar la investigación y análisis químico de la Uncaria tomentosa. Estudiar plantas de diferente edad y de distintas regiones del país. Realizar columnas con más altura. Utilizar columnas con mayor capacidad para asi poder obtener una separación mas optima de los alcaloides. Realizarle resonancia magnética nuclear de los productos obtenidos. Realizarle HPLC masas. 7