DOCTORADO EN CIENCIAS NATURALES PARA EL DESARROLLO ENFASIS EN MANEJO DE RECURSOS NATURALES INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA

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1 DOCTORADO EN CIENCIAS NATURALES PARA EL DESARROLLO ENFASIS EN MANEJO DE RECURSOS NATURALES INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA DE UN EXTRACTO DE PROPOLEO MEXICANO Y DE TRES PLANTAS QUE Apis mellifera USA PARA SU PRODUCCION TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTORA EN CIENCIAS NATURALES PARA EL DESARROLLO PRESENTA AMPARO LONDOÑO OROZCO TUTORES DR. JOSE GUILLERMO PENIERES CARRILLO DR. TONATIUH ALEJANDRO CRUZ SANCHEZ DR. CARLOS GERARDO GARCIA TOVAR Cuautitlán Izcalli, Estado de México 2010

2 Este trabajo fue apoyado por el Proyecto IN del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, de la Universidad Nacional Autónoma de México, Evaluación de la actividad antimicótica de compuestos sintéticos y naturales sobre la estructura de las células micóticas y la Cátedra de Investigación GVC11.

3 Por ti y para ti... Gracias Señor, porque separada de ti nada puedo hacer

4 Papa y mamá : Ustedes sembraron la semilla, esto les pertenece. Los amo! Tona, Saraí, Etni Alejandra: Gracias por el amor, el apoyo y la paciencia. Sola no hubiera podido. A mi familia: La distancia no es obstáculo. A mis amigos y mi iglesia Siempre están presentes.

5 AGRADECIMIENTOS Al Instituto Tecnológico de Costa Rica y a la Universidad Nacional Autónoma de México, por permitirme formar parte de éste Programa que crea y fortalece vínculos en pro del desarrollo de la región mesoamericana. Al Dr. Tomás de Jesús Guzmán Hernández, por su asesoría, apoyo y paciencia como Coordinador del Programa de Doctorado. A los Doctores José Guillermo Penieres Carrillo, Tonatiuh Alejandro Cruz Sánchez y Carlos Gerardo García Tovar, por su valiosa dirección para el desarrollo de este trabajo. A los Doctores José Guillermo Ávila Acevedo, María Margarita Canales Martínez y Claudia Tzasna Hernández Delgado, por su asesoría y apoyo durante la realización de mi Pasantía en la Unidad de Biotecnología y Prototipos de la FES Iztacala, UNAM. A la Dra. Lourdes Juárez Mosqueda y al Dr. Jorge Hernández Hernández del Departamento de Morfología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM, por la asesoría y el apoyo para la obtención e interpretación de las micrografías electrónicas, así como a las Maestras en Ciencias Adriana Méndez B. y Ana Luisa Ramírez N. de la Unidad de Microscopía Electrónica, por el apoyo técnico para la realización de las mismas. A mis compañeros del doctorado y de mi trabajo que compartieron conmigo esta experiencia.

6 CONTENIDO Página 1. INTRODUCCIÓN Antecedentes del uso de productos naturales Propóleo Micosis Hongos fitopatógenos Micotoxicosis Estructura fúngica Levaduras Hongos filamentosos La hifa Membrana celular Pared celular Antifúngicos Mecanismo de acción de los antifúngicos PERSPECTIVA TEÓRICA JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS PARTICULARES HIPÓTESIS METODOLOGÍA Diseño experimental 23

7 6.2. Obtención de compuestos de origen natural Extractos de propóleo Extractos herbales Evaluación de la actividad antifúngica Microorganismos utilizados Pruebas de sensibilidad cualitativas Hongos Levaduriformes: Método de difusión en agar Hongos Filamentosos: Método de inhibición del crecimiento radial Pruebas de sensibilidad cuantitativas Hongos Levaduriformes Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM): Método de dilución en placa Método de microdilución para levaduras Determinación de la concentración fungicida mínima Hongos Filamentosos Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM): Método de dilución en placas de 24 pozos Cinéticas de crecimiento Observación de cambios estructurales Microscopía de fluorescencia Microscopía electrónica Determinación comparativa de la composición química del propóleo y extractos activos 34

8 6.6.1 Cromatografía líquida de alta resolución Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas Análisis estadístico RESULTADOS Actividad antifúngica Cinéticas de crecimiento Cambios estructurales Microscopía óptica Microscopia electrónica de transmisión (MET) Micrografías electrónicas de Candida albicans ATCC sin tratamiento Micrografías electrónicas de Candida albicans ATCC incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo Micrografías electrónicas de C. albicans ATCC incubadas 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans sin tratamiento Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus Composición química Cromatografía líquida de alta resolución Cromatografía de gases acoplada a espectrometría 81

9 de masas (GC-MS) 8. DISCUSION RECOMENDACIONES CONCLUSIONES ANEXOS 98 ANEXO I Identificación de especies vegetales 98 ANEXO II Espectros de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas 100 ANEXO III Protocolo de microscopia electrónica de transmisión para levaduras 108 ANEXO IV Pasantía BIBLIOGRAFÍA PUBLICACIONES PUBLICACIONES 118

10 INDICE DE TABLAS Tabla 1 Clasificación de los antifúngicos por su estructura química y mecanismo de acción Página 15 Tabla 2 Rendimiento de los extractos 37 Tabla 3 Tabla 4 Tabla 5 Tabla 6 Tabla 7 Tabla 8 Tabla 9 Tabla 10 Tabla 11 Actividad antifúngica de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos levaduriformes Lectura visual de la prueba de microdilución de Candida albicans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación Lectura visual de la prueba de microdilución de Cryptococcus neoformans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación Lectura espectrofotométrica a 490 nm de la prueba de microdilución después de 48 hrs de incubación CMI y CFM obtenidas para los extractos etanólico de propóleo y metanólico de C. citrinus, con cepas de Candida albicans y Cryptococcus neoformans Prueba de inhibición del crecimiento radial de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos filamentosos Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Rhizoctonia solani CIM del extracto metanólico de R. communis frente Fusarium moniliforme Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Trichophyton mentagrophytes Tabla 12 Número total de hongos inhibidos por cada extracto 51 Tabla 13 Constituyentes de las fracciones del propóleo determinados por Cromatografía Líquida de Alta Resolución Tabla 14 Compuestos volátiles identificados a partir de los espectros de masas del EEP y el extracto metanólico de flores de C. citrinus 80 85

11 INDICE DE FIGURAS Página Fig. 1 Esquema de una levadura en proceso de gemación 9 Fig. 2 Esquema de una hifa 10 Fig. 3 Esquema de la pared celular de una levadura 13 Fig. 4 Representación esquemática de los sitios de acción de diversos grupos de antifúngicos sobre la célula micótica 14 Fig. 5 Flora estudiada de las instalaciones de la FES 25 Cuautitlán, UNAM Fig. 6 Imágenes del Apiario de la FES Cuautitlán 26 Fig. 7 Obtención de extractos 27 Fig. 8 Prueba de difusión en agar para levaduras 39 Fig. 9 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para levaduras 39 Fig. 10 Prueba de microdilución para levaduras 42 Fig. 11 Fig. 12 Fig. 13 Fig. 14 Fig. 15 Fig. 16 Prueba de inhibición del crecimiento radial de hongos filamentosos Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para hongos filamentosos Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin extracto etanólico de propóleo Cinética de crecimiento de C. neoformans con y sin extracto etanólico de propóleo Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin extracto metanólico de flores de C. citrinus Cinética de crecimiento de C. neoformans con y sin extracto metanólico de flores de C. citrinus

12 Fig. 17 Fig. 18 Fig. 19 Fig. 20 Fig. 21 Fig. 22 Fig. 23 Fig. 24 a 26 Fig. 27 a 32 Fig. 33 a 38 Formación de tubo germinativo por C. albicans ATCC Tinción de C. albicans ATCC con Blanco de Calcoflúor Tinción de levaduras de C. neoformans con Blanco de Calcoflúor Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. albicans ATCC Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre la longitud del tubo germinativo de C. albicans ATCC Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. neoformans. Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. albicans y de C. neoformans Micrografías electrónicas de Candida albicans ATCC sin tratamiento Micrografías electrónicas de Candida albicans ATCC incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo Micrografías electrónicas de C. albicans ATCC incubadas 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus Fig. 39 a 42 Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans sin tratamiento 73 Fig. 43 a 48 Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo Fig. 49 a 51 Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas 24 hrs con extracto 75 78

13 Fig. 52 Fig. 53 Fig. 54 metanólico de flores de Callistemon citrinus Identificación del eucaliptol a partir de su espectro de masas Identificación del metil éster del ácido 3-acetoxi-3- hidroxipropiónico a partir de su espectro de masas Identificación del p-ment-1-en-8-ol a partir de su espectro de masas Fig. 55 Identificación del ethanone, 1-[4-[4- (dimethylamino) benzylienamino)phenyl]- a partir de su espectro de masas 104 Fig. 56 Fig. 57 Identificación del metil éster del ácido hexadecanoico a partir de su espectro de masas Identificación del ácido hexadecanoico a partir de su espectro de masas Fig. 58 Identificación del metil éster del ácido 7,10,13- hexadecatrienoico a partir de su espectro de masas 107

14 GLOSARIO DE ABREVIATURAS AcOEt ATCC CFM CIM CLSI DMSO EEP ELISA FES GC-MS h MET L Acetato de etilo American Type Culture Collection Concentración Fungicida Mínima Concentración Inhibitoria Mínima Clinical and Laboratory Standard Institute Dimetilsulfóxido Extracto Etanólico de Propóleo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Facultad de Estudios Superiores Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas hora Microscopia Electrónica de Transmisión microlitros µg miligramos ml mm MOPS NCCLS nm mililitros milímetros 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid National Committee for Clinical Laboratory Standard nanómetros ºC Grados Celsius UFC Unidades Formadoras de Colonias

15 Un elemento de la naturaleza se convierte en recurso natural bajo tres condiciones: primera, que exista el elemento en la naturaleza y que el ser humano lo descubra; segunda, que se le encuentre utilidad o aplicación para satisfacer una necesidad humana; y tercera, que se desarrolle la tecnología que permita utilizarlo apropiada y racionalmente... Tréllez y Quiroz, 1995

16 RESUMEN El uso de productos naturales actualmente es una alternativa válida para enfrentar el proceso salud-enfermedad, siendo los productos apícolas y los extractos herbales algunos de los más usados. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad antifúngica del propóleo de la abeja Apis mellifera, que es la especie con mayor distribución a nivel mundial, y de los extractos de algunas de las plantas que son visitadas por dichas abejas para recolectar resinas, néctar o polen, sobre levaduras y hongos filamentosos de importancia mèdica Con este fin se obtuvieron once extractos, dos de ellos provenientes de propóleo de la abeja Apis mellifera, recolectado en el apiario de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM, y nueve de flores de tres de las plantas visitadas por las abejas dentro de la misma Facultad. Estas fueron Ricinus communis L, Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt y Callistemon citrinus Stapf. Se emplearon ocho cepas de hongos de importancia en medicina humana y/o veterinaria o como fitopatógenos. Estos incluyeron dos hongos levaduriformes, Candida albicans (ATCC 10231) y Cryptococcus neoformans y seis hongos filamentosos, Aspergillus niger, A. flavus (ATCC ), Fusarium moniliforme, Fusarium sporotrichum (ATCC NRLL3299), Rhizoctonia solani y Trichophyton mentagrophytes. Las pruebas de sensibilidad fueron previamente estandarizadas y se desarrollaron en primera instancia pruebas cualitativas de difusión en agar, para tener un panorama general de la sensibilidad de los hongos a cada uno de los extractos. Con los extractos que presentaron actividad frente a uno o más hongos, se realizaron pruebas cuantitativas, empleando los métodos de dilución en agar y de microdilución, determinando así su concentración inhibitoria mínima (CIM) y su concentración fungicida mínima (CFM).

17 Cuatro de las seis cepas probadas resultaron sensibles al extracto de propóleo. Entre los extractos florales, los de C. citrinus fueron los que presentaron mayor similitud con el propóleo. Llama la atención el hecho de que los extractos preparados a partir de flores de E. camaldulensis no presentaron actividad frente a ninguno de los hongos probados. Al determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración fungicida mínima de los extractos se encontró que estas oscilan entre los 0.25 y 2.0 mg/ml para todos los extractos frente a las dos levaduras evaluadas, mientras que en los hongos filamentosos los valores van desde 0.25 hasta más de 3.0 mg/ml. Se realizaron pruebas comparativas de la composición química del propóleo con el extracto metanólico de flores de C. citrinus, empleando técnicas de cromatografía líquida de alta resolución y de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, encontrando ocho compuestos comunes a ambos extractos, los cuales fueron: eucaliptol, metil éster del ácido 3-acetoxi-3- hidroxipropiónico, p-ment-1-en-8-ol, etil éster del ácido dodecanoico, ethanone, (1-[4-[4-(dimetilamino) benzilienamino)fenil]-), metil éster del ácido hexadecanoico, ácido hexadecanoico, metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico. De la misma manera, se observaron las alteraciones morfológicas ocasionadas por dichos extractos a las células fúngicas mediante ensayos de microscopía óptica y electrónica, encontrando cambios en la morfología de C. albicans y de C. neoformans, con degeneración estructural después de la exposición a los extractos. Los datos obtenidos confirman la relación existente entre la composición del propóleo y la de las plantas que visitan las abejas para recolectar algunos ingredientes para su preparación y se plantea la posibilidad de emplear dichas productos como fuentes de principios activos para el tratamiento de las micosis.

18 Introducción

19 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Antecedentes del uso de productos naturales La medicina tradicional ocupa un lugar importante en la realidad médica mundial. Aproximadamente el 60% de la población recurre al uso de las plantas medicinales. En 1976, la Organización Mundial de la Salud (OMS) incorporó la medicina tradicional en sus programas de Salud. En 1991, en China, la OMS declaró el 22 de octubre el "Día Mundial de la Medicina Tradicional", señalando que la salud del género humano aún necesita la medicina tradicional, por lo que recomienda a los estados miembros establecer medidas para su rescate, fortalecimiento, promoción, investigación, regulación, aplicación y seguridad en su práctica. Del vocablo griego pharmakon, remedio y gnosis, conocimiento, la Farmacognosia es una ciencia multidisciplinaria cuyo objetivo fundamental es el estudio de los productos naturales con propiedades medicinales. Las plantas medicinales son recursos naturales que aportan productos herbales valiosos, los cuales son usados desde la antigüedad para tratar varios padecimientos (Chandrasekaran y Venkatesalu, 2004) y algunas de éstas todavía se incluyen como parte del tratamiento habitual de varias enfermedades, entre ellas las provocadas por hongos (Ríos y Recio, 2005). Desde la antigüedad hasta nuestros días los agricultores han utilizado los productos naturales para el control de enfermedades y sus agentes patógenos. Se han realizado preparaciones artesanales tales como: extractos acuosos de la cebolla, del tabaco y piretro, entre otros. Además, en la actualidad existe un auge a nivel mundial en el uso de fitosanitarios naturales debido a la gran contaminación ambiental que existe por los residuos persistentes y tóxicos que dejan los productos sintéticos y ya muchos de ellos han provocado el desarrollo de resistencia de las plagas (Martín, 2003, Mareggiani, 1999). 1

20 Muchos compuestos naturales son capaces de inhibir el crecimiento de microorganismos y actualmente se considera una realidad que el uso de compuestos naturales puede tener un gran impacto en la protección de alimentos y en el control de enfermedades humanas y vegetales (García, 2006), aunque la mayoría de las veces existe un gran desconocimiento sobre cómo emplearlas, sus principios tóxicos y su dosificación para lograr efectos terapéuticos (Martínez, 2003) Propóleo El término Propóleo, etimológicamente se deriva del griego Pro- delante de y Polis ciudad, haciendo referencia a que se encuentra en la entrada y en el interior de la colmena o polis de las abejas (Serrano, 2000). El propóleo es un material multifuncional colectado por las abejas a partir de yemas y pecíolos de las hojas y de sustancias activamente secretadas o exudadas por heridas de diferentes vegetales. Lo elaboran mezclándolas en la colmena con ceras, sus secreciones salivares y otras sustancias en proporciones variables y es usado en la construcción y mantenimiento de sus colmenas (Badascarrasbure et al., 2006). Es una sustancia resinosa, balsámica, gomosa, de consistencia viscosa y color verde pardo, castaño o incluso negro, sabor acre, frecuentemente amargo y olor agradable y dulce. Su color y composición dependen en gran medida de su origen botánico y del tipo de abeja que lo produzca. Las muestras de propóleo presentan diferencias químicas significativas de acuerdo a su procedencia, razón por la cual, se ha convertido en un tema de interés para químicos y biólogos y ha resultado recientemente ser una fuente de nuevos compuestos biológicamente activos (Bankova et al., 2002). Múltiples reportes indican que el propóleo es relativamente no tóxico y tiene diversos efectos sobre bacterias, hongos, parásitos y virus, así como propiedades antitumorales, antioxidantes, como cicatrizante y regenerador de tejidos, entre otros. La composición química del propóleo es muy compleja y depende de varios factores, entre ellos el tipo de vegetales de donde recolectan las abejas algunos 2

21 ingredientes para su preparación (Bankova et al., 2002); se han aislado más de 180 compuestos, siendo sus principales componentes resinas y bálsamos que contienen flavonoides y ácidos fenólicos o sus ésteres (50-55%), reportándose éstos como las principales sustancias farmacológicamente activas; contenidos muy variables de ceras (7.5-35%) que afectarán a los correspondientes componentes restantes; aceites volátiles (10%); polen (5%) e impurezas ( %). Además contienen pequeñas cantidades de terpenos, taninos, restos de la secreción de las glándulas salivares de las abejas y posibles contaminantes y se ha mencionado que se requiere la combinación de diferentes compuestos para que sea biológicamente activo (Bedascarrasbure et al., 2006, González, 2007). Los compuestos activos son: Flavonoides, que incluyen: Flavonas: ramnocitrina, kaempferol, crisina, galangina (3,5,7- trihidroxiflavona), isalpinina, tectocrisina, acacetina, apigenina, pectolinarigenina; 5,7-dioxi-3,4-dimetoxiflavona; 3,5-dioxi-7,4- dimetoxiflavona y 5-oxi-7,4-dimetoxiflavona. Flavonoles: kaempferido, quercetina, butelenol, ramnacina, isoramnetina y ermanina. Flavononas: pinocembrina, pinostrobina, sakuranetina, 5-oxi-7,4- dimetoxiflavonona. Terpeno del grupo del cariofileno: beta-bisabolol y alfa-acetoxibetulenol. Aldehídos aromáticos: vanillina, isovanillina. Ácidos aromáticos no saturados: ácido cinámico y derivados, ácido cumárico, ácido caféico, ácido ferúlico (4-oxi-3-metoxicinámico) y ácido isoferúlico). Ácidos orgánicos: ácido benzoico y derivados (ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-metoxibenzoico, ácido protocatéquico y ácido gálico). Sustancias tánicas. Cumarinas: ácido cumarínico, esculetolo, scopoletolo. 3

22 Vitaminas: vitamina B1 (tiamina), vitamina PP (ácido nicotínico), provitamina A. Microelementos: iones calcio, potasio, sodio, magnesio, hierro, aluminio, fósforo, silicio, vanadio, estroncio. Algunos científicos han señalado además boro, cromo, cobalto, manganeso, níquel, selenio, zinc, molibdeno, plata y bario. El propóleo de la especie Apis mellifera, especie de abeja con mayor distribución en el mundo, ha sido reconocido en países como Cuba, Brasil y Argentina, por las propiedades biológicas que posee. Su estudio científico inició en la década de los 40 s y se ha ido intensificando en la medida en que ha podido descifrarse su compleja composición y se han descubierto nuevos aspectos de su actividad biológica que permiten su uso en diversas áreas como la medicina, la biología y la industria, ya que exhibe un amplio espectro de acciones terapéuticas, destacando la actividad antibiótica, antiviral y antiinflamatoria (Bedascarrasbure et al., 2006, González, 2007). Los estudios de la actividad antifúngica del propóleo han sido limitados, y en principio fueron enfocados casi exclusivamente al género Candida, considerando que los sesquiterpenos, especialmente el bisabolol y flavononas (pinocembrina), son los principales compuestos responsables de esta actividad (González et al., 2007). En los últimos años su estudio se ha ampliado a otras especies de hongos tanto levaduriformes como filamentosos Micosis La micología es una rama de microbiología que tiene por objeto estudiar a los hongos y las enfermedades que producen, las cuales se agrupan en tres campos de estudio: intoxicaciones, alergias y micosis (López, 2008). Las micosis son enfermedades causadas por la invasión de los tejidos por parte de algunos hongos. La mayoría de hongos poseen escaso poder patógeno, por lo que todas las micosis, en principio son oportunistas y es el estado inmunológico 4

23 del paciente lo que determina la gravedad de la infección (López, et al., 2004 y 2009). El establecimiento de una micosis implica la capacidad del microorganismo de crecer en las condiciones de ph, temperatura y potencial redox presentes en los tejidos del hospedero, las cuales generalmente son poco favorables para el crecimiento y desarrollo de los hongos. Los agentes infectantes deben poseer, por lo tanto, ciertas características que les permitan sobrevivir en tal ambiente así como mecanismos para evadir las defensas del hospedero (Casadevall, 1998). La virulencia de un microorganismo depende tanto de sus características como de factores propios del hospedero (Casadevall y Pirofski, 2001), por lo que el establecimiento de una enfermedad infecciosa depende del estrecho equilibrio entre ambos. Las micosis se clasifican de acuerdo a su topografía en cuatro grupos: superficiales, subcutáneas, sistémicas y las causadas por hongos de bajo poder patógeno (oportunistas), estas últimas pueden ser localizadas o bien invadir diferentes órganos y sistemas dependiendo del daño inmunológico que presente el hospedero (López, 2008). En patología veterinaria tienen importancia las enfermedades micóticas debido al carácter zoonótico de la mayoría de estos procesos, a las pérdidas que provocan en animales de producción y a que pueden afectar a especies protegidas (Pérez, 2000). En las dos últimas décadas la frecuencia de las infecciones fúngicas ha aumentado de manera preocupante, representando actualmente del 6-10% de las infecciones nosocomiales, de las cuales el 80% es debido a infección por Candida spp., seguida por la aspergilosis invasiva causada principalmente por el Aspergillus fumigatus, considerada por algunos el mayor problema fúngico actual (Arathoon, 2001). Entre los posibles factores implicados en los cambios epidemiológicos de las micosis están: el aumento en el número de órganos trasplantados, el uso de antibióticos de amplio espectro, la quimioterapia agresiva, los tratamientos inmunosupresores para enfermedades autoinmunes, procedimientos invasivos como el uso de catéteres intravenosos o en las vías 5

24 urinarias, la intubación transtraqueal, los trasplantes de órganos y desde la década de los 80s la aparición del SIDA (Escobar., 2004). Especies de Candida sp. y Fusarium sp., tienen la capacidad de causar micosis en pacientes inmunodeprimidos (Amantea et al.,1995). Algunas de las especies reportadas como responsables de infecciones micóticas oportunistas en la corteza vegetal son Fusarium solani, F. oxisporum, F. moniliforme, F. roseum (Matos et al., 1999). Asimismo, las dermatofitosis son infecciones fúngicas de la piel, uñas y pelo causadas por diferentes tipos de hongos filamentosos denominados dermatofitos que se agrupan en tres géneros: Trichophyton, Epidermophyton y Microsporum. Desde el punto de vista epidemiológico y preventivo, los dermatofitos también pueden agruparse en tres categorías, según sus preferencias por el hospedero y su hábitat natural: especies antropofílicas, zoofílicas y geofílicas (Begoña, 2001). El género Trichophyton representa uno de los principales hongos causantes de dermatomicosis en humanos, infectando de manera característica los tejidos queratinizados. Estas infecciones son difíciles de erradicar, particularmente en los habitantes de los países del tercer mundo, debido a la pobreza y condiciones de sanidad de la población (Kuiate et al., 2006) Hongos fitopatógenos En lo referente a la importancia agrícola, en suelos cultivados aireados, los hongos constituyen gran parte de la masa microbiana total. La patogenicidad por hongos es una característica que se origina en el suelo, ya que algunas especies que normalmente son saprobias pueden invadir tejido vivo y comportarse como agentes patógenos. Pueden ser parásitos facultativos o verdaderos y permanecer inactivos en el suelo por períodos largos si no encuentra la planta hospedera, o bien desaparecer por completo (Moreno, 1988; Mitchell, 1992; Edwards, 1995; Rao, 1995). Sólo una pequeña parte de los hongos del suelo causan enfermedades en vegetales y los que las provocan con frecuencia pertenecen a los géneros Armillaria, Fusarium, Helminthosporium, Ophiobolus, Phytophtora, Plasmodiophora, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillium, Thielaviopsis, Phytium y 6

25 Aspergillus. Otros son cosmopolitas y saprobios como Mucor y Penicillium, entre otros (Sánchez, 2004). Algunos hongos han afectado cultivos comerciales, entre los que se encuentra Rhizoctonia solani, que es un hongo fitopatógeno muy común en el suelo y con una gran diversidad de plantas hospederas, siendo un agente causal de enfermedades en las raíces (Coll y Tandrón, 2005). Además, provoca descomposición de los frutos y enfermedades del follaje, haciendo necesario el uso de biocidas para su control, lo cual induce la resistencia en los patógenos y promueve el uso excesivo de estos productos. Debido a lo anterior, se ocasiona contaminación del ambiente, particularmente en el suelo y el agua, generando gastos adicionales en la producción (Georgiev, 1988) Micotoxicosis Por otra parte, las micotoxinas, metabolitos tóxicos producidos por ciertas especies de hongos fitopatógenos, han ocasionado enfermedades en animales y humanos por el consumo de forrajes y alimentos invadidos por hongos. Cuando son ingeridas en forma gradual y constante en pequeñas dosis, algunas de éstas producen enfermedades graves e incluso la muerte (Agrios, 1996), otras pueden ser neurotóxicas, hepatotóxicas, nefrotóxicas y carcinogénicas (Albright, 2001). Los hongos que producen micotoxinas se encuentran en todo el mundo y los alimentos pueden contaminarse cuando éstos se desarrollan en el campo, durante la cosecha, en el almacenamiento o durante el procesamiento. Las cosechas contaminadas frecuentemente incluyen: maíz, sorgo, cebada, trigo, centeno, arroz y semilla de algodón. Determinadas condiciones ambientales de temperatura y humedad favorecen el desarrollo de los hongos y por consiguiente la generación de micotoxinas. Esto ocurre principalmente en granos, pastas de oleaginosas y en alimentos terminados, siendo en algunos casos inevitable en la industria pecuaria latinoamericana el tener que utilizar granos contaminados, sobre todo en el caso de importaciones, por ser prácticamente imposible su devolución (Aguilar, 2006). 7

26 Los alimentos son deteriorados por hongos cuando sufren cambios inaceptables en su apariencia, textura, olor y sabor o cuando están contaminados con niveles potencialmente peligrosos de una o más micotoxinas. Alimentos para animales con niveles típicamente bajos de micotoxinas son habitualmente consumidos especialmente por el ganado productor de leche y están asociados con pérdidas subclínicas de la producción, aumento de enfermedades y desarrollo reproductivo reducido. En algunos casos, las concentraciones de micotoxinas en alimentos son suficientemente altas para ser asociadas con diversos problemas, incluyendo la muerte (Aguilar, 2006) Estructura fúngica De acuerdo al tipo de crecimiento, los hongos pueden presentarse como levaduras unicelulares, las cuales pueden reproducirse por gemación, o bien como hongos filamentosos, los cuales corresponden a hongos pluricelulares u organismos multinucleados. Algunas levaduras, bajo determinadas condiciones ambientales, pueden sufrir cambios morfogenéticos y comenzar a crecer como un hongo filamentoso. Este fenómeno es conocido como dimorfismo Levaduras Las levaduras no son un grupo taxonómico natural, esto quiere decir que reúne a especies de hongos no emparentadas (Ascomycotas y Basidiomycotas), aunque muestran varias características básicas en su organización celular (Fig. 1). Los principales organelos citoplasmáticos son semejantes a los de cualquier célula eucarionte. El citoplasma puede contener cuerpos lipídicos, glicógeno, e inclusiones cristalinas, algunas de las cuales son esteroles (principalmente ergosterol). Además, contiene una compleja red de microtúbulos, probablemente relacionada con el movimiento de vesículas membranosas que participan en la 8

27 síntesis de pared celular. La levadura se reproduce por gemación y al madurar, la célula hija se separa de la célula madre mediante la formación de un septo. El proceso deja una cicatriz de gemación tanto en la célula madre como en la hija (Hermosilla, 2000, Deacon, 1988) Hongos filamentosos La Hifa Es un filamento de pared rígida en el que fluye el protoplasma (Fig. 2). Su longitud es variable, pero su diámetro es relativamente constante, variando de 1 a 30 μm. El extremo terminal de la hifa se llama ápice o zona de extensión y corresponde a la región de crecimiento más activo de la pared. Figura 1. Esquema de una levadura en proceso de gemación. P, pared celular; Vac, vacuola; CG, cicatriz de una gemación; M, mitocondria; CL, cuerpo lipídico; AG, aparato de Golgi; RE, retículo endoplasmático; V, vesícula; CHP, corpúsculo huso-polar; N, núcleo (Hermosilla, 2000). 9

28 Figura 2: Esquema de una hifa (sección apical): AG, Aparato de Golgi; ER, retículo endoplasmático; L, cuerpo lipídico; M, mitocondria; MI, microcuerpos; N, núcleos; R, ribosomas; V, vesícula citoplasmática; VA, vacuola; W, pared celular (Hermosilla, 2000). La hifa no siempre es un filamento continuo. En hongos superiores, ésta posee paredes transversales, espaciadas regularmente, denominadas septos. Los septos son visibles fácilmente en el microscopio óptico y representan un rasgo taxonómico valioso para la identificación de los distintos grupos fúngicos. Estos septos por lo general tienen poros que permiten el paso del citoplasma e incluso de los núcleos entre diferentes partes de la hifa. Por lo tanto, hablando estrictamente, las hifas no constan de células sino más bien de compartimentos. La membrana plasmática por lo general está muy próxima a la pared celular y firmemente adherida a ésta. Los septos se encuentran en todos los hongos filamentosos, excepto en los Zigomycotas. En este grupo los hongos son aseptados o bien presentan septos muy irregularmente a lo largo de la hifa y por ello son considerados hongos cenocíticos. La longitud del compartimento apical de una hifa varía de acuerdo a la especie. En su extremo prácticamente no hay organelos, pero se encuentran acumuladas muchas vesículas membranosas. La disposición de estas vesículas difiere entre los distintos grupos de hongos. En hongos septados la agrupación apical de vesículas se observa como un cuerpo densamente teñido al microscopio óptico, 10

29 llamado Spitzenkörper. Las hifas normalmente son ramificadas. Estas ramificaciones pueden originarse casi en cualquier punto a lo largo de la hifa, excepto en la región apical. Las ramificaciones primarias pueden formar ramas secundarias y así sucesivamente, hasta constituir el micelio del hongo. A medida que divergen unas de otras, las ramas le dan a la colonia fúngica su perfil circular característico. La mayoría de las hifas son hialinas (incoloras), aunque algunas, especialmente las de los hongos dematiáceos, pueden ser obscuras. Sin embargo, muchos hongos presentan colonias con colores característicos debido a la aparición de esporas reproductivas con pigmentación (Hermosilla, 2000, Deacon, 1988) Membrana celular La membrana celular desempeña una importante función en la división celular y en el metabolismo. Las complejas partículas lipídicas llamadas esterolatos, representan aproximadamente el 25 % de sus componentes. Sin embargo, el contenido de esterol en las células fúngica y mamífera es diferente. En los mamíferos el colesterol es el esterol que predomina, mientras que en las células fúngicas el esterol primario es el ergosterol y entre sus funciones están: dar fluidez e integridad a la membrana, permitir la función apropiada de muchas enzimas unidas a ella y, al favorecer la función de la quitina sintetasa, permitir el crecimiento y la división celular. Esta característica ha sido explotada y se ha convertido en el blanco de acción de la mayoría de los fármacos antifúngicos (Tapia, 2005) Pared celular La pared celular de los hongos cumple varias funciones importantes. Una de ellas es determinar la morfología celular. La forma en que se desarrolla el hongo, sea filamentoso o levadura, junto con las distintas estructuras diferenciadas que se puedan producir, es un resultado directo de los componentes de la pared celular y la forma en que éstos se organizan durante el crecimiento. Además, la pared celular es la interfase entre el hongo y su medio, protegiendo la célula de la lisis 11

30 osmótica y probablemente de los metabolitos de otros organismos. También sirve como sitio de unión para algunas enzimas y presenta componentes que le permiten al hongo adherirse a distintos sustratos del hospedero. El análisis químico de la pared celular revela un predominio de polisacáridos, pero también grandes cantidades de proteínas y lípidos. Los polisacáridos difieren tanto cuantitativa como cualitativamente en los distintos grupos de hongos, por lo que constituye otro rasgo de valor taxonómico. La composición de la pared celular en hongos es dinámica, variando de acuerdo a las condiciones externas o de acuerdo a las distintas fases del ciclo de vida (Hermosilla, 2000, Deacon, 1988). La pared de todos los hongos contiene una mezcla de compuestos fibrilares y componentes amorfos. Los principales componentes fibrilares incluyen la quitina y la celulosa. La quitina es un polímero lineal de N-acetilglucosamina, con enlaces β (1-4), que forman microfibrillas cristalinas debido a las cadenas lineales y con capacidad para compactarse. Otros componentes importantes son los glucanos (polímeros de glucosa), proteínas, polímeros de galactosamina y polímeros de manosas (mananos). La quitina, aunque no es el componente más abundante en la pared celular de los hongos (1-2%), se encuentra con la suficiente frecuencia como para ser considerada el componente característico (Fig. 3) (Hermosilla, 2000, Deacon, 1988). La pared celular es otro sitio de acción importante para los compuestos con actividad antifúngica (Tapia, 2005) Antifúngicos El concepto de agente antifúngico o antimicótico engloba cualquier sustancia capaz de producir una alteración tal de las estructuras de una célula fúngica que consiga inhibir su desarrollo, alterando su viabilidad o capacidad de supervivencia, bien directa o indirectamente, lo que facilita el funcionamiento de los sistemas de defensa del hospedero (Gregorí, 2005). 12

31 Figura 3: Esquema de la pared celular de una levadura. CW: pared celular; EM, medio extracelular; PM membrana plasmática; gp, glico(mano)proteínas; β-g, β-glucanos; β-g+c, β-glucanos y quitina; ps, espacio periplásmico (Hermosilla, 2000). El interés en el tratamiento de las infecciones por hongos se ha incrementado notablemente y en las últimas décadas se han desarrollado diversos, aunque no numerosos, nuevos fármacos dotados con actividad antifúngica y mayor tolerancia, que contribuyen a mejorar el pronóstico de las micosis, particularmente las oportunistas (Torres, 2004). Las primeras sustancias utilizadas en el tratamiento de las infecciones fúngicas fueron compuestos tales como el yoduro de potasio, metaloides y derivados azufrados. Posteriormente se introdujeron los primeros antifúngicos, denominados de primera generación, por ser derivados de productos naturales o productos de la actividad metabólica de determinados microorganismos. Más tarde se desarrollaron los de segunda generación, obtenidos predominantemente por síntesis química (Escobar, 2004). 13

32 Los primeros antimicóticos fueron descubiertos hace aproximadamente 50 años y desde entonces ha habido grandes avances en la terapia antifúngica. Sin embargo, las patologías han variado durante este período, haciendo necesaria la permanente investigación de nuevos agentes. La mayoría de las micosis superficiales responden bien a los tratamientos actuales, pero el creciente espectro de micosis sistémicas diseminadas ha forzado el desarrollo de nuevas moléculas (Gregorí, 2005). La clasificación de los antifúngicos se realiza según criterios convencionales que atienden a los siguientes aspectos: estructura o características (polienos, azoles, alilaminas, etc), origen (sustancias producidas por organismos vivos o derivados de síntesis química), espectro de acción (amplio o restringido), mecanismos de acción (fungistáticos y fungicidas), vía de administración o empleo sobre el hospedero (oral o parenteral, tópicos o sistémicos), toxicidad y selectividad de acción (Vargas, 2005) Mecanismo de acción de los antifúngicos La figura 4 resume las estructuras de la célula micótica sobre las cuales actúan los diversos grupos de antifúngicos. Figura 4: Representación esquemática de los sitios de acción de diversos grupos de antifúngicos sobre la célula micótica (Modificado de Tapia, 2005). 14

33 Tabla 1. Clasificación de los antifúngicos por su estructura química y mecanismo de acción Sitio de acción Grupo de antifúngicos Ejemplos Mecanismo de acción Antifúngicos interactuando en membrana celular Polienos Nistatina, nistatina liposomal, natamicina, anfotericina B Se unen de manera irreversible a los componentes de la membrana plasmática e interactúa con el ergosterol, pero sin inhibir su síntesis. Al unirse al ergosterol, se forman poros que alteran la permeabilidad de la membrana lo que permite una pérdida de proteínas, glúcidos y cationes monovalentes y divalentes, causando la muerte celular (Gregorí, 2005; Tapia, 2005). Azoles Imidazoles: miconazol, clotrimazol, ketoconazol, econazol, bifonazol Triazoles: fluconazol, itraconazol Triazoles de segunda generación: voriconazol, ravuconazol, posaconazol Inhiben la biosíntesis de ergosterol en el paso de desmetilación del lanosterol, en el carbono 14; por lo tanto, su blanco es la lanosterol-14-alfa-desmetilasa, que es una de las especies del citocromo P-450 (P A), localizada en el retículo endoplasmático. La disminución del ergosterol más la acumulación de esteroles metilados causa una alteración de la membrana celular, la que se vuelve más permeable y vulnerable a daños. Así, se altera el transporte de nutrientes y la síntesis de quitina, lo que puede inhibir el crecimiento (Gregorí, 2005; Tapia, 2005). Algunos de los azoles son menos selectivos y suelen actuar sobre enzimas hepáticas causando hepatitis fulminantes, ya que el mecanismo descrito compromete funciones que dependen de la membrana, en la que puede haber otras enzimas. (Tapia, 2005). Alilaminas Terbinafina, naftifina De forma similar a los azoles inhiben la síntesis del ergosterol, pero en un paso temprano de su síntesis. Las alilaminas inhiben a la enzima escualeno epoxidasa, de esta forma disminuye la concentración de ergosterol, aumentan los niveles de escualeno, aumenta la permeabilidad de la membrana celular, se interrumpe la organización celular y disminuye el crecimiento del hongo (Gregorí, 2005). Tanto la escualeno epoxidasa como la lanosterol-14-alfa-desmetilasa, inhibida por los azoles, son enzimas codificadas por una familia de genes que pueden mutar y generar una resistencia secundaria a los antimicóticos (Tapia, 2005). 15

34 Sitio de acción Grupo de antifúngicos Ejemplos Mecanismo de acción Antifúngicos interactuando en pared celular Lipopéptidos Papulacandinas Triterpenos glicosilados Equinocandinas: caspofungina, anidulofungina, micafungina Son antifúngicos que actúan sobre la pared celular, y lo hacen inhibiendo la síntesis de glucanos a través de la inactivación de la enzima 1,3-betaglucano sintetasa. La falta de glucanos en la pared celular la vuelve débil e incapaz de soportar el estrés osmótico, por lo que muere (Gregorí, 2005). Ya que los glucanos no se encuentran en la célula eucarionte humana, estos compuestos son relativamente selectivos (Tapia, 2005). Antifúngicos interactuando en núcleo celular Pirimidinas fluoradas (Antimetabolitos) Flucitosina o 5-fluorocitosina Puede entrar en el citoplasma de la célula fúngica gracias a la enzima citosina permeasa, que no está presente en las células de mamíferos, por eso es específica. Al entrar en la célula, esta molécula sufre modificaciones y es convertida en 5- fluorouracilo (5-FU) por la citosina diaminasa. El 5-FU es fosforilado e incorporado dentro del ARN en lugar del uracilo y así origina una fluorouridina aberrante y por lo tanto un ARN mutante. De esta manera se ve inhibida la enzima timidilato sintetasa, que permite el paso de uridina a timidina, porque el ADN está constituido por timidina y no por uracilo, afectando entonces no sólo la síntesis de proteínas, sino también la síntesis de ADN (Gregorí, 2005; Tapia, 2005) Agentes misceláneos Yoduro de potasio, ciclopirox, tolnaftato, griseofulvina En esta clase se encuentra la griseofulvina, cuyo mecanismo de acción consiste en inhibir la mitosis de los hongos con la producción de células multinucleadas. Interactúa con los microtúbulos polimerizados e interrumpe el huso mitótico necesario para efectuar la división celular. Tiene el inconveniente de que se debe administrar por períodos muy prolongados, de seis meses a un año. Además, como es poco selectiva, hay que controlar su uso con hemograma. Por estos motivos, hoy está en desuso (Tapia, 2005). 16

35 Perspectiva teórica

36 2. PERSPECTIVA TEÓRICA Durante los últimos 30 años se han intensificado los estudios farmacológicos y químicos del propóleo, demostrando que los extractos de diversas regiones geográficas tienen diferente actividad biológica (Bankova, 2002, Kosalec, 2005), lo cual se ha atribuido a diferencias en su composición química, y además influyen diversos factores como son la época de recolección, el tipo de vegetación, la especie de abeja, la temporada de recolección, el método de preparación de la tintura y el disolvente usado para su extracción (Bankova, 2002, Kosalec, 2005, Kujumgiev et al., 1999, Sforcin et al., 2000). Además, se sabe que se requiere la combinación de diferentes compuestos para que sea biológicamente activo (Bankova et al., 1995, Kujumgiev et al., 1999, Sforcin et al., 2000). Por otra parte, las plantas medicinales se han usado desde la antigüedad para el tratamiento de diversos padecimientos (Chandrasekaran y Venkatesalu, 2004; Ríos y Recio, 2005). La OMS estima que entre el 60 y el 80 % de los habitantes de nuestro planeta confían en las medicinas tradicionales para sus principales necesidades, razón por la cual ha hecho un llamado a todos los países que la conforman a promover su uso y establecer programas de investigación en este campo. Este proyecto contempló tres etapas: Primero, la evaluación antifúngica del propóleo y extractos herbales contra cepas de hongos patógenos, segundo, evaluar el efecto de los extractos sobre las estructuras micóticas y tercero establecer la composición química de los extractos y determinar cuál o cuáles de ellos se encuentran en más de un extracto. Se evaluó la actividad antifúngica de extractos del propóleo y de las flores de tres plantas, Callistemon citrinus Stapf, Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt y Ricinus communis L, que son visitadas por las abejas para la elaboración del propóleo en el Estado de México, y se comparó con la del propóleo producido por las abejas en la misma zona. 17

37 En cuanto a las plantas empleadas, se encuentra que el C. citrinus se reporta la mayoría de las veces con uso ornamental y existen pocos reportes de su actividad antibacteriana (Cock, 2008, Meléndez et al 2008). En diversas ocasiones se ha demostrado la actividad antibacteriana del E. camaldulensis (Martos et al, 2000) y en cuanto a R. communis, tradicionalmente se ha empleado su resina, con la debida consideración de su alta toxicidad, pero además se ha demostrado que posee diversas actividades biológicas como bactericida, insecticida y vermífuga, entre muchas otras (Duke and Wain, 1981). Actividad antifúngica La actividad antifúngica de las plantas ha sido muy estudiada y su importancia resulta mayor ante la gran problemática de las enfermedades causadas por hongos que son muy difíciles de tratar por factores como inmunodeficiencias de distintas etiologías o resistencia a los antifúngicos por muchos hongos patógenos (Amantea et al.,1995). El propóleo muestra, en distintos grados, efectos fungicidas frente a numerosas especies como Candida albicans, Aspergillus niger, Botrytis cinerea, Ascosphaera apis y Plasmopara vitícola (Krell, 1996). La mayor inhibición sobre hongos patógenos se observa en Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans y Malassezia pachydermatis (Heinze, et al., 1998) y, en el género Candida, el efecto del propóleo depende de las especies, siendo de mayor a menor en C. albicans, C. tropicalis, C. krusei y C. guilliermondii. (Ota et al., 2001). En un estudio se observó que la actividad antifúngica de los extractos etanólicos de propóleo actúan de manera similar a la griseofulvina frente a dos variedades de Aspergillus flavus, pues ambas sustancias reducen la masa miceliar seca, la germinación de conidios, el crecimiento y la producción de aflatoxina B1, tanto más cuanto mayor sea su concentración (Ghaly, 1998). 18

38 Otros reportes indican que en mucosa oral frente a Candida albicans, el extracto etanólico de propóleo al 20% se muestra tan efectivo como la nistatina y supera a otros antifúngicos como clotrimazol, econazol y fluconazol que presentan resistencias (Martins, 2002). Desde 1988 se reportó la actividad del extracto etanólico de propóleo contra 23 cepas de levaduras aisladas de diferentes partes del cuerpo humano, encontrando que fue fungistático a una concentración de 0,55 mg/ml (Rojas, 1988). Otros autores reportaron que la mínima concentración fungicida del extracto etanólico de propóleo contra 15 cepas probadas fue de 3 a 7 mg/ml siendo, C. albicans más susceptible que otras especies como C. tropicalis, C. krusei, y C. guilliermondii (Martins, 2002). En un estudio previo realizado en nuestro laboratorio (Quintero, 2008), se evaluó la actividad antifúngica de ocho extractos etanólicos de propóleo provenientes de diferentes regiones de México frente a 36 cepas de C. albicans de origen clínico y una de referencia (ATCC 10231) y se demostró que todos presentaron actividad biológica contra C. albicans, aunque con variaciones en los valores de CIM, pero dentro de los rangos reportados en otras partes del mundo, los cuales oscilan entre 0,2 y 12 mg/ml (Palamin, 1999, Ota, 2001, Hegazi, 2001, Sawaya, 2002). No se encontraron referencias para poder establecer una comparación con otros estudios sobre la actividad antimicótica del propóleo mexicano fabricado por A. mellifera con la mostrada por los extractos florales de las especies vegetales visitadas por ellas. En general, los estudios que relacionan compuestos florales con productos apícolas tienen que ver con el uso del polen de Apis meliffera por los humanos, como fuente de alimento, como adyuvante en el tratamiento de diversas enfermedades o como suplemento nutricional. 19

39 Justificación

40 3. JUSTIFICACIÓN Este proyecto responde a la necesidad de contar con nuevos compuestos que presenten actividad contra hongos, ya que: Ha habido un notable incremento en la incidencia de micosis, especialmente en las últimas décadas. Pocos laboratorios realizan pruebas de sensibilidad a antifúngicos Existen pocos principios activos contra hongos y la mayoría de los que existen presentan alta toxicidad. Muchas cepas de hongos desarrollan resistencia a los compuestos antifúngicos. Una buena parte de la población recurre a la medicina tradicional y el uso de estos productos está ampliamente documentado, sin embargo, pocas son las especies que se han estudiado científicamente. 20

41 Objetivos

42 4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GENERAL: 1. Evaluar la actividad antifúngica del propóleo de la abeja Apis mellifera y de los extractos de plantas visitadas por las abejas, sobre levaduras y hongos filamentosos OBJETIVOS PARTICULARES: 1. Obtener propóleo del apiario de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. 2. Evaluar la actividad biológica del propóleo frente a hongos filamentosos y levaduriformes, empleando pruebas cualitativas y cuantitativas. 3. Determinar cuáles son las especies de plantas que son visitadas por las abejas para recolectar resinas, néctar o polen y recolectar muestras de sus flores. 4. Obtener los extractos de las plantas y determinar si presentan actividad antifúngica frente a los hongos inhibidos por el propóleo. 5. Determinar mediante cromatografía líquida de alta resolución (CLAR/HPLC, High performance liquid chromatography,) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, si el propóleo contiene el (los) mismo(s) compuesto(s) activo(s) que las especies de plantas evaluadas. 6. Determinar si hay cambios estructurales en las células fúngicas, tras la exposición al compuesto, mediante ensayos de microscopía óptica y electrónica. 21

43 Hipótesis

44 5. HIPÓTESIS Se ha determinado que el propóleo presenta metabolitos secundarios que poseen actividad antimicrobiana; entonces, es muy probable que el propóleo colectado del apiario de la FES Cuautitlán, al igual que los extractos de las especies vegetales que visitan las abejas de esta región, presenten actividad sobre especies de hongos filamentosos y levaduriformes. 22

45 Metodología

46 6. METODOLOGÍA 6.1. Diseño experimental OBTENCIÓN DE MUESTRAS PROPÓLEO ESPECIES DE PLANTAS VISITADAS POR LAS ABEJAS OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DETERMINACIÓN COMPARATIVA DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL PROPÓLEO Y EXTRACTOS ACTIVOS EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN, CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS PRUEBAS CUALITATIVAS: DIFUSIÓN EN AGAR INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO RADIAL PRUEBAS CUANTITATIVAS: CIM, CBM, CFM CURVAS DE CRECIMIENTO DETERMINACIÓN DE CAMBIOS ESTRUCTURALES EN CÉLULAS FÚNGICAS: MICROSCOPÍA ÓPTICA Y ELECTRÓNICA ANÁLISIS ESTADÍSTICO 23

47 6.2. Obtención de compuestos de origen natural Las muestras de las especies de plantas que son visitadas por las abejas y de propóleo empleadas en el presente estudio fueron recolectadas en las instalaciones de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (Km 2.5 Carretera Cuautitlán Teoloyucan, San Sebastián Xhala, Cuautitlán Izcalli, Estado de México, CP 54700, Campus 4, Universidad Nacional Autónoma de México) (Fig. 5) Extractos de propóleo Se obtuvo propóleo de la abeja Apis mellifera, procedente del apiario de la FES Cuautitlán (Fig. 6). La muestra de propóleo se pesó, maceró y cubrió con etanol al 96%. Se dejó en reposo y protegido de la luz durante dos semanas. Posteriormente fue filtrado y se realizó una partición con hexanos. Se calculó el rendimiento para cada extracto obtenido. Ambos extractos fueron almacenados en lugar fresco y seco, protegidos de la luz (Fig. 7) Extractos herbales Colecta del material Se colectaron flores dentro de la Facultad de tres plantas que son visitadas por las abejas para la elaboración del propóleo y otros productos apícolas, comúnmente conocidas como Cepillo, Eucalipto e Higuerilla. A la vez se colectaron ejemplares para herbario, las cuales fueron prensadas y secadas para realizar la identificación taxonómica de cada espécimen. La identificación del material botánico fue realizada en el herbario de la FES Iztacala y un ejemplar de cada una de ellas fue integrado a su colección etnobotánica. 24

48 Obtención de los extractos herbales Las flores colectadas se dejaron secar completamente y posteriormente fueron pesadas, molidas y almacenadas en un lugar seco. Para obtener los extractos al material seco y triturado se le agregaron disolventes en orden creciente de polaridad (hexano, acetato de etilo, metanol). Los extractos se filtraron y concentraron a sequedad por destilación a presión reducida. Se eliminaron los restos de disolventes por aireación (Fig. 7), se calculó el rendimiento para cada extracto obtenido y se almacenaron en lugar fresco y seco. Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt Eucalipto Callistemon citrinus Stapf Cepillo E. camaldulensis Dehnhartdt Eucalipto Ricinus communis L Higuerilla Fig. 5. Flora estudiada de las instalaciones de la FES Cuautitlán, UNAM: Se muestran algunos de los ejemplares herbales de donde se obtuvo el material botánico para la preparación de los extractos. 25