Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud. Cátedra: Química Biológica I Año 2017

Transcripción

1 Trabajo Práctico: LÍPIDOS EXTRACCIÓN E IDENTIFIACIÓN OBJETIVOS -Evidenciar las propiedades de lípidos. -Comprobar la presencia de los lípidos complejos en cerebro de vaca luego de extracción con diferente solvente y posterior fraccionamiento de los extractos. INTRODUCCIÓN TEÓRICA Los lípidos, son un grupo heterogéneo de compuestos, muy diversos desde el punto de vista de su composición química, pero poseen características físicas y biológicas comunes. Una característica fundamental de este grupo de moléculas es su hidrofobicidad, lo que los hace insolubles en agua y solubles en disolventes apolares como el cloroformo, el éter, el hexano, permitiendo su extracción de las células y de los tejidos. Existen ciertos lípidos de naturaleza anfipática, es decir que contienen regiones hidrofóbicas y regiones hidrofílicas. La mayor parte de los lípidos abundantes en la naturaleza (triacilgliceroles), están formados por ácidos grasos de cadenas hidrocarbonadas pares, saturados o insaturados. Los lípidos llevan a cabo múltiples funciones en el organismo, como: almacenamiento de energía, transporte, funciones hormonales, actuar como vitaminas, formar parte de las membranas celulares confiriéndoles la propiedad de permeabilidad selectiva, al permitir el paso o no de algunas sustancias y en determinada dirección, así como la conducción nerviosa y el transporte activo como la bomba de Na + /K +. A diferencia de los glúcidos, proteínas y ácidos nucleicos, no forman polímeros, son más bien moléculas pequeñas que presentan una fuerte tendencia a asociarse mediante fuerzas no covalentes. Algunas de las propiedades de los lípidos pueden ser usadas para su reconocimiento, ya que pueden reaccionar con una variedad de agentes originándose productos coloreados, desprendimiento de vapores, formación de jabones, entre otros. Una forma de clasificarlos es la siguiente: 37

2 Lípidos simples: Ceras Triglicéridos: grasas y aceites. Lípidos complejos: Fosfolípidos: Fosfogliceridos Fosfoesfingosidos Glicolípidos: Glicoesfingosidos Sustancia relacionadas: Derivados del CPPHF Prostaglandinas Leucotrienos Tromboxanos El tejido adiposo está constituido principalmente por las grasas neutras. En cambio, los componentes típicos del cerebro son los lípidos. La sustancia blanca contiene proporcionalmente más lípidos que la gris. El contenido total alcanza del 12 al 15% del peso fresco, aproximadamente la mitad del peso seco. El colesterol está ampliamente distribuido en todas las células del organismo, pero especialmente en las del tejido nervioso. Es el constituyente de mayor importancia en las membranas celulares y de las lipoproteínas plasmáticas. Existen en las grasas animales pero no es las vegetales. Aproximadamente la mitad del colesterol del organismo se origina de su síntesis y el resto es proporcionado por una alimentación promedio. Los fosfolípidos son lípidos complejos, que contiene además de ácidos grasos y un alcohol, un residuo de ácido fosfórico, con frecuencia tiene bases nitrogenadas y otros sustituyentes. Glicerofosfolípidos: el alcohol es el glicerol Esfingofosfolípidos: el alcohol es la esfingosina. Los fosfolípidos son los principales constituyentes lipídicos de las membranas. 38

3 Los glucolípidos, son lípidos complejos, que contienen un ácido graso, esfingosina y carbohidratos. Los glucolípidos están distribuidos ampliamente en todo el tejido del cuerpo, en particular en el tejido nervioso (como el cerebro). En especial se encuentran en la capa externa de la membrana plasmática donde forman parte de los carbohidratos de la superficie celular. 39

4 PARTE EXPERIMENTAL I - Extracción de lípidos Basados en la solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos, es posible extraer y purificar lípidos del cerebro por sucesivas extracciones con diferente solvente y posterior fraccionamiento de los extractos para obtener fracciones ricas en: esteroles, glicerofosfolípidos y glucolípidos. El esquema se basa en los siguientes hechos: Los esteroles son solubles en acetona, al contrario de lo que sucede con otros lípidos complejos. Algunos glicerofosfolípidos, como las lecitinas, la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina, son solubles el éter e insolubles en acetona. Los glucósidos de esfingosina se disuelven en alcohol caliente y son insolubles en acetona y éter. Reactivos: Tejido: cerebro de vaca o cordero. Alcohol etílico. Éter de petróleo. Acetona. Pesar 20 g de cerebro triturarlo en mortero y secarlo parcialmente en un vaso de precipitado. Agregar 50 ml de alcohol etílico, llevar a ebullición y mantenerlo por 3 minutos, luego filtrar por gasa. El filtrado se concentra en manta calefactora hasta unos 30 ml y se agregan luego 25 ml de éter de petróleo, agitar y separar en ampolla de decantación. Se obtienen dos fracciones: Fracción superior A: etérea, que tendrá disueltos lecitina, cefalina, grasas, colesterol y restos de esfingomielina y cerebrósidos. Fracción inferior B: alcohólica que tendrá disueltos esfingomielina y cerebrósidos. Realizar su reconocimiento. 40

5 Fracción A: concentrar en baño María a mitad de volumen inicial y agregar 25 ml de acetona: se observará un precipitado que corresponde principalmente a fosfolípidos, quedando en solución el colesterol y las grasas. Separar por centrifugación obteniendo un sobrenadante C y un precipitado D. Sobrenadante C: separar en dos fracciones, en una reconocer grasas y en la otra extraer el colesterol con 10 ml de éter, separar en ampolla de decantación y reconocer el colesterol. Precipitado D: reconocer lecitina y cefalina como fosfolípidos. II - Reacciones de reconocimiento 1 - Reconocimiento de grasas: Prueba de saponificación. Fundamento: la saponificación es una reacción química entre un ácido o un lípido saponificable, y una base, en la que se obtiene como principal producto la sal correspondiente. Así, los jabones son las sales de ácidos grasos y metales alcalinos que se obtienen mediante este proceso. Objetivo: identificar ácidos grasos presente en los lípidos tras la hidrolisis de estos y posterior formación de jabones. Reactivos NaOH 40 %. Etanol Calor H 2 SO 4 NAOH 41

6 Se separan las grasas por saponificación, para esto se coloca 1 ml de la muestra, 1 ml de etanol y 0,5 ml de hidróxido de sodio al 40%. Calentar suavemente. Agregar unas gotas de ácido sulfúrico. Resultado positivo: La presencia de enturbiamiento indica liberación de ácidos grasos. 2 - Reconocimiento de colesterol: reacción de Lieberman Burchard. Objetivo: Evidenciar la presencia de colesterol tras reaccionar con anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado, para lograr la formación de una solución coloreada. Fundamento: El colesterol reacciona con anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado. Se produce una pérdida de agua y una protonización del colesterol. Se constituyen en medio anhidro polímeros de hidrocarburos no saturados de intenso color verde azulado. Reactivos Cloroformo. Anhídrido acético. H 2 SO 4 Secar la muestra sobre manta calefactora. Resuspender en 2 ml de cloroformo. En un tubo de ensayo mezclar 1 ml de anhídrido acético y 1 ml de cloroformo. Enfriar a 0 C en baño de hielo. Agregar al tubo los 2 ml de la muestra y colocar en hielo. Agregar por las paredes 1 gota de ácido sulfúrico cc. Enfriar y observar. Una coloración verde azulada en la fase superior indica la presencia de grupo esteroide, colesterol en nuestro caso. 3 - Reconocimiento de cerebrósidos: Objetivo: Identificar glúcidos mediante la reacción de Molish. (Ver TP H de Carbono). 42

7 4 - Reconocimiento de fosfolípidos: lecitina y cefalina mediante la determinación de la presencia de fósforo. Objetivo: Demostrar la presencia de fosforo unido a distintos lípidos por medio de la combinación de una reacción de óxido-reducción y formación de un complejo coloreado. La reacción se basa en que el fosfato inorgánico, en medio ácido, con el molibdato (reactivo 1) da fosfomolibdato, color amarillo, que es reducido luego por el ácido ascórbico (reactivo 2) a azul de molibdeno, color azul verdoso. El reactivo 3 (arsenito/citrato) se combina con el exceso de molibdato impidiendo su reacción posterior con fosfatos liberados de ésteres lábiles, lo que se aprovecha cuando se quiere determinar fosfato inorgánico libre en presencia de, por ejemplo, fosfolípidos (que no es nuestro caso). Muestra soluble de ppdo D Reactivo 1 1 ml 0,5 ml Mezclar y esperar 30 segundos. Reactivo 2 0,5 ml Mezclar y esperar 30 segundos. Reactivo 3 0,75 ml Mezclar. Incubar 10 minutos a 37. Resultado positivo: La presencia de color azul demuestra la presencia de fosfato unido a lecitina y cefalina en el tejido. 43

8 Guía de problema (entrega obligatorio individual) 1- Los fosfolipidos experimentan la saponificación de manera muy parecida a los triglicéridos. Dibujar la estructura de un fosfolípido que cumpla con los siguientes criterios. Después dibujar los productos que resultarían de su saponificación. a) Una cefalina que contenga ácido esteárico y ácido oleico. b) Una lecitina que contenga acido palmítico. 2- Fundamentar la reacción de reconocimiento de colesterol. 3- Cuál es el papel de los lípidos en la regulación de la fluidez de la membrana plasmática? Bibliografía _ Morrison, Boyd. Química Orgánica. Fondo Educativo Interamericano. S.A. México _ Feduchi. Bioquímica: conceptos esenciales. Ed. Panamericana.España.2014 _ Cooper s. La célula. Ed. Marban. 3 Ed _ Lehninger. Principios de Bioquímica. Ed. Omega. 4 Ed