INFLUENCIA DE LA VITAMINA D EN LA CONSOLIDACIÓN DE FRACTURAS EN RATAS ANCIANAS

Transcripción

1 UNIVERSIDAD DE JAÉN FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD TESIS DOCTORAL INFLUENCIA DE LA VITAMINA D EN LA CONSOLIDACIÓN DE FRACTURAS EN RATAS ANCIANAS PRESENTADA POR: ALBERTO D. DELGADO MARTÍNEZ DIRIGIDA POR: DR. D. LUIS MUNUERA MARTÍNEZ DRA. DÑA. Mª EUGENIA MARTÍNEZ GÓMEZ JAÉN, 15 DE DICIEMBRE DE 1995 ISBN

2 INFLUENCIA DE LA VITAMINA D EN LA CONSOLIDACIÓN DE FRACTURAS EN RATAS ANCIANAS I.S.B.N Centro Departamento Delgado Martínez Alberto D Facultad de Medicina Cirugía

3 Nombre y apellidos del autor Apellidos Nombre DELGADO MARTÍNEZ ALBERTO D. Título de la Tesis Doctoral INFLUENCIA DE LA VITAMINA D EN LA CONSOLIDACIÓN DE FRACTURAS EN RATAS ANCIANAS Fecha de lectura 15 DE DICIEMBRE DE 1995 Centro y Departamento en que fue realizada la lectura Centro Departamento Facultad de Medicina Cirugía Composición del Tribunal / Dirección de la tesis Dirección de la Tesis Presidente/a del Tribunal Dr. D. Luís Munuera Martínez y Dra. Dª Mª Eugenia Martínez Gómez Dr. D. Hipólito Durán Sacristán Vocales Dr. D. Julio Fuentes Losa Dr. D. Aurelio Rapado Errazti Dr. D. Antonio López Alonso Secretario/a Dr. D. Antonio Gómez Pan Calificación obtenida APTO CUM LAUDE POR UNANIMIDAD

4 Resumen Para conocer el efecto de la Vitamina D sobre la consolidación de las fracturas, se diseño un modelo experimental en rata Wistar hembra de 18 meses de edad. 55 ratas iniciaron el estudio, dividiéndose aleatoriamente en dos grupos: uno, en el que se indujo un déficit dietético de Vitamina D durante 6 semanas, y otro, control, sin déficit. Tras este periodo, se realizó una fractura experimental en el tercio medio de ambos fémures. En ese momento se subdividieron ambos grupos en dos: uno en los que se realizó una suplementación con Calcidiol durante la consolidación de la fractura, y otro en el que no (control). Tras 5 semanas de consolidación, se sacrificaron los animales, extrayéndose los fémures y las tibias. Se obtuvierón muestras de sangre al inicio del estudio, 2 días antes de la fractura, y al sacrificio, determinándose los niveles séricos de Calcidiol, Calcitriol y PTH. Se realizó estudio histológico sobre 16 callos de fractura, midiéndose la anchura máxima media de los ribetes de osteoide, así como la proporción de los distintos tipos de tejido (óseo, cartilaginoso, fibroso) en el callo. No se encontraron diferencias significativas entre los distintos grupos. Se aplicó la densiometría a 57 fémures y 69 tibias. No se apreciaron diferencias en la densidad ósea del callo en función de la suplementación o el déficit de Vitamina D. La deficiencia de Vitamina D produjo una perdida de masa ósea del callo en función de la suplementación o el déficit de Vitamina D. La deficiencia de Vitamina D produjo una perdida de masa ósea en la cabeza del fémur, así como en las epífisis de la tibia. No se apreciaron diferencias en cuanto a la masa ósea del hueso sano en función de la suplementación con 25-

5 OH-Vitamina D mejoró la densidad ósea del hueso sano y del callo de fractura correlaciono con los niveles de Calcidiol al inicio de la experimentación. También se realizó ensayo de torsión a baja velocidad de los fémures y las tibias. La suplementación con 25-OH-Vitamina D mejoró de forma significativa la resistencia mecánica del hueso fracturado. Sin embargo, la deficiencia en este elemento no empeoró dicha consolidación respecto a las ratas normales. La resistencia mecánica del callo de fractura pareció depender en parte de los niveles de Calcitriol y PTH previos a la experimentación. La resistencia mecánica del hueso intacto no pareció alterarse ni con la suplementación ni con el déficit de Vitamina D, producido experimentalmente durante 5 y 11 semanas, respectivamente. La resistencia mecánica del hueso intacto parece depender, en parte, de los niveles de Calcidiol y Calcitriol al inicio del estudio.

6 INFLUENCIA DE LA VITAMINA D EN LA CONSOLIDACIÓN DE FRACTURAS EN RATAS ANCIANAS ALBERTO D. DELGADO MARTÍNEZ

7 DIRECTORES Esta Tesis doctoral fue dirigida por el Profesor D. Luis Munuera Martínez, Catedrático de Traumatología de la Universidad Autónoma de Madrid, y Jefe del Departamento de Traumatología del Hospital "La Paz", y codirigida por Dra. María Eugenia Martínez Gómez, facultativa del servicio de bioquímica del Hospital "La Paz" de Madrid. Presidente: MIEMBROS DEL TRIBUNAL * Prof. D. Hipólito Durán Sacristán. Catedrático de Cirugía. Universidad Complutense de Madrid. Vocales: * Prof. D. Julio Fuentes Losa, Catedrático de Ingeniería Mecánica de la Universidad Nacional de Educación a distancia (UNED). * Prof. D. Aurelio Rapado Errazti, Catedrático de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid (UAM). * Prof. D. Antonio López Alonso, Catedrático de Traumatología de la Universidad de Alcalá de Henares. * Dr. D. Antonio Gómez Pan, subdirector de investigación del hospital "La Paz". LECTURA La lectura y defensa pública tuvo lugar en el salón de grados de la facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid el Viernes día 15 de Diciembre de 1995, a las horas. La calificación obtenida fue de Apto cum laude por unanimidad. PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS 1. Delgado-Martínez, AD; Carrascal, MT; Martínez, ME; Rodríguez-Avial, M; Munuera, L. (1998): Effect of 25-OH-vitamin D on fracture healing in elderly rats. Journal of Orthopaedic Research, 16: Delgado-Martínez, AD; Munuera, L. (1999): Effect of 25-OH-vitamin D on fracture healing in elderly rats [reply-letter] Journal of Orthopaedic Research, 17:795.

8 INFLUENCIA DE LA VITAMINA D EN LA CONSOLIDACION DE FRACTURAS EN RATAS ANCIANAS Alberto D. Delgado Martínez

9 Prof. D. Luis Munuera Martínez, Catedrático del Departamento de Cirugía de la Universidad Autónoma de Madrid, y Jefe del Departamento de Traumatología y Cirugía Ortopédica del Hospital "la Paz", y Dª. María Eugenia Martínez Gómez, doctora en farmacia, adjunta del servicio de Bioquímica Clínica del Hospital "la Paz", CERTIFICAN: Que D. Alberto D. Delgado Martínez ha realizado, bajo su dirección, el trabajo titulado "Influencia de la vitamina D en la consolidación de fracturas en ratas ancianas", que presenta como tesis doctoral para la obtención del grado de Doctor en Medicina y Cirugía. Madrid, a 6 de Noviembre de 1995 Fdo: Prof. Dr. Luis Munuera Dra. Mª Eugenia Martínez

10 AGRADECIMIENTOS Ante todo, al Prof. D. Luis Munuera, sin cuya ayuda y empuje inicial hubiera sido imposible la realización de este trabajo. Su constante apoyo fue fundamental para el buen término de la obra. Sus enseñanzas de metodología y lógica fueron claves en este trabajo. A la Dra. Mª Eugenia Martínez, gran conocedora de los entresijos de la vitamina D, cuyos sabios consejos y dirección me ayudaron a no cometer más de un error, y por su gran ayuda en el diseño experimental. Al Dr. Enrique de Miguel, jefe del servicio de cirugía experimental del hospital "la Paz", por su constante estímulo para la terminación de esta obra. A Ignacio Alvarez, veterinario del mismo servicio, por sus sabias recomendaciones en el manejo de las ratas. Y, en general, a todo el personal del servicio de cirugía experimental, por su constante apoyo. En particular a Mª Dolores y a Ernesto, que tantas tardes pasaron conmigo y mis ratas. A Dª Mª Teresa Carrascal, D. Mariano Rodríguez-Avial y Mariano Molero, de la Universidad Nacional de educación a distancia (UNED), sin cuya colaboración y decidido apoyo hubiera sido imposible la realización de la prueba mecánica. Al Dr. Manuel Díaz-Curiel y a Jesús Calero, de la Fundación Jiménez-Díaz, por su colaboración imprescindible para la ejecución de las densitometrías, así como por sus recomendaciones sobre el manuscrito final. Al Dr. Fernando López-Barea, del servicio de anatomía patológica del hospital "la Paz", por su colaboración en la realización y diseño de las pruebas histológicas, así como al Dr. Santamaría, del departamento de morfología de la UAM, por su colaboración en la realización de la planimetría. A Antonio García, por su inestimable ayuda en los momentos iniciales de este trabajo, así como en el soporte informático para la escritura de esta obra. A Paloma Bustos y María Eros, técnicos del servicio de bioquímica clínica, por su

11 colaboración en el análisis de las muestras de sangre. A mi mujer, Mª Dolores, por su infinita comprensión cuidando por mí a nuestra hija, Cristina (algo bastante agotador, por cierto), durante las largas horas que pasé trabajando en esta tesis.

12 A mi familia Mis padres y hermano, Mi mujer y mi hija

13 INDICE

14 Indice 1 Página INTRODUCCION...4 A) Aspectos Básicos 1.- Metabolismo del Calcio La vitamina D Otras hormonas: PTH, Calcitonina Biología celular del hueso Estructura y composición Remodelamiento óseo Aspectos biomecánicos básicos del hueso...13 B) Osteoporosis 1.- Concepto. Importancia. Tipos Histopatología de la osteoporosis involutiva Densitometría Fracturas osteoporóticas y características de las caídas Osteoporosis y osteomalacia Osteoporosis senil y vitamina D Tratamiento y prevención La rata como modelo para el estudio de la osteoporosis...29 C) Fracturas 1.- Consolidación de las fracturas Fenómenos que modifican la consolidación Métodos de valoración del callo: Biomecánicos Histológicos Densitométricos Otros Vitamina D y consolidación de fracturas...45 HIPOTESIS Y OBJETIVOS...47

15 Indice 2 Página MATERIAL Y METODOS º.- Animales de experimentación y grupos º.- Fractura experimental º.- Sacrificio y conservación º.- Análisis bioquímico º.- Histología º.- Densitometría º.- Prueba mecánica º.- Métodos de análisis estadístico º.- Fotos...63 RESULTADOS º.- En relación con la puesta a punto del modelo experimental...70 a) pauta de suplementación de calcidiol b) reproducibilidad del método de torsión 2º.- Trazo de fractura obtenido º.- Análisis bioquímico º.- Histología º.- Densitometría º.- Prueba mecánica...93 DISCUSION º.- Sobre la técnica experimental: Animales de experimentación y grupos Fractura experimental Conservación de los huesos...106

16 Indice 3 Página 2º.- Bioquímica: Comparaciones por grupos: 25-OH-D; 1,25 (OH)2-D; PTH Correlaciones entre las 3 medidas º.- Histología: Método histomorfométrico y planimétrico Resultados de la medición del osteoide Resultados planimetría º.- Densitometría: Método densitométrico Fémures: comparaciones por grupos Tibias: comparaciones por grupos Correlación en la densitometría fémures-tibias y por zonas Correlación de tibias y fémures con los resultados bioquímicos º.- Prueba mecánica: Método de torsión Fémures: comparaciones por grupos Tibias: comparaciones por grupos Correlación fémures-tibias (par) Correlación de la resistencia de las tibias con la bioquímica Correlación de la resistencia de los fémures con la bioquímica Correlación resistencia mecánica-densitometría en fémures y tibias CONCLUSIONES RESUMEN BIBLIOGRAFIA...138

17 INTRODUCCION

18 Introducción 5 A) ASPECTOS BASICOS A.1) Metabolismo del calcio El calcio es el catión divalente más abundante en el organismo, representando un 2% del peso corporal, aproximadamente unos 1000 gramos 128. Se distribuye en varios compartimentos. En el compartimento óseo se encuentra el 99% del calcio del organismo, en forma de hidroxiapatita 125. La importancia biológica del calcio deriva de que las sales cálcicas proporcionan la integridad estructural del esqueleto, al ser el principal componente mineral del hueso. Sin embargo, también juega un papel crítico en otros procesos bioquímicos, tales como la excitabilidad neuromuscular, la coagulación sanguínea, la permeabilidad de la membrana celular o el desencadenamiento de reacciones enzimáticas 125. La relevancia de todos estas funciones requiere que las concentraciones intra y extracelulares se mantengan dentro de unos márgenes muy estrictos, lo que se consigue mediante un control intracelular 93 y hormonal 125. El calcio sérico se encuentra de 3 formas diferentes: iónica o libre (50%), unido a proteínas, sobre todo albúmina (40%), o unida a aniones (10%) 128. La fracción iónica es la única con acción biológica. En el intestino, el calcio se absorbe por dos mecanismos: a) un transporte activo saturable dependiente de la vitamina D, localizado fundamentalmente en duodeno y yeyuno, que predomina cuando la ingesta cálcica es baja; b) transporte difusible no saturable, sobre todo en íleon, que predomina cuando la ingesta es elevada 125. El principal regulador de la absorción intestinal de calcio es el calcitriol (1,25 (OH)2 vitamina D). 125 En el hueso se encuentra la reserva de calcio del organismo. Los procesos de resorción y neoformación ósea implican un intercambio contínuo de calcio, cifrados en mg/día 125. La acción de las hormonas calciotrópicas a nivel óseo es compleja y no se ha dilucidado por completo la secuencia de estas acciones. Así, la PTH produce aumento de la

19 Introducción 6 resorción ósea, pero sólo tiene receptores a nivel de los osteoblastos 210. La calcitonina tiene acción inhibitoria sobre los osteoclastos 39, y el calcitriol presenta receptores en los osteoblastos, aumentando su actividad, pero también estimula la diferenciación de los osteoclastos 163. El riñón es la vía principal de eliminación del calcio 125. Esta se regula por tres mecanismos 211 : filtración glomerular, reabsorción en el túbulo proximal y reabsorción en el túbulo distal. La reabsorción en zonas proximales de la nefrona no están bajo control hormonal, pero sí las distales 140. A este nivel, la PTH aumenta la reabsorción tubular de calcio 3. A.1.1) La vitamina D La forma fisiológica activa de la vitamina D es la 1,25 (OH)2 D3 26. En el hombre, la vitamina D proviene de dos fuentes: la alimentaria (vitaminas D2 y D3) y la cutánea (vitamina D3) 125, donde se sintetiza a partir de precursores (dehidrocolesterol 93 ) como respuesta a la exposición a la luz ultravioleta 84,87. Cuando la exposición solar es baja, especialmente en zonas urbanas, las necesidades de vitamina D del organismo dependen de la absorción intestinal de vitamina D contenida en los alimentos 125. Una vez sintetizada o absorbida, la vitamina D es ligada a una proteína de alta afinidad y transportada hasta el hígado, donde es hidroxilada en el carbono La 25 (OH) vitamina D o calcidiol es el metabolito de la vitamina D más abundante en sangre, siendo su vida media de aproximadamente 15 dias 18,125. Su síntesis hepática depende fundamentalmente de la disponibilidad de vitamina D, y así la administración de grandes dosis de vitamina D da lugar a una elevación progresiva de los niveles circulantes de 25 (OH) vitamina D 18. Por lo tanto, los niveles plasmáticos de 25 (OH) vitamina D son el mejor reflejo de las reservas de vitamina D del organismo 18,125. Posteriormente, la 25 (OH) vitamina D es transportada al riñón, donde se hidroxilará de nuevo, bién en el carbono 1, dando lugar a la 1,25 (OH)2 D o calcitriol (verdadera hormona), o en el carbono 24, dando lugar a la 24,25 (OH)2 vitamina D, compuesto de significado biológico incierto 45,125. El calcitriol inhibe la actividad de la 25 hidroxilasa hepática, por lo que la

20 Introducción 7 administración de éste desciende los niveles de calcidiol 84,125. La síntesis de calcitriol (1-alfa hidroxilasa renal) está estimulada por varios factores 45,84, siendo los principales la PTH, la hipofosforemia, la ingesta baja de calcio y fósforo, y, por último, los propios niveles séricos de calcidiol (a más sustrato, más síntesis) y de calcitriol (cuanto más bajos, más síntesis) 83,84,125. En adultos, la actividad de la 1-alfa hidroxilasa renal y la síntesis de calcitriol está fuertemente regulada por el producto final de la reacción, el calcitriol 78. Así, la administración de vitamina D o de calcidiol prácticamente no modifica los niveles séricos de calcitriol. El calcitriol, por otro lado, no sólo inhibe la actividad 1-alfa hidroxilasa renal, sino que también estimula a la 24 hidroxilasa renal 78,125. La acción fundamental de la vitamina D, tanto en el hombre como en la rata 84, consiste en la homeostasis del calcio 125, aunque también se le ha implicado en otras acciones biológicas todavía mal definidas, como las de factor de diferenciación celular 1 e inmunorregulador 204. En el intestino es donde el calcitriol efectúa su acción más importante: estimula la absorción activa de calcio 129 por parte de las células epiteliales, aumentando la absorción en los segmentos proximales del intestino, y reclutando además para dicha función a segmentos intestinales distales. Además, el calcitriol es el mediador de la absorción intestinal de calcio inducida por la PTH 125. En el riñón, la vitamina D favorece indirectamente la excreción urinaria de calcio al aumentar la carga filtrada de calcio 125. En el hueso, el calcitriol contribuye a su crecimiento y mineralización 119, al favorecer la absorción intestinal de calcio y fósforo e inhibir la síntesis de PTH. Los osteoblastos poseen receptores para el calcitriol, aumentando éste la actividad osteoblástica y la síntesis de proteinas de estas células 125. El calcitriol posee también actividad resortiva ósea 117, pero no por estimulación directa de los osteoclastos (ya que éstos no tienen receptores) sino porque inducen la diferenciación y proliferación de los precursores de los osteoclastos 176.

21 Introducción 8 A.1.2) Otras hormonas: PTH, Calcitonina Aunque muchas hormonas aparte de la vitamina D pueden estar implicadas en el metabolismo fosfocálcico, para la PTH y la calcitonina, ésta constituye su principal función, por lo que se las denomina, junto con la vitamina D, hormonas calciotropas 125. PTH La paratohormona (PTH) es una hormona peptídica de 84 aminoácidos, segregada por las glándulas paratiroides 182. El principal regulador de la síntesis y secreción de PTH es la concentración plasmática de calcio 10,190. La hipocalcemia estimula la secreción de PTH, mientras que la hipercalcemia la inhibe. La relación entre las concentraciones plasmáticas de PTH y calcio es de tipo sigmoideo, de forma que dentro de unos límites muy estrechos de de concentración de calcio (9-10 mg/dl) es donde se produce la mayor variación en los niveles de PTH 27. Una vez secretado 190, el péptido es escindido periféricamente, en el hígado, en 2 fragmentos. El fragmento N-terminal (34 aminoácidos) es el que posee actividad biológica, y, además, es el que tiene vida media más corta, por lo que sus niveles séricos son inferiores. Las acciones de la PTH son: en el riñón, aumenta la excreción de fósforo, sodio, bicarbonato y aminoácidos, disminuyendo la eliminación de calcio y magnesio 62. Asimismo, estimula la síntesis de calcitriol a partir de su precursor, el calcidiol 195 (1-alfa hidroxilasa). También produce un aumento en la reabsorción tubular de calcio, pero esto está contrarrestado por el incremento en la carga filtrada de calcio que se produce al aumentar la calcemia 125. A nivel óseo 62, se ha comprobado que tras la administración de PTH se produce una movilización del calcio óseo. Esta respuesta rápida no se acompaña de liberación de hidroxiprolina ósea, indicando que hay una liberación del contenido mineral del hueso pero sin destrucción de la matriz 125. Sin embargo, tras la administración prolongada (superior a 12 horas) sí se produce la disolución de la matriz ósea (aumenta la liberación de hidroxiprolina). Las bases

22 Introducción 9 celulares de este proceso más lento parecen estar en la formación de nuevos osteoclastos 125. Por otro lado, y debido al acoplamiento existente en el proceso de remodelación ósea entre los procesos formadores y destructores de hueso, esta inducción en la formación de nuevos osteoclastos producirá, a largo plazo, un incremento en la función osteoblástica 197. La PTH, pues, tiene un efecto doble a nivel óseo según las dosis y duración de su administración 62. Dosis elevadas estimulan la resorción ósea y la liberación de calcio, inhibiendo la formación de la matriz ósea y la mineralización del hueso. En contraste, el tratamiento crónico con dosis bajas favorece la formación de hueso 125. La importancia fisiológica del efecto anabólico de la PTH se encuentra en investigación. Estudios sobre receptores específicos de PTH en células óseas han permitido establecer que el osteoblasto es la principal célula diana de la PTH 62, y que algún producto resultante de esta acción hormonal sobre los osteoblastos podría funcionar como mensajero local que modificaría la actividad osteoclástica 62,125,174. El resultado de estos eventos es la elevación de la actividad osteoclástica. Calcitonina Es un polipéptido de 32 aminoácidos sintetizado en las células parafoliculares del tiroides 49. El estímulo primario de la síntesis y secreción es el aumento de calcio iónico, siendo la tasa de secreción de calcitonina una función directa de la concentración de calcio cuando éste supera los 9 mg/dl 125. La vida media de la calcitonina humana es de 10 minutos. El principal lugar de aclaramiento y metabolismo es el riñón 125. A nivel óseo, inhibe la resorción osteoclástica 46, tanto de la matriz ósea como de la fase mineral del hueso, demostrado por una disminución de los niveles séricos de calcio y la excreción de hidroxiprolina. La disminución del calcio sérico por efecto de la calcitonina depende principalmente de la tasa de resorción ósea preexistente 125, a mayor resorción, mayor efecto (pacientes jóvenes, Paget, hiperparatiroidismo primario, etc.). Sin embargo, la exposición crónica a la calcitonina produce un descenso de la actividad

23 Introducción 10 osteoblástica, debido al acoplamiento del remodelamiento óseo 125. También se produce a la larga una autorregulación de los receptores de calcitonina, perdiéndose su efecto hipocalcemiante. A nivel renal, produce un aumento transitorio de la excreción de calcio, que posteriormente se normaliza por el descenso de la calcemia. A.2) Biología celular del hueso A.2.1) Estructura y composición El hueso, como los otros tejidos musculoesqueléticos, consta de células de origen mesenquimal dentro de una abundante matriz extracelular 29. Las células óseas (osteoblasto, osteocito) proceden de células mesenquimales indiferenciadas, que son capaces, bajo estímulos adecuados, de diferenciarse a osteoblastos, condroblastos o fibroblastos 124. Estas células indiferenciadas se localizan fundamentalmente en el tejido conectivo perivascular, la capa interna del periostio y la médula ósea, aunque también pueden hallarse en otras zonas 75. Las células que hallamos en el hueso son 75 : a) Osteoblastos: son capaces de producir el colágeno que forma la matriz desmineralizada del hueso (osteoide), así como promover su mineralización; b) Osteocitos: cuando el osteoblasto se rodea totalmente de osteoide, se convierte en el osteocito, responsable del mantenimiento del hueso a través del intercambio de iones entre la matriz ósea y el espacio extracelular; c) Ostoclastos: son células derivadas del sistema mononuclear fagocítico, y principales responsables de la resorción de hueso. La matriz extracelular está compuesta (entre otros) por dos elementos muy importantes: uno es fibroso, el colágeno. Es del tipo I sobre todo 75, y es el que proporciona al hueso su resistencia a la tracción 28. El otro es el componente mineral, formado por hidroxiapatita 75, y proporciona la resistencia a la compresión 28. El tejido óseo se clasifica, según la organización de sus fibras de colágeno, en maduro (o laminillar) e inmaduro 75. En el tejido inmaduro, las fibras de colágeno se disponen de forma

24 Introducción 11 irregular, mientras que en el maduro lo hacen en forma de hojas ordenadas. Debido a esta desorientación de las fibras en el tejido inmaduro, éste es menos rígido y más deformable que el maduro 28. El tejido inmaduro aparece en zonas de crecimiento óseo rápido, como el hueso primitivo del embrión, el callo de fractura, el triángulo de Codman y el hueso tumoral 75. El tejido maduro se forma en zonas de crecimiento más lento, como en el remodelamiento óseo adulto 28. Según la organización microscópica y macroscópica, el tejido óseo se divide en compacto (o cortical) y esponjoso. El primero es un hueso denso con una mínima cantidad de tejido blando interpuesto. El esponjoso está compuesto de láminas y espículas de hueso con gran cantidad de partes blandas (médula ósea) en los espacios entre ellas 75. A.2.2) El remodelamiento óseo. El tejido óseo es uno de los más dinámicos del organismo, estando sometido a contínua regeneración 183. Este proceso se conoce como remodelamiento 75,93,154. Al volumen de hueso preexistente que es cambiado por hueso nuevo por unidad de tiempo se denomina recambio óseo o turnover 183. El remodelamiento óseo incluye una serie de fases consecutivas: 1) Iniciación. Consiste en la generación de un impulso que altera el estado de una superficie ósea, reduciendo su umbral para la activación ) Activación. Implica la provocación de las respuestas celulares más precoces al estímulo desencadenante 154. En general, se desconoce por qué la activación tiene lugar en una localización especial y en un momento determinado ) Resorción. En esta fase se produce la eliminación de la matriz mineral y orgánica, mediada por osteoclastos 154,183. Se forman unas cavidades, llamadas lagunas de Howship en el hueso trabecular y cono penetrante en el hueso cortical 75,152. 4) Inversión. Implica la finalización de los procesos resortivos y preparación del sistema osteoblástico 154. Este acoplamiento entre la resorciónformación parece ser intrínseco al hueso, sometido a regulación local y automático, de forma que una vez iniciada la activación, el proceso se completa totalmente ) Formación. Se produce la reparación osteoblástica de la cavidad de resorción 154. Los osteoblastos presentan, en

25 Introducción 12 general, una morfología más gruesa, debido a un mayor grado de actividad en esta fase 183. Primero se realiza la síntesis de la matriz ósea no mineralizada u osteoide 183, y posteriormente se lleva a cabo la mineralización de esta matriz 152. Los elementos operativos de este sistema son fundamentalmente las células óseas (osteoblastos y osteoclastos), pero también participan las células del compartimento medular óseo y sistema regulador inmune, que actúan no sólo como progenitores de la célula ósea, sino también como reguladores del proceso de remodelación 154. Al conjunto de células que actúan en coordinación para completar un ciclo de remodelación se le da el nombre de unidad de remodelado óseo 93,152,183. La duración media de un ciclo de remodelación constituye una unidad de tiempo natural del esqueleto, ya que expresa el tiempo mínimo necesario para establecer una respuesta evidente a cualquier cambio en el índice de activación o en la función de la célula diferenciada 152. La duración media en el hombre de este ciclo es de 4 meses 183, mientras que en la rata es de 24 días 108. El acoplamiento entre la resorción y formación es el que mantiene la masa ósea constante 154. La reducción gradual, progresiva de masa ósea en la vejez, es la suma de ligeras pérdidas a corto plazo en numerosos puntos de remodelación 152. Esta pérdida progresiva es un fenómeno universal de la biología humana, produciéndose independientemente del sexo, raza, ocupación, actividad física, hábitos dietéticos, desarrollo económico, localización geográfica o época histórica. Se pierde hueso a partir de las superficies endósticas en contacto con la médula ósea, ya que la superficie perióstica sigue ganando hueso lentamente, a lo largo de toda la vida 152. El resultado global de ambos procesos es un aumento del diámetro óseo en la vejez 132. Este fenómeno también se ha comprobado en ratas 108. El máximo de masa ósea adulta se alcanza a la edad de años para el hueso cortical, y probablemente antes para el hueso trabecular 132. Además, este máximo de masa ósea es alrededor de un 25-30% superior en hombres respecto a las mujeres 152. Después de terminar el crecimiento, no existe ningún mecanismo para la estimulación "de novo" de la formación de

26 Introducción 13 hueso laminillar sin un episodio precedente de resorción ósea 152. En la rata, el pico máximo se alcanza a los 12 meses 108,181. A.3) Aspectos biomecánicos básicos del hueso Cuando se aplica una carga a un objeto de geometría uniforme, se desarrollan una serie de tensiones en el interior del material. La tensión (Stress) se suele expresar como fuerza (F) por unidad de superficie (A)(F/A), para evitar la variación de este parámetro en función del tamaño de la muestra. La tensión puede ser perpendicular a la sección de la muestra, definiéndose entonces como tensión normal 132. La tensión normal puede producirse a tracción o compresión. Cuando esta tensión no es perpendicular sino paralela a la sección de la muestra, se denomina tensión cizallante o cortante 205, y se produce cuando una parte de la muestra tiende a deslizarse sobre la otra. La tensión se expresa, en el sistema internacional de medidas, en Pascales (N/m 2 ) 205. Como consecuencia de la fuerza que se aplica a la muestra, ésta se deforma. La deformación (Strain) se expresa como el porcentaje de cambio de longitud de la muestra tras someterla a una tensión dada. Las unidades que emplea son el % o el tanto por uno. Cuando un material se deforma en longitud, también cambia su anchura. La relación entre la deformidad en longitud respecto a la deformidad en anchura se denomina módulo de Poisson 205. Un módulo de Poisson de 0.45 significa que una deformación de un 1% en longitud, producirá una deformación de un 0.45% en anchura. La relación entre la tensión aplicada a una muestra y la deformación resultante, produce la llamada curva tensión-deformación (Figura 1).

27 Introducción 14 La curva se puede dividir en dos regiones: la primera, de deformación elástica, y la segunda, de deformación plástica, separadas por el llamado punto de transición (yield point). En la zona elástica, el hueso se comporta como un muelle: la deformación se incrementa de forma lineal al aumentar la Figura 1 fuerza, y, al cesar ésta, el hueso recupera su forma original. De todas formas, este es el comportamiento ideal del hueso, pero en realidad, éste nunca se comporta como un muelle perfecto. Hay efectos viscosos durante la deformación, por la existencia de fluidos en la matriz ósea, que hacen que cierta energía se pierda, con lo que la pieza no vuelve totalmente a su forma original. De todas formas, es una aproximación válida 205. La pendiente (tangente del ángulo) de la curva en esta zona elástica representa la rigidez de la estructura, y se denomina módulo elástico o de Young. Tras esta zona elástica se produce la transición en un punto donde se empieza a producir un daño estructural permanente al hueso 93, comenzando en este momento la zona plástica. Cuando se experimenta con hueso, este punto de transición pocas veces está claramente definido 205. En esta zona plástica, la deformación producida en el hueso ya no se recupera tras cesar la fuerza. La deformación producida en esta zona es una medida de la ductilidad del material (cuanto menos dúctil, más quebradizo) 205. Al final de la zona plástica se llega a la tensión de rotura, donde el hueso se fractura 205. La tensión máxima soportada coincide con la tensión de rotura cuando se experimenta con hueso 205. El área debajo de la curva es una medida de la cantidad de energía necesaria para producir la fractura. Se denomina energía absorbida, y a mayor valor, más resistencia presenta el hueso a fracturarse. Se sabe que a medida que aumenta la edad, disminuye la energía necesaria para fracturar al hueso 33. Es importante destacar la diferencia entre la resistencia del tejido óseo, que es

28 Introducción 15 independiente del tamaño de la muestra, y de la fuerza requerida para romper un hueso determinado, que depende no sólo de la resistencia del tejido óseo, sino también de su forma y tamaño 205. Se ha demostrado que la tensión de rotura de un hueso depende fundamentalmente del contenido mineral de éste, mientras que la rigidez (pendiente de la zona elástica de la curva) depende fundamentalmente del colágeno del hueso 31. Cuando el hueso es cargado repetidamente en la zona elástica de la curva, sus características mecánicas se deterioran con el tiempo. Este fenómeno se denomina fatiga, y se atribuye a la presencia de microfracturas que se van acumulando. Sin embargo, el hueso es una estructura viva, que puede ir reparando estas microfracturas, si se le proporciona el tiempo necesario 205. El hueso presenta mayor resistencia a la fuerza aplicada en determinadas direcciones respecto a otras, por lo que se dice que el hueso es un material anisótropo 132,205. Por eso siempre se debe especificar la dirección en que se aplicó la carga, así como el tipo de carga (compresión, tracción o cizalla). Así, para una carga longitudinal, el hueso cortical es más duro (absorbe más energía antes de romperse) bajo fuerzas de tracción que de compresión. Se dice que el hueso presenta un comportamiento viscoelástico porque sus propiedades mecánicas dependen de la velocidad de la deformación, así como de la duración de las cargas aplicadas 93. Se ha indicado que el agua del hueso fluye a través de la estructura cuando el hueso es sometido a cargas. Este flujo es viscoso, con lo que se disipa una pequeña cantidad de energía 104. Cuando el hueso se seca, el componente viscoso desaparece, y se comporta de forma perfectamente elástica 153. Esta pequeña cantidad de energía absorbida (componente viscoso) varía proporcionalmente según la velocidad a la que es aplicada la carga, de forma que las propiedades mecánicas varían según las velocidades a las que se desarrolle el ensayo. Si la velocidad del ensayo se incrementa en una magnitud dada, la resistencia del hueso se incrementará proporcionalmente 34. Por esta razón, la velocidad del ensayo debe ser muy controlada.

29 Introducción 16 Se han investigado muchos parámetros del hueso (densidad ósea aparente, peso de las cenizas, histología, colágeno, etc.) para saber si a partir de ellos se podrían deducir sus características mecánicas. Esto ha resultado difícil de demostrar, ya que los rangos de fuerza aplicados al hueso son muy pequeños 93. Sí se ha demostrado que la densidad ósea aparente y la arquitectura del hueso son los factores que mejor correlacionan con las propiedades mecánicas del mismo (módulo de elasticidad y tensión de rotura) 93. Con la edad se van deteriorando las características mecánicas del hueso. Se ha indicado una disminución del 7% en la energía necesaria para la fractura por década de envejecimiento 93. Esto se atribuye a la disminución de la densidad ósea aparente, así como al deterioro de la microarquitectura ósea 93.

30 Introducción 17 B) OSTEOPOROSIS B.1.1) Concepto La osteoporosis puede ser definida de formas diferentes según la aproximación que se haga al problema. Desde un punto de vista genérico, se trata de la disminución de la masa ósea de un individuo por debajo de la que correspondería a la de individuos de igual sexo y edad 47, lo que nos permite distinguir lo que es la patología de la pérdida "fisiológica" de hueso con la edad. Si aceptamos un enfoque más clínico, podemos definirla como una pérdida generalizada de masa ósea que produce una fragilidad de los huesos del esqueleto, que se fracturan ante traumatismos banales 46. Desde una visión fisiopatológica entendemos la osteoporosis como una pérdida cuantitativa de hueso, sin alteración en su composición. Esta definición nos permite distinguirla de la osteomalacia 46,47. Una definición más pragmática es aquella que la entiende como el nivel de masa ósea en el cual el tratamiento produce más beneficio que el no tratamiento 186. Todas estas dificultades definitorias se ponen de manifiesto a la hora de emitir el diagnóstico de osteoporosis ante un paciente concreto. La clínica suele ser inespecífica, y los métodos de radiología simple son muy poco sensibles. El laboratorio sólo sirve para excluir enfermedades que pueden manifestarse con osteoporosis, tales como el mieloma o el hiperparatiroidismo primario. La biopsia ósea, un método muy útil, es invasivo y no está justificada su aplicación indiscriminada 47. Sin embargo, con el advenimiento de las técnicas densitométricas, podemos medir la cantidad de hueso de una forma sencilla, lo que ha facilitado enormemente el diagnóstico 46,47. Desde el punto de vista poblacional, el diagnóstico es más simple, en tanto que globaliza resultados y no compromete con la toma de decisiones ante un paciente concreto. Así, los estudios densitométricos o de prevalencia e incidencia de fracturas osteoporóticas son métodos válidos para aproximarse a una cuantificación del síndrome respecto a una población 47. En 1993 tuvo lugar una conferencia internacional donde se consensuó una definición

31 Introducción 18 para la osteoporosis: "es una enfermedad sistémica del esqueleto caracterizada por escasa masa ósea y deterioro microarquitectónico del tejido óseo, con el consiguiente aumento de la fragilidad ósea y de su susceptibilidad a la fractura" 155. B.1.2) Importancia La osteoporosis es uno de los principales factores de riesgo en la génesis de fracturas, provocando una importante morbilidad y mortalidad, con un gran impacto sociosanitario. Como datos generales, se estima que el 70% de todas las fracturas por encima de los 45 años se asocian a osteoporosis, aunque no sea ésta la única circunstancia implicada 46. En los Estados Unidos, se calcula que predispone a la producción de unas fracturas de columna, de cadera y de muñeca anuales 155, costando a la nación más de 10 millones de dólares anuales. La fractura de cadera es la más devastadora manifestación de la osteoporosis. Entre un 5 y un 20% de las personas que la padecen fallecen al cabo de un año, y más de un 50% de las que sobreviven quedarán incapacitadas, muchas de ellas permanentemente 107,155. Además, recientemente se ha indicado 16 que la existencia de osteoporosis implica un peor pronóstico en cuanto al tratamiento de la fractura de cadera, con un mayor índice de fallo del implante en fracturas inestables de cadera. Puesto que las personas de edad avanzada son las que padecen mayor riesgo de fracturas osteoporóticas, el envejecimiento progresivo de la población mundial predice un aumento importante del peso global de la osteoporosis. Sólamente la mayor esperanza de vida podría aumentar tres veces más la incidencia mundial de fracturas en los próximos 60 años 155. B.1.3) Tipos La osteoporosis se cataloga como primaria o secundaria, según la presencia o no de enfermedades con relación conocida con la osteoporosis. Aunque esta primera aproximación es

32 Introducción 19 útil, puede resultar engañosa, ya que sugiere la existencia de dos tipos de osteoporosis excluyentes entre sí, y esto no es cierto 131. La osteoporosis secundaria puede estar relacionada con una larga lista de enfermedades, tales como el hipercortisonismo, hipogonadismo, hipertiroidismo, diabetes mellitus, hiperparatiroidismo, fármacos anticonvulsivantes, gastrectomía, síndromes de malabsorción, artritis reumatoide, enfermedades del tejido conjuntivo, enfermedades neurológicas crónicas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica o procesos malignos 46,131. La osteoporosis primaria se suele dividir en dos grupos: idiopática e involutiva. La idiopática incluye formas poco frecuentes de osteoporosis primaria encontradas en niños y adultos jóvenes. La involutiva es la forma más habitual, iniciándose en la edad media de la vida y haciéndose más frecuente a mayor edad. Riggs y Melton 170 caracterizaron dos tipos fundamentales de osteoporosis involutiva: a) Tipo I, o postmenopaúsica: afecta a mujeres, entre los años tras la menopausia. La fractura vertebral es la principal manifestación clínica, pero también son frecuentes las fracturas de Colles en la muñeca, así como la pérdida de piezas dentarias por pérdida de hueso alveolar en la mandíbula. Estos tres huesos contienen una gran cantidad de hueso trabecular, y en estos pacientes, la pérdida de hueso trabecular es tres veces mayor que en personas normales 178. Se ha propuesto que esta pérdida ósea debido al déficit estrogénico provocaría una disminución de la secreción de PTH, lo que conduce a una disminución de la producción de calcitriol 68. Esto hace disminuir la absorción de calcio y se potencia la pérdida ósea. En este tipo de osteoporosis hay un aumento de la actividad ósea (osteoporosis acelerada o de alto remodelado) 46. La predilección por el sexo femenino y la proximidad a la menopausia sugieren que el déficit estrogénico es el agente etiológico fundamental. De todas formas, sólo un subgrupo relativamente pequeño de mujeres postmenopaúsicas presentan esta forma de osteoporosis 170. b) Tipo II, o senil: se refiere a la osteoporosis que aparece en varones y mujeres de 75 o

33 Introducción 20 más años de edad. Se manifiesta fundamentalmente por fracturas de cadera y fracturas vertebrales en cuña (compresión anterior), si bien pueden producirse también fracturas en el húmero proximal, tibia proximal y pelvis 131. Este tipo de osteoporosis se caracteriza por la existencia de pérdidas proporcionales, tanto de hueso trabecular como cortical. En su fisiopatología parecen implicados un descenso de la formación de hueso por envejecimiento celular, así como una alteración del metabolismo de la vitamina D que implica una disminución de la absorción de calcio, con hiperparatiroidismo secundario, que potencia la pérdida ósea 131,186. Es un tipo de osteoporosis de bajo remodelado 46. La masa ósea en estos pacientes ancianos es inferior a la esperada por tres factores: a) la masa ósea alcanzada durante el crecimiento y el desarrollo es inferior a la normal 46,47 ; b) pérdida acelerada de masa ósea 131 ; c) factores adicionales de tipo médico, iatrogénico o ambiental que aceleran la pérdida de masa ósea 47,93. Los dos tipos de osteoporosis están, pues, asociados a una baja absorción de calcio. Sin embargo, los mecanismos que lo producen son distintos. En el tipo I, los mecanismos que producen la pérdida de hueso conducen indirectamente a una disminución de la absorción de calcio. En estos pacientes, la administración de calcio tendría poco efecto beneficioso directo. En el tipo II, sin embargo, la disminución de masa ósea es el resultado directo de la disminución en la absorción de calcio. En este caso, se puede esperar que aumentando la absorción de calcio se revierta el problema 186. B.2) Histopatología de la osteoporosis involutiva La histología de la osteoporosis se basa en la cuantificación de la masa ósea. Se considera patológico cuando el volumen trabecular es inferior en dos desviaciones estándar o más a la media de individuos sanos de la misma edad y sexo 47. Sin embargo, esta definición no contempla las alteraciones en la arquitectura y recambio óseos, que también contribuyen, desde un punto de vista histológico, a la aparición de fracturas 47. a) Arquitectura: En la osteoporosis, en cada ciclo de remodelado el volumen de hueso reabsorbido supera al de hueso formado 47,152.

34 Introducción 21 A nivel trabecular, este balance óseo negativo es consecuencia de que: a) aumenta el volumen de hueso reabsorbido, con lo que las trabéculas se perforan y disminuyen en número, alterando la resistencia mecánica del hueso; b) disminuye el volumen de hueso formado. La disminución del volumen trabecular se correlaciona con la aparición de fracturas vertebrales. El número de trabéculas disminuye 152. Las que quedan pueden ser de mayor grosor, bien porque son menos susceptibles a la destrucción, o bien porque aumentan las solicitaciones mecánicas sobre las mismas y aumentan de grosor 47. A nivel cortical, los osteoclastos excavan la vertiente interna, que no puede ser rellenada por hueso, con lo que esta zona va adquiriendo características de hueso trabecular (trabeculación de la cortical) 152. A su vez, aumenta la porosidad general de la cortical. Este aumento de porosidad, junto con la disminución del tejido óseo cortical se correlacionan con la aparición de fracturas de cuello femoral 47. b) Recambio: En la mujer, durante la menopausia, el recambio óseo está aumentado, y luego, con la edad, disminuye progresivamente (osteoporosis menopaúsica y senil). Al disminuir el recambio, el tejido óseo, al no renovarse, acumula fatiga mecánica y, por consiguiente, es más frágil 47. B.3) Densitometría Uno de los avances más decisivos en los últimos años en el campo de la osteoporosis ha sido la introducción de la técnica de densitometría para la cuantificación del contenido mineral óseo 46. La radiología simple es útil en la evaluación de la osteopenia, pero es muy poco preciso, ya que se necesita un descenso del 30% de la masa ósea para ser detectada 46,93. Se han usado varios tipos de técnicas: a) densitometría fotónica simple, basada en la absorción de un haz fotónico; b) densitometría dual fotónica, basada en la absorción diferencial

35 Introducción 22 de dos haces fotónicos de distinta energía; c) densitometría con rayos X de doble energía, similar a la anterior, pero con rayos X; d) tomografía axial computerizada cuantitativa. Actualmente, el método más usado es la densitometría con rayos X de doble energía, por su sencillez, fiabilidad y baja radiación para el paciente 46,48,93,155. El valor predictivo del riesgo de fractura es el aspecto más conflictivo de estas técnicas, ya que hay una importante superposición entre las poblaciones con riesgo de fractura y los controles sanos en sus niveles de densidad mineral ósea 48. Aunque se considere que hay una importante relación entre la densidad mineral ósea y el riesgo de fractura, no es el único factor implicado 48,186. B.4) Fracturas osteoporóticas y características de las caídas Un factor muy importante, y que a menudo se olvida en la prevención de las fracturas osteoporóticas, es el hecho de la caída que produce la fractura. Se ha demostrado 157 que una modificación de 30 en la dirección de la energía aplicada a la cabeza del fémur hace que la carga máxima que éste es capaz de soportar varíe hasta en un 24%. Esta variación en la carga que es capaz de resistir la cabeza del fémur es similar a la que se produce, a un ángulo de carga dado, tras una disminución de un 16% de la densidad mineral ósea, equivalente a 23 años de pérdida de masa ósea. Además, también se ha indicado que el traumatismo directo (caída estando de pie) sobre la cadera aumenta el riesgo de fractura hasta 20 veces, respecto a caídas en las que el traumatismo no ocurre de forma directa sobre este punto 79. La existencia de un tejido adiposo abundante en la zona de la cadera puede absorber parte de la energía de la caída, aumentando la energía necesaria para fracturar la cadera 79,173. Con todo esto se confirma la gran importancia de las características del traumatismo, y no sólo de la densidad mineral ósea, en la génesis de las fracturas osteoporóticas. B.5) Osteoporosis y osteomalacia

36 Introducción 23 La osteomalacia consiste en una alteración de la mineralización de la matriz ósea (osteoide) 93 en el adulto, independientemente de la causa. Una de ellas es la deficiencia de vitamina D. La diferencia fundamental con la osteoporosis, es que en ésta, no hay alteraciones en la mineralización del hueso. La única forma cierta de diferenciar ambas enfermedades es la biopsia ósea tras el marcaje en dos tiempos con tetraciclinas 93, demostrando un exceso de osteoide no mineralizado, así como una disminución de la velocidad de mineralización 175 en el caso de la osteomalacia. B.6) Osteoporosis senil y vitamina D Está ampliamente demostrado que los niveles de 25-OH-vitamina D disminuyen en más de un 50% con la edad 14,49,68,71,80,88,100,146,148, incluso en países más septentrionales (con mayor irradiación solar), como España 161,162. Esta disminución es más marcada en pacientes crónicos, ingresados en hospitales 71,161. Sin embargo, en algún estudio no se encuentra esta disminución con la edad 189, y esto parece debido a que en este estudio se midieron personas ancianas escrupulosamente sanas. Los mecanismos implicados en la disminución de la vitamina D con la edad podrían ser: a) disminución de la ingesta dietética. Por lo general, las personas de edad no consumen la ración diaria recomendada de vitamina D 49. b) disminución de la absorción de vitamina D. Se ha comprobado, mediante el uso de vitamina D marcada, una mayor absorción de la misma en personas jóvenes 15. c) disminución de la hidroxilación en el carbono 25 hepática. No está claro si efectivamente se produce una disminución de la actividad de la 25 hidroxilasa hepática o si, por el contrario, su actividad se encuentra aumentada debido al déficit relativo de su substrato, la vitamina D, en el anciano 49. d) aumento del aclaramiento metabólico. Pero la vida media de la vitamina D marcada es similar en jóvenes y ancianos 15, por lo que no parece un factor importante. e) menor síntesis de vitamina D epidérmica. La exposición solar es menor en pacientes

37 Introducción 24 ancianos que en jóvenes 142, y aún menor en pacientes ingresados en hospitales 49. Se ha sugerido, también, que la síntesis dérmica está disminuida en la senectud 116. f) disminución de la proteina fijadora de vitamina D. Esta disminución puede ser la causa de modificaciones de los niveles de calcitriol en el embarazo (aumento) o en la cirrosis hepática (disminución). Sin embargo, las concentraciones de proteina fijadora de vitamina D no experimentan variación con la edad, por lo que no parece un factor significativo 65. Se ha demostrado, además, que existe correlación entre los niveles de 25-OH-vitamina D y los valores de masa ósea en ancianos 100,127. Los niveles de calcitriol (1-25-OH2 vit.d) también parecen disminuir con la edad 49,68,203. Esto parece debido a una disminución de la actividad 1-hidroxilasa renal 11,203, disminución que es más marcada en pacientes con osteoporosis 194. Como consecuencia de esta disminución de calcitriol, también disminuye la absorción de calcio con la edad 49. Sin embargo, esta disminución del calcitriol con la edad no ha sido confirmada en todos los estudios 161. También se ha indicado una menor respuesta celular al calcitriol en la osteoporosis 101 (pacientes con fracturas vertebrales), respecto a controles de la misma edad y sexo. Con la edad, aumenta a su vez la PTH 11,58,100,106,115,161 aumento que es mayor a menor nivel de 25-OH-vitamina D 100. Se ha demostrado que los pacientes seniles con fractura de cadera, presentan unos niveles de vitamina D menores que controles sin fractura, de la misma edad y sexo 105,209. En 1993, realizamos en el hospital "La Paz" este estudio 126, encontrando diferencias estadísticamente significativas en los niveles de 25-OH-vitamina D entre pacientes seniles con fractura de cadera y pacientes seniles sin fractura. La PTH se encontró elevada en ambos grupos, sin diferencias valorables. Baker 13, en Inglaterra, encontró resultados similares. Sin embargo, Hordon 88 no encontró disminución en la 25-OH-vitamina D en pacientes con fractura de cadera respecto a controles. Quizá este resultado dependa de que los controles sanos se seleccionaron en el medio hospitalario, donde los niveles de vitamina D son muy bajos.

38 Introducción 25 Sin embargo, no siempre se ha demostrado existencia histológica de osteomalacia. En un total de 57 fracturas de fémur analizadas histológicamente en Barcelona 47, no se encontraron signos de osteomalacia en ningún caso. En Israel, sobre 95 pacientes con fractura de fémur, en ninguno se encontró evidencia histológica de osteomalacia 57. Otros autores la encuentran en un % 90 de pacientes con fractura de cadera. No existe unanimidad en la literatura respecto a la existencia 126 o no 88,115 de una disminución del calcitriol en pacientes con fractura de cadera respecto a controles de la misma edad. La PTH se encuentra elevada en un 51.3% de pacientes con fractura de cadera 36, pero no hay diferencia con pacientes de la misma edad y sexo 58,115,126. Por otro lado, la vitamina D tiene un efecto demostrado sobre el músculo 20, de forma que, cuando hay un déficit, hay debilidad muscular y mayor propensión a las caídas, lo cual puede ser reversible con el tratamiento 134. Esto hace que se produzcan un mayor número de fracturas en pacientes con déficit de vitamina D, independientemente de sus efectos a nivel óseo. B.7) Tratamiento y prevención de la osteoporosis Son numerosas los métodos usados en el tratamiento y prevención de la osteoporosis. Entre ellos, destacamos: a) Calcio: En la fase inicial del tratamiento, los suplementos de calcio inhiben probablemente la resorción del hueso sin afectar a la formación ósea, bien disminuyendo la actividad osteoclástica o bien disminuyendo los niveles de PTH 46,150. Por ello mejoran el balance cálcico, pero esta mejoría persiste solamente durante un periodo de 3-6 meses 70. Posteriormente, se produce un descenso en la formación ósea, que reequilibra la resoción y formación ósea, pero disminuyendo la velocidad de remodelado. Esta disminución del

39 Introducción 26 "turnover" tiende a reducir al mínimo cualquier desequilibrio entre resorción y formación, dando lugar a un balance cálcico cero o ligeramente negativo. Se ha demostrado que un aumento en la ingesta de calcio disminuye el riesgo de fractura de cadera 86,92, aunque en menor proporción que otros medicamentos 92. Se ha sugerido que se requiere una ingesta mínima diaria de 1000 a 1500 mg/día 70,80,150,155. Shapira 188, en un estudio experimental en ratas, indicó que la ingesta de suplementos de calcio durante toda la vida de éstas, aumentaba la masa ósea del esqueleto axial. b) Estrógenos: El tratamiento con estrógenos durante varios meses reduce la resorción de hueso, y tiende a aumentar pasajeramente el balance cálcico, que es compensado más adelante por una disminución de la formación de hueso 70,82. Son los agentes de elección en la prevención de la pérdida ósea postmenopaúsica, puesto que son el único tratamiento que, sin lugar a dudas, reduce la tasa de fracturas 155. Se ha demostrado una menor tasa de fracturas vertebrales usando estrógenos y calcio que sólo calcio 169, así como una disminución en la tasa de fractura de cadera 92. El riesgo de cancer de mama 186 limita su uso, aunque este riesgo no haya sido todavía claramente establecido 30,155,186. También tiene un importante efecto protector frente a enfermedades cardiovasculares 30,155. c) Análogos de la vitamina D: Son agentes capaces de aumentar la absorción de calcio y mejorar el balance cálcico 70. Además, parece ser que estimulan el "turnover" óseo. Orimo 147, en un estudio reciente, randomizado y doble ciego, ha constatado un aumento de la masa ósea y una disminución en la incidencia de fracturas en un año con el uso de 1-alfa hidroxivitamina D y calcio, con tan sólo un 2,5% de hipercalcemias. También se ha corroborado una disminución de la tasa de fracturas con el uso de calcidiol y calcio. Chapuy 40,41, en 1992, comprobó en ancianos que tras 18 meses de

40 Introducción 27 tratamiento, el número de fracturas de cadera era un 43% menor, y el del resto de fracturas no vertebrales un 32% menor que en controles, disminuyendo también la PTH y aumentando la masa ósea un 2,7% (frente a un descenso del 4,6% en controles). En otro estudio 81, se constató una disminución del 22 al 16% en el grupo tratado con una inyección anual de calcidiol ( U.I.), en un periodo de 3,5 años. Estos estudios enfatizan el hecho de que muchos pacientes ancianos tienen un déficit subclínico de vitamina D 150. Sin embargo, dosis mayores de vitamina D pueden ser contraproducentes. Nordin 143 demostró que la dosis de U.I. dos veces por semana durante 2 años producía una mayor incidencia de fracturas, y una disminución de la masa ósea. Actualmente se recomienda la administración de 800 U.I./día de calcidiol a pacientes ancianos que no reciben una adecuada exposición solar 80,186. Estudios usando suplementos de 24,25 (OH)2 vitamina D en pacientes normales 172 u osteoporóticos 164 no han demostrado efecto beneficioso. El uso de calcitriol ha proporcionado resultados muy irregulares en la literatura, con trabajos a favor 69,200 y en contra 44,91 de su beneficio en la disminución de la tasa de fracturas y aumento de la masa ósea. Para explicar estas diferencias entre autores, se han invocado las diferencias en las dosis o la distinta muestra de población 150, por lo que es difícil sacar conclusiones ciertas sobre el efecto del calcitriol en la osteoporosis. Sin embargo, sí se ha demostrado que el calcitriol tiene efectos adversos serios, tales como hipercalcemia o nefrocalcinosis, cuando se administra a una dosis demasiado alta 150. Por ello, la dosis debe ajustarse siempre individualmente, en función de los niveles plasmáticos de calcio 18. En estudios experimentales en ratas 187,188, se ha postulado que la suplementación de vitamina D durante toda la vida de la rata aumenta la masa ósea de la columna vertebral. Además, la suplementación de metabolitos de la vitamina D es capaz de prevenir la pérdida ósea que se produce tras la ovariectomía experimental en ratas 55,59.

41 Introducción 28 d) Calcitonina: Su uso se basa en su capacidad de disminuir la actividad osteoclástica 43. Existen varios tipos de calcitonina de uso clínico: de origen porcino, de salmón, humana o semisintética de anguila, con acción similar, pero con diferencias en cuanto a dosis, efecto analgésico o hipocalcemiante. La acción antirresortiva de la calcitonina se basa en la presencia de receptores específicos en los osteoclastos 46. La efectividad disminuye a lo largo del tiempo, al perderse progresivamente la respuesta de los receptores, y también porque pueden aparecer anticuerpos anticalcitonina. Por eso se recomiendan pautas de tratamiento intermitentes 43,46. La calcitonina contrarresta el efecto de la PTH y del calcitriol, que producen una aceleración de la resorción ósea 46,56. Se ha demostrado que la calcitonina, junto al calcio, disminuyen la tasa de fractura de cadera en ancianos 92. e) Otros: e.1) Difosfonatos: Son análogos del pirofosfato endógeno, poseedores de una elevada afinidad de fijación para los cristales de hidroxiapatita 43. Se han usado fundamentalmente en la enfermedad de Paget, hipercalcemia en procesos malignos y osificación heterotópica. Actúan mediante una inhibición de la remodelación, y, sobre todo, de la resorción ósea 186, bloqueando la producción de cristales de hidroxiapatita, por un mecanismo aún poco claro 46,43. La complicación potencial más preocupante es la producción de un defecto de mineralización determinante de osteomalacia que podría conducir a un mayor riesgo de fractura 43. Todavía está por definir la posología más útil y los beneficios de este medicamento en la osteoporosis. e.2) Esteroides anabolizantes: Son derivados sintéticos de la testosterona, desarrollados en un intento de separar los efectos anabólicos de los virilizantes 43. Se ha demostrado que aumentan la masa ósea y disminuyen la tasa de fracturas 43,46. Su mecanismo de acción derivaría de una estimulación directa de la formación de hueso, así como de una disminución en la excreción de calcio, con el consiguiente aumento de la calcemia, disminución de la PTH y de la resorción ósea 46. Sin embargo, tienen importantes efectos adversos, tales como trastornos

42 Introducción 29 hepáticos, efectos virilizantes o alteración del lipidograma, lo que limita su uso en la clínica 46. e.3) PTH: Se ha demostrado que su administración a dosis bajas, aumenta la formación ósea 43,46,196, así como la síntesis de calcitriol y la absorción intestinal de calcio 46. Los problemas que plantea 43 son la necesidad de inyección parenteral, un aparente efecto negativo sobre la masa ósea cortical 171, y un margen relativamente estrecho en su posología. e.4) Hormona de crecimiento: Recientemente se ha indicado que esta hormona, o su precursor (GHRH) tienen un potente efecto formativo, aumentando la masa ósea en personas mayores de 60 años 46,177. En ratas ancianas, se ha demostrado que estimula la absorción intestinal de calcio 63. Aún está en fase experimental. e.5) Flúor: Estimula la formación ósea, y produce un aumento neto de la masa ósea 46. Sin embargo, el hueso formado está compuesto de cristales de fluorapatita, mecánicamente peor que el normal 46. Aunque se ha postulado que reduce las tasas de fractura vertebral, algunos estudios han detectado un aumento de las tasas de fractura de fémur, lo que limita su uso en clínica 11,46. F) Actividad física: El ejercicio físico moderado reduce la pérdida de masa ósea. Se ha demostrado que las mujeres postmenopaúsicas que caminan más de un milla al día, tienen mayor masa ósea que las que no 102. B.8) La rata como modelo para el estudio de la osteoporosis La Food and Drug Administration (FDA) americana ha establecido algunas recomendaciones sobre el desarrollo de modelos animales para el estudio de la osteoporosis 60. Destaca la recomendación de usar animales que pierden hueso tras la ovariectomía (en el estudio de la osteoporosis postmenopaúsica), así como la medición de la densidad ósea, marcadores bioquímicos óseos y la resistencia ósea mediante estudios biomecánicos. Se pretende usar aquel modelo animal más parecido al hombre 97.

43 Introducción 30 La rata ha sido muy usada para conseguir información sobre el esqueleto humano adulto. Para el estudio de la osteoporosis, son mejores las hembras, ya que se cierran antes los cartílagos de crecimiento (a los 6-9 meses en la hembra, hasta los 30 meses en el macho) 98. El pico máximo de masa ósea, medida por densitometría, ocurre a los meses de edad. Desde este pico, la masa ósea vertebral desciende progresivamente 181. El pico coincide con el nivel máximo de 17-estradiol en las hembras, bajando posteriormente estos niveles 181. La tibia pierde aún más masa ósea con la edad 192. La esperanza de vida de la rata tipo Wistar es de 24 meses 97. Sin embargo, la rata, como todos los demás animales, no presenta fracturas asociadas al desarrollo de osteopenia 97. Esto puede ser estimado de forma indirecta midiendo la resistencia mecánica de los huesos intactos. Por todas estas similitudes al hombre, la rata parece un buen animal para el estudio de la osteoporosis 97,192, mejor que cualquier otro 97. Además, es fácil de manejar y sus determinaciones bioquímicas en sangre están muy bien desarrolladas.

44 Introducción 31 C) FRACTURAS C.1) Consolidación de las fracturas El proceso de reparación de una fractura se puede dividir en cuatro etapas consecutivas 149, que se pueden superponer entre sí en diferentes zonas del callo 64. Son: 1º.- Inflamación: Comienza inmediatamente tras la fractura. Se lesionan vasos, células óseas, matriz ósea y tejidos blandos, produciéndose un hematoma en la zona, así como la necrosis de los extremos fracturarios 28,130,149. Esta necrosis afecta a más cantidad de tejido en el hueso cortical, por la distribución vascular con pocas anastomosis en esta zona 76. Las células muertas, así como plaquetas, liberan mediadores de la inflamación que producen una vasodilatación y exudación del plasma. Aparecen en la zona polimorfonucleares neutrófilos, monocitos y macrófagos 130,149. El hematoma se organiza, produciéndose un coágulo de fibrina que facilita la migración de las células reparadoras de la lesión. Si en este momento se elimina artificialmente el hematoma, se puede dificultar la consolidación, al bloquearse esta migración 73. Se liberan factores de crecimiento (se detallan más adelante) que median la migración y proliferación celular, así como la síntesis de matriz 89,130. En esta fase, el ambiente en la zona de fractura es ácido 28, lo que impide el funcionamiento adecuado de la fosfatasa alcalina y la mineralización precoz. 2º.- Callo blando: Esta fase comprende el periodo desde que el dolor y la hinchazón ceden hasta que los extremos óseos están unidos por tejido fibroso o cartilaginoso que hace que ya no se muevan uno respecto del otro 149. Esta fase comienza hacia el final de la segunda semana en el hombre 64. Células mesenquimales pluripotenciales forman el tejido fibroso, cartílago y hueso en el foco. Estas células pueden proceder de 89,130,149,158 : a) células endoteliales del canal medular; b)

45 Introducción 32 capa interna del periostio; c) inducción osteogénica de células de partes blandas adyacentes. El hueso más precoz aparece en los bordes del periostio, a partir de las células de la capa interna del mismo 28,76,130,149. En la zona externa del callo se forma cartílago, lo que se supone es debido a la baja tensión de oxígeno en dicha zona 76,89,130. La cantidad de cartílago formado también depende de la movilidad entre los fragmentos, formándose más cartílago a mayor movilidad º.- Callo duro: El proceso reparativo continúa hasta que el callo se convierte totalmente en tejido óseo inmaduro, entre 1-4 meses tras la fractura 64. El hueso se forma por: a) osificación encondral, a partir del cartílago formado en la fase anterior; b) osificación membranosa, directamente a partir de las células mesenquimales de la capa interna del periostio 89,158,208. La mineralización del callo ocurre en una secuencia definida: las células sintetizan matriz con una alta concentración de colágeno tipo I, y luego favorecen las condiciones locales para el depósito de cristales de hidroxiapatita entre estas fibras 28. Así, las células deben eliminar los factores locales que inhiben la mineralización en la matriz fibrocartilaginosa, tales como las altas concentraciones de glicosaminoglicanos 50. Esto lo realizan los condrocitos secretando proteoglicanasas neutras que degradan estas moléculas, y también disminuyendo la acidez del medio. Después, los condrocitos y osteoblastos depositan complejos de calcio y fosfato por medio de la liberación de vesículas 24. Estas vesículas llevan no sólo mineral, sino también proteasas neutras (degradan más glicosaminoglicanos) y fosfatasa alcalina, que hidroliza el ATP y otras moléculas ricas en fosfato para facilitar la precipitación del calcio con éste. La calcificación va ocurriendo desde los extremos del callo hacia el centro y fuera, formando una especie de V en el corte longitudinal 76, que poco a poco se va convirtiendo en una V de ángulo más agudo, hasta desaparecer. Durante todo el proceso de consolidación, el contenido mineral del callo va aumentando progresivamente 149. La recuperación de la fuerza y rigidez del hueso parecen más relacionados con la cantidad de nuevo hueso que une los fragmentos, que con la cantidad total de callo 149. Cuando la fractura se sintetiza de forma rígida, se produce la llamada consolidación ósea primaria o

46 Introducción 33 directa, sin formación de callo visible, donde se pasa directamente de la fase de inflamación a la de remodelación 35,139. 4º.- Remodelación ósea: durante esta última fase, el hueso inmaduro se va convirtiendo en hueso laminillar maduro, y se reconstruye el canal medular. Esta fase puede durar años 28,149. En el hueso esponjoso, se va produciendo la aposición y sustitución en superficie del tejido óseo 130. En el hueso cortical, los osteoblastos labran un túnel por el que se forma un vaso que a su vez trae a los osteoblastos que van depositando hueso laminillar y formando una nueva osteona 130. En esta fase también se acaban de sustituir los extremos de hueso muerto por tejido cortical sano 76. En estudios histológicos se ha comprobado que la remodelación del hueso del callo perióstico comienza antes de que se produzca la unión de la fractura 7. Los fenómenos vasculares que ocurren durante todo el periodo de consolidación de la fractura varían con el tiempo. Inicialmente, el flujo sanguíneo disminuye por la lesión de vasos en el foco de fractura. Entre unas horas y pocos días, va aumentando el flujo hasta alcanzar un máximo a las dos semanas, volviendo paulatinamente a la normalidad a las 12 semanas. No se ha definido con precisión el estímulo responsable de la invasión vascular 28. Estos cambios en el flujo vascular se acompañan de cambios en la presión de oxígeno en el callo. Así, la po2 es muy baja en el hematoma, y es máxima cuando se ha formado el tejido fibroso. De todas formas, a pesar del gran crecimiento de capilares en el callo, la proliferación celular es tal que las células permanecen durante la mayor parte del tiempo en un estado de hipoxia relativa 22,35. Este estado hipóxico puede ser favorable para la formación ósea, ya que in vitro el crecimiento óseo ocurre mejor con baja po Normalmente, en un hueso largo, la cortical ósea está irrigada por vasos situados en la médula ósea, siendo el flujo sanguíneo centrífugo. Tras una fractura, se desarrolla rápidamente una vascularización extraósea derivada de los tejidos blandos periféricos, cuya función principal es irrigar el callo externo 166. En los últimos estadios del proceso se vuelve a desarrollar la circulación medular y cede la predominancia de la vascularización periférica.

47 Introducción 34 Existen diversas sustancias, denominadas globalmente como factores de crecimiento, que parecen tener un papel importante en la consolidación de las fracturas. Algunas de las más importantes son: a) IGF-II (factor de crecimiento similar a la insulina, tipo II) 137,149. Es un polipéptido de 67 aminoácidos. En cultivos celulares, estimula la proliferación de células óseas y la producción de colágeno de forma dosis-dependiente. La producen las células óseas, y tanto la PTH 114 como la 1,25 (OH)2 vitamina D3 113 estimulan su producción. b) IGF-I (factor de crecimiento similar a la insulina, tipo I) 137. Es un polipéptido de 70 aminoácidos. También se ha comprobado que estimula la proliferación de células óseas en cultivo, de forma dosis-dependiente. El 17-ß-estradiol y la PTH 114 estimulan su producción. La sintetizan las células óseas, pero en una proporción veces menor que la IGF-II en el hombre, aunque en la rata se invierte esta proporción 137. c) TGF-ß (factor transformador del crecimiento, tipo ß) 137,149. Se encuentra en el hematoma fracturario a las 24 horas de la fractura 151. Se encuentra en plaquetas, células mesenquimales, osteoblastos y condrocitos. Induce la síntesis de colágeno 149 por células mesenquimales y osteoblastos, así como la proliferación de células mesenquimales indiferenciadas 151. Puede ser el responsable de la regulación de la formación de cartílago y hueso en el callo 149, ya que se ha observado que disminuye la expresión de los genes específicos de los condrocitos y aumenta la expresión de los específicos de los osteoblastos 151. d) PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas). Su principal función es quimiotáctica 149 : atrae células inflamatorias al foco de fractura, pero también induce la proliferación de células mesenquimales 137,151. Es liberada de plaquetas y monocitos en las fases precoces de la consolidación y puede jugar un papel importante en la iniciación de la consolidación 149. e) BMP (Proteina morfogenética ósea) 137,149. Es una glicoproteina de bajo peso molecular que puede inducir la formación de hueso en localización ectópica 96. Se han

48 Introducción 35 diferenciado 3 tipos: BMP-1, 2A y La BMP-3 también se conoce como osteogenina 137,149, y es muy potente para inducir la diferenciación del tejido mesenquimal extraesquelético en hueso. Actualmente se están describiendo más tipos de BMPs 52. El desarrollo de todo el proceso de consolidación es muy dependiente del grado de estabilidad que presenten los extremos fracturarios durante todo el proceso reparativo 35,149. La naturaleza de la respuesta celular depende directamente de este grado de estabilidad. Si son muy estables, se formará muy poco cartílago y se pasará casi directamente de la fase inflamatoria a la de callo duro. Si no lo son, se formará un gran callo blando para estabilizar los fragmentos. Este paso previo es necesario porque el tejido que va apareciendo a medida que avanza la consolidación es capaz de tolerar una menor deformación sin romperse. Para un grado de movilidad dado, la deformación en el callo es inversamente proporcional a la distancia entre los extremos fracturarios. Por esto, si el espacio es pequeño, pequeños movimientos de los extremos pueden producir una deformación tan alta que impida al tejido de granulación formarse. Cuando esto ocurre, pequeñas secciones de los extremos del hueso pueden reabsorberse, haciendo el espacio mayor y reduciendo la deformación por unidad de callo formado Fenómenos que modifican la consolidación Las variables más importantes que se ha comprobado que modifican el curso normal de la consolidación las podemos agrupar en: A) Factores locales: - Gravedad de la lesión: En lesiones graves, se produce un gran desplazamiento de los extremos fracturarios, así como una lesión importante de partes blandas. Estos dos factores retardan la consolidación, probablemente porque el gran daño tisular aumenta el volumen de tejido necrótico y el hematoma, así como también lesiona el riego sanguíneo local, con lo que

49 Introducción 36 disminuye la migración de células mesenquimales y la invasión vascular del callo 167. En lesiones menos graves, queda un manguito de tejidos blandos que son una fuente de células mesenquimales viables, así como una especie de férula interna que contribuye a la inmovilización de los fragmentos Fracturas abiertas: La consolidación se retarda debido a la importante lesión de partes blandas, así como al gran desplazamiento que suelen presentar los fragmentos, aumentado a veces por la pérdida de hueso 28. Además, las fracturas abiertas pueden infectarse 149, lo que bloquea el proceso de consolidación. - Infección: Retrasa o bloquea la consolidación porque deriva muchas células hacia la tarea de eliminar la infección. Además, ésta produce la necrosis de tejidos sanos, edema y trombosis de los vasos sanguíneos, lo que favorece el retardo 6. - Fracturas intraarticulares: Pueden retrasar la consolidación, ya que el líquido sinovial contiene colagenasas que pueden degradar la matriz del callo blando Fracturas segmentarias: En estos casos, suele asociarse una gran lesión de partes blandas, con lo que se compromete la vascularización del fragmento intermedio 28. El hecho de ser una fractura segmentaria por sí sólo no parece retrasar la consolidación El riego sanguíneo deficitario, bien debido a la lesión inicial, o por la anatomía particular de algunos huesos, retrasa la consolidación Tipo de hueso fracturado (esponjoso o cortical): El hueso esponjoso consolida más rápidamente que el cortical, posiblemente debido a que en el hueso esponjoso existe una mayor superficie de hueso por unidad de volumen, lo que crea muchos puntos de contacto ricos en células y vasos Fracturas patológicas: Ocurren sobre un hueso debilitado por alguna enfermedad general (osteoporosis, osteomalacia, hiperparatiroidismo, etc.) o local (tumores, quistes óseos,

50 Introducción 37 infecciones, etc.) 28. Puede retrasarse la consolidación o incluso no hacerlo si no se soluciona la enfermedad de base. B) Factores generales (sistémicos): - Edad: Las fracturas en niños consolidan más rápidamente que en adultos 64, tanto más cuanto más pequeño. Esto puede ser debido a que las células de personas más jóvenes pueden diferenciarse más rápidamente 201, o a que a ser el periostio de los niños más grueso, participa más en la consolidación 28. También se ha demostrado un retraso en la consolidación a mayor edad, en estudios experimentales en ratas 12,54. - Factores hormonales: Muchas hormonas, aparte de la vitamina D (que se detalla más adelante) alteran la consolidación. Los corticoides retrasan la consolidación, problablemente inhibiendo la diferenciación de las células mesenquimales a osteoblastos 191, y disminuyendo la síntesis de matriz orgánica 37. La hormona del crecimiento, la hormona tiroidea, calcitonina, insulina y esteroides anabolizantes estimulan la consolidación de fracturas en estudios experimentales Lesiones neurológicas: Se ha demostrado experimentalmente que la denervación retrasa la consolidación de fracturas 165. Esto puede ser debido a que disminuye las fuerzas compresivas en el callo (ver más adelante) o a que inhibe el efecto de los factores de crecimiento que requieren ser activados por neurotransmisores Nutrición: Se ha demostrado en ratas que una disminución del aporte de proteinas y/o minerales retarda la consolidación 51,149, pero un aporte excesivo no la acelera más allá de lo normal 51,95. C) Factores derivados del tratamiento: - Aposición de los extremos fracturarios: Al disminuir el hueco entre los extremos, disminuye el volumen de tejido necesario para la consolidación, con lo que ésta se acelera 28. Por

51 Introducción 38 ello, una buena reducción de la fractura mejora la consolidación 5, siempre y cuando se mantengan estables los extremos fracturarios. - Carga del callo: Determinadas fuerzas compresivas en el callo en el momento adecuado estimulan la formación y mineralización del tejido óseo, mejorando la resistencia mecánica del mismo 74,180, quizá por efecto piezoeléctrico Campos eléctricos: En condiciones experimentales, los campos eléctricos pueden modificar la proliferación celular y síntesis de sustancias 28. Los campos eléctricos no aceleran la consolidación ósea normal, pero parece que sí pueden estimular la consolidación en algunos casos de pseudoartrosis o retardos de consolidación 23,25. - Estabilización de la fractura: Facilita la consolidación al impedir la rotura contínua del tejido del callo 28. C.2) Métodos de valoración del callo Los agrupamos en: C.2.1) Biomecánicos Los principales tipos de sobrecarga experimentados por los huesos del organismo son de 4 tipos: compresión, tracción, flexión y torsión. Tanto los huesos como el callo de fractura pueden ser ensayados de estas formas. Las pruebas de tracción tienen una utilidad limitada, debido a la necesidad de huesos relativamente largos para poder ser ensayados 205. Las técnicas de compresión son menos exactas que las realizadas en tracción, por lo que prácticamente no se usan. Los dos tipos de ensayo más usados son los de flexión (bending) y torsión. Los ensayos de flexión han sido muy usados para medir las propiedades mecánicas de los huesos de pequeños roedores 205. Se puede producir la flexión en 3 puntos, concentrando la

52 Introducción 39 fuerza en un punto central, o en 4 puntos, con lo que la fuerza se distribuye entre los 2 puntos centrales 93. Cuando se ensaya en flexión, se considera que la distancia entre los dos puntos de apoyo más separados debe ser mayor que 16 veces el grosor de la muestra. Si es menor, la mayoría del desplazamiento inducido al aplicar la fuerza será debido a fuerzas cizallantes, y no la flexión 205. En ratas, esta proporción no se puede conseguir, pero se considera que la distancia entre los dos puntos de apoyo más separados debe ser mayor que 15 mm. en ratas hembras para garantizar que el 85-90% de la deformación del hueso es debida a flexión 205. En los ensayos de flexión, la configuración en 3 puntos tiene la ventaja de la sencillez, pero también el inconveniente de crear mucha tensión cortante cerca de la zona media del hueso. La configuración en 4 puntos produce fuerzas puras de flexión entre los dos apoyos centrales, pero requiere que la presión ejercida en estos dos apoyos sea igual, lo que no es tan fácil cuando se trabaja con huesos de morfología irregular 205. Los ensayos de torsión miden el comportamiento mecánico del hueso o callo bajo tensiones cortantes, producidas en la sección transversal por el momento torsor inducido. Al torcer un hueso, la tensión cortante producida varía desde cero en el eje de giro hasta un nivel máximo en la superficie 205. Para ensayar un hueso, se embuten los extremos del mismo en unos cabezales, y se hace girar un cabezal sobre el otro 205. En los ensayos de torsión se calculan 54 : 1.- Par torsor máximo (en Nm) soportado por la pieza antes de fracturarse. 2.- Deformación (en grados) soportada por la pieza en el momento de la fractura. Ambos parámetros se expresan en una gráfica fuerza deformación, similar a la de la figura Módulo de elasticidad en torsión 205. Es una medida de la resistencia del material a las deformaciones cortantes (rigidez), expresada por la pendiente de la curva en la zona elástica. 4.- Energía absorbida (en Julios), representada por el área bajo la curva. En los estudios experimentales sobre consolidación, se aprecia que estos 4 parámetros van aumentando progresivamente a medida que avanza la consolidación, ya desde la primera semana 12,53. Se considera que una prueba mecánica para un hueso debe 32 : 1) Producir fracturas

53 Introducción 40 similares a las que se observan en la clínica; 2) La carga aplicada debe repartirse homogéneamente por todo el material, de forma que identifique las zonas débiles. Este punto es de especial transcendencia cuando lo que evaluamos es la consolidación de una fractura; 3) Depender lo menos posible de la geometría del hueso, en particular de la longitud del hueso; 4) La carga debe aplicarse de forma controlada y reproducible; 5) El aparato de medición debe ser relativamente sencillo y fácil de ajustar. De todas las pruebas mencionadas, la que mejor satisface todos los puntos es la torsión, por lo que se considera la prueba de elección 32. Mediante ensayos de torsión, se han definido, desde el punto de vista biomecánico, cuatro estadios en la consolidación de fracturas 210. Son: I.- Al ensayar la pieza con el callo, la fractura se produce por el mismo sitio de la fractura original, con baja rigidez; II.- Fractura en el mismo lugar, pero con alta rigidez; III.- Fractura parcialmente sobre el mismo lugar y sobre zona intacta, con alta rigidez; IV.- Fractura totalmente sobre hueso intacto, con alta rigidez. C.2.2) Histológicos La histomorfometría consiste en el análisis histológico cuantitativo de los diferentes elementos que integran el tejido óseo (células y tejido intercelular) 185. Los recuentos y mediciones realizados directamente en cortes histológicos sin descalcificar y teñidos con métodos convencionales, permiten obtener una serie de datos, llamados parámetros estáticos. Los parámetros dinámicos se obtienen a partir de muestras en las cuales se han realizado marcajes con tetraciclinas, las cuales introducen el factor tiempo en dichas mediciones 185. Existen varios métodos para realizar las mediciones: manuales, automáticos y semiautomáticos, en función del grado de ayuda que proporciona el ordenador. El método con mejor relación coste/eficacia es el semiautomático 185. Existen infinidad de parámetros que se pueden medir sobre el hueso. Los únicos que han sido usados en el estudio del callo de fractura son 7 : 1.- Superficie relativa de osteoide: Es la relación entre la superficie de tejido óseo

54 Introducción 41 trabecular nuevo cubierto por osteoide partido por la superficie total de tejido óseo trabecular multiplicado por Superficie relativa de reabsorción: Es la relación entre la superficie de tejido óseo trabecular nuevo cubierto de osteoclastos partido por la superficie total de tejido óseo trabecular multiplicado por Número relativo de osteoclastos: Es el número de osteoclastos partido por la superficie total de tejido óseo trabecular en mm, multiplicado por 100 (se expresa en nº/100mm). 4.- Superficie quiescente: Es un parámetro secundario derivado de los anteriores, igual a (Superf. relat. de osteoide + Superf. relat. de reabsorción). Se expresa en %. En el único estudio disponible de histomorfometría en el callo de fractura, realizado sobre fracturas en tibias de ratas 7, se observó: a) La superficie relativa de osteoide tendía a incrementarse desde las dos hasta las seis semanas de consolidación, no siendo las diferencias estadísticamente significativas. b) La superficie relativa de reabsorción tendía también a incrementarse a medida que pasaba el tiempo, no siendo las diferencias estadísticamente significativas. c) El número relativo de osteoclastos iba disminuyendo progresivamente a medida que transcurría la consolidación, siendo las diferencias estadísticamente significativas (p<0.05). d) La superficie quiescente tendía a disminuir progresivamente, no siendo las diferencias estadísticamente significativas. Todas estas mediciones son muy difíciles de realizar sobre el tejido óseo del callo, siendo escasa la información que proporcionan sobre el estadio de la consolidación. Mediante histomorfometría se podría comprobar la existencia o no de osteomalacia en el tejido óseo del callo de fractura. La forma más eficaz de diagnosticar la osteomalacia en el tejido óseo es demostrar una prolongación en el tiempo medio de retardo de la mineralización 184, un parámetro dinámico que precisa del uso de marcajes con tetraciclinas. Una forma indirecta consiste en demostrar un aumento del espesor de los ribetes de osteoide 184. Nunca se ha usado este parámetro en la valoración del callo de fractura.

55 Introducción 42 Se ha postulado que el análisis cuantitativo de las proporciones de tejido fibroso, cartílago y hueso en el callo permite la comparación entre callos formados bajo diferentes condiciones experimentales 112,193. Hiltunen 85 encontró en el callo de fracturas de tibia de ratón que el pico máximo de tejido mesenquimal se producía al 7º día, mientras que el de cartílago al 9º día, disminuyendo después progresivamente. La cantidad de hueso (medido en cortes longitudinales, en mm 2 ) iba aumentando progresivamente a medida que avanzaba la consolidación. Lindgren 112 clasificó los callos de las fracturas experimentales que producía en ratas (todas con el mismo tiempo de evolución) como completamente consolidados, incompletamente, y no-unión, en función del predominio de un tipo de tejido sobre otro. Key 95 realizó fracturas experimentales en fémures de ratas sometidas a diferentes dietas, y consideró que la similitud histológica de los callos al corte era una prueba de la semejanza de la consolidación entre los distintos grupos. Sin embargo, este análisis cuantitativo tiene el inconveniente de que se realiza sobre un corte del callo, que puede o no ser representativo del resto 8, y, además, no tiene en cuenta la existencia de puentes óseos entre los extremos fracturarios, que es el factor más importante en la recuperación de la resistencia mecánica 42. C.2.3) Densitométricos Se basan en la cuantificación del contenido mineral óseo del callo 46,121. Se ha demostrado en fracturas experimentales en metatarsianos de rata 159, que el contenido mineral del callo va aumentando a medida que avanza la consolidación, mostrando un incremento brusco que coincide con la mayor recuperación de la resistencia mecánica del hueso. De todas las técnicas disponibles, las 3 más prometedoras son: 1.- Tomografía axial computerizada cuantitativa. Mide la densidad mineral ósea con un error del 0.2 al 4% 121. Markel 122 aplicó esta técnica para el estudio del callo de fractura, encontrando una fuerte correlación entre las mediciones de densidad ósea realizadas en callos de

56 Introducción 43 tibias de perro y los parámetros resultantes del ensayo biomecánico a torsión a baja velocidad (15 /min.). Todavía se necesitan más estudios que confirmen la utilidad de esta técnica. 2.- Densitometría fotónica simple. La tasa de error de la técnica es menor del 4% 121. Finsen 61 encontró un aumento del 28% del contenido mineral óseo aparente en el callo de 20 pacientes con fractura de diáfisis tibial. Aro 9 examinó el callo de fractura de tibias de ratas mediante densitometría fotónica simple de alta precisión, encontrando una muy alta correlación (r>0.8) entre el contenido mineral óseo medido, el peso de las cenizas del callo y la dureza del callo medida mediante test de indentación. 3.- Densitometría con rayos X de doble energía (DEXA). La tasa de error es del % 121. Markel 123 midió el contenido mineral óseo con DEXA en el callo de tibias de perros, encontrando una alta correlación (r 2 >0.5) entre estos valores medidos en la zona externa del callo y la rigidez y par torsor máximo de dichas tibias ensayadas a torsión a baja velocidad. Sin embargo, este mismo autor 123 encontró mayor correlación cuando medía la densidad ósea mediante densitometría fotónica simple. Esto lo atribuyó a la baja resolución del aparato de DEXA empleado en este estudio. Por eso, este autor cree que el DEXA puede ser más útil que la densitometría fotónica simple, al desarrollarse aparatos más precisos y ser más sencillos de usar. C.2.4) Otros Otros métodos usados en la evaluación del callo de fractura son: 1.- Frecuencia de resonancia e impedancia: Se aplica un impacto de fuerza conocida al hueso en consolidación, y se registra la vibración producida en el otro extremo 179. Durante la consolidación, la frecuencia de resonancia va aumentando hasta ser similar a la del hueso sin fractura 112. Esta técnica presenta mucha variabilidad según la colocación de los sensores, partes blandas periféricas, etc., lo que hace que actualmente sea una técnica poco usada. 2.- Ultrasonidos: Se basan en la medición de la velocidad del sonido al pasar por el callo

57 Introducción 44 de fractura 121. Sin embargo, la gran variabilidad de los resultados debido a la conducción por partes blandas (con mucho menor coeficiente de atenuación) hacen a la técnica poco reproducible. 3.- Indentación: Consiste en medir la resistencia del callo a la indentación. Presenta una gran variabilidad como técnica para medir las características mecánicas globales 4,111, aunque puede ser útil para orientarnos sobre las características mecánicas de algunas zonas particulares del callo 123.

58 Introducción 45 C.3) Vitamina D y consolidación de fracturas Se ha demostrado una aceleración del proceso de consolidación en ratas tras la administración de 1,25 (OH)2 vitamina D3 19,112. Lindgren 112, usando ratas macho adultas tipo Holzman, realizó una fractura experimental en el 1/3 medio del fémur. Encontró que los parámetros biomecánicos del callo medidos a flexión (bending) tras 4 semanas de consolidación eran significativamente superiores en el grupo tratado con 1,25 (OH)2 vitamina D3 respecto a los controles. Blahos 19 también realizó fracturas experimentales en fémures de ratas Wistar de 3 meses de edad. Comprobó un aumento del peso seco de los fémures fracturados que habían recibido suplementos de 1,25 (OH)2 vitamina D3, a partir de la segunda semana de consolidación. Sin embargo, este efecto no se ha demostrado tras la administración de vitamina D. Einhorn 51 realizó fracturas experimentales en fémures de ratas macho adultas tipo Sprague- Dawley. Tras 5 semanas de consolidación, no encontró diferencias en los parámetros biomecánicos del callo medidos en torsión a alta velocidad, entre el grupo control y otro suplementado con vitamina D, calcio y fósforo. Este es el único estudio existente usando vitamina D. Por otro lado, Lidor 109 estudió la influencia de la fractura sobre los metabolitos de la vitamina D3, así como la distribución de éstos en diferentes tejidos durante el proceso de consolidación, en un estudio experimental en pollos. En sangre, encontró niveles casi indetectables de 1,25 (OH)2 vitamina D3 el primer día postfractura, para subir al pico máximo al tercer día, pero siempre por debajo de los niveles de animales pareados sin fractura (controles). Los niveles de 24,25 (OH)2 vitamina D3 se mantuvieron relativamente similares a los de los controles durante todo el periodo de consolidación. No midió la 25 (OH) vitamina D3 en sangre. En el callo de fractura, los niveles de 25 (OH) vitamina D3 permanecieron constantes durante todo el periodo de consolidación, mientras que los de 1,25 (OH)2 vitamina D3 presentaron un pico máximo a los 7 dias, al comenzar la remodelación del callo. El 24,25 (OH)2 vitamina D3 presentó su pico máximo a los tres días, coincidiendo con el desarrollo máximo del tejido cartilaginoso en el callo.

59 Introducción 46 En conclusión, no hay evidencia clara sobre la influencia de la suplementación de calcidiol sobre la consolidación de fracturas en ancianos, ni sobre el efecto del déficit de vitamina D (observado en ancianos con fractura de cadera) sobre la consolidación de las fracturas, lo que nos animó a desarrollar este trabajo.

60 HIPOTESIS Y OBJETIVOS

61 Objetivos 48 Se ha demostrado que la suplementación con calcidiol en el anciano, disminuye la tasa de fracturas. También se ha indicado que los niveles de calcidiol en sangre son inferiores en los pacientes ancianos que se rompen la cadera frente a controles de la misma edad y sexo. Todo esto sugiere que el déficit de vitamina D debilita al hueso sano, mientras que la suplementación lo fortalece. El objetivo fundamental de este trabajo es comprobar el efecto, tanto del déficit como de la suplementación con calcidiol, sobre el fenómeno de la consolidación de las fracturas. Así pues, se planteó la hipótesis, a partir de los conocimientos existentes sobre el riesgo de producción de fracturas en el hueso sano, de que la 25-OH-vitamina D (calcidiol), suministrada en el momento de la fractura, mejoraría la consolidación de las fracturas en ancianos. Asimismo, el déficit de vitamina D durante los últimos meses de la vida, empeoraría la consolidación de dichas fracturas. Este empeoramiento sería reversible con la suplementación con calcidiol desde el momento de la fractura. Para comprobar la veracidad de esta hipótesis, se diseñó un modelo experimental sobre ratas ancianas tipo Wistar, para así poder tener un control histológico, densitométrico y biomecánico del fenómeno de la consolidación, algo que hubiera sido imposible de realizar en humanos. Los objetivos concretos de este trabajo fueron: 1º.- Diseñar un modelo experimental en animales ancianos con el fin de estudiar la posible influencia del déficit y la suplementación de vitamina D (calcidiol) en la consolidación de fracturas. 2º.- Adaptar para este modelo una prueba mecánica fiable que permita estudiar la resistencia mecánica del callo en consolidación, así como del hueso sano. 3º.- Validar un metodo de medición de la densidad ósea en el callo de fractura, relacionando estos resultados con los de la prueba mecánica.

62 Objetivos 49 4º.- Comprobar la influencia del déficit de vitamina D, así como de la suplementación con calcidiol, sobre la histología del callo de fractura, así como sobre la densidad ósea y resistencia mecánica tanto del callo de fractura y como del hueso sano. 5º.- Comprobar la influencia de las hormonas calciotropas (calcitriol, PTH) sobre la densidad ósea y resistencia mecánica del callo de fractura y del hueso sano, en dicho modelo.

63 MATERIAL Y METODOS

64 Material y métodos 51 1º.- Animales de experimentación y grupos Se utilizaron 55 ratas tipo Wistar hembras, nacidas en el animalario del hospital "La Paz" y criadas en el mismo hasta cumplir los 18 meses de edad. Durante este tiempo, permanecieron en el animalario a una temperatura estable de 22 C, con ciclos luz-oscuridad de 12 horas diarias, con bebida y comida "ad libitum". La dieta suministrada (Beekay R ) contenía un 1.27% de calcio, 0.885% de fósforo, así como 3000 UI de vitamina D3 por kilo de alimento, entre otros. En este momento las ratas se dividieron al azar en 4 grupos, llamados N (normal), NS (normal suplementado), D (deficitario), y DS (deficitario suplementado), de 11, 11, 18 y 15 ratas, respectivamente. Los dos primeros grupos (N, NS) siguieron con la dieta normal, antes mencionada, mientras que los dos últimos (D, DS) comenzaron con una dieta similar a la anterior, pero libre de vitamina D (deficitaria en vitamina D) (Esquema 1). Tras 6 semanas de dieta, se llevó a cabo la fractura experimental. Desde este momento, los grupos NS y DS recibieron una suplementación de 25-OH-vitamina D ó calcidiol (Hidroferol R, laboratorios FAES, Bilbao) vía subcutánea de 250 UI/100 gr. de peso en el momento de la fractura, seguidas de dosis de 125 UI/100 gr. subcutánea a los 15 y 30 días, sucesivamente. De las 55 ratas que iniciaron el estudio, una murió tras la primera inyección de anestesia, mientras que otras 4 murieron en el postoperatorio inmediato de la realización de la fractura experimental, o los pocos días. Otras 5 ratas más murieron durante la última fase del estudio, parece ser que debido a la avanzada edad. Con todo esto completaron el estudio 45 ratas, 11 del grupo N, 9 del NS, 12 del D y 13 del DS. Para diseñar la vía de administración de la suplementación, se seleccionaron 6 ratas hembras tipo wistar de 4 meses de edad, dividiéndose en 3 grupos: al primero (ORAL) se le administraron 250 UI/100 gr. de peso de 25-OH-vitamina D (calcidiol) junto con la comida, asegurando su ingesta al día siguiente; al segundo (SUBCUTANEO) se le administró la misma dosis vía subcutánea en el abdomen; al tercero (INTRAPERITONEAL) se le administró la misma dosis vía intraperitoneal. A los 5 días fueron sacrificados y se midieron los niveles de 25- OH-vitamina D (calcidiol) en suero. La vía que pareció ofrecer resultados más homogéneos fue

65 Material y métodos 52 la subcutánea, por lo que se utilizó esa vía (véase resultados y discusión, más adelante). Esquema 1: Diseño experimental

66 Material y métodos 54 las tibias. A las 5 semanas de la fractura, las ratas fueron sacrificadas, extrayéndose los fémures y El trabajo se dividió en 4 series, cada una de las cuales contenía un número aproximadamente igual de miembros de los 4 grupos, para disminuir así en lo posible la variabilidad debida al momento de realización del experimento, así como la derivada de los distintos lotes (camadas) de ratas usadas. 2º.- Fractura experimental Se llevó a cabo mediante un aparato construido siguiendo los principios de Bonnarens y Einhorn 21 (Foto 1). Las ratas se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de una solución compuesta por: clorhidrato de ketamina 50 mgr/ml; Atropina 1 mgr/ml; y diacepam 5 mgr/ml. De esta solución se administró una dosis de 0.25 ml por cada 100 gr. de peso. Tras la anestesia, se administró una dosis de antibiótico, cefazolina, a la dosis de 4 mgr/100 gr de peso, inyectada vía intramuscular en el tríceps braquial derecho. Posteriormente, se rasuraban ambas rodillas y se sumergía todo el material quirúrgico (bisturí, pinzas de disección, mango en T, agujas de kirschner, etc.) en una solución de clorhexidina al 5%. La primera parte de la realización de la fractura consistía en el enclavado intramedular retrógrado de ambos fémures mediante una aguja de Kirschner de 1 mm de diámetro. Para ello, se practicó un abordaje anteromedial de la rodilla, seccionando el alerón rotuliano interno y rechazando la rótula lateralmente, con lo que se exponían ambos cóndilos femorales. Posteriormente se montaba la aguja de Kirschner con punta trócar en un mango en T y se insertaba la misma a través de la escotadura intercondílea, sin realizar ningún tipo de fresado. Se insertaba toda la aguja por el canal intramedular del fémur hasta que ésta emergía por el trocánter mayor y atravesaba la piel. En este momento se cortaba la aguja a nivel de los cóndilos femorales y se la hacía avanzar tirando del extremo proximal de ésta, para evitar que el extremo distal de la aguja lesionara la rodilla. Entonces se doblaba el extremo proximal de la aguja a 90,

67 Material y métodos 55 para así evitar la migración distal de la aguja durante el proceso de consolidación, y se cortaba para evitar la lesión de la piel en la zona del trocánter. La incisión se cerraba con Dexon R de 3/0 y seda 3/0, suturando con mucho cuidado el alerón rotuliano interno, para evitar la luxación de la rótula. Después de este pre-enclavado, se pasaba inmediatamente a la producción de la fractura, de forma bilateral. El aparato de fractura (Foto 1) consistía básicamente en 2 puntos de apoyo, donde se colocaba la pata del animal (Foto 2) a la altura del tercio medio del fémur, y un peso que se dejaba caer justo en el medio, sobre un sistema de "Guillotina" que tiene un tope que limita la profundidad del desplazamiento, así como un resorte que permite que el impacto sea un golpe seco. La distancia entre los dos puntos de apoyo fijos era de 1.5 cms. El peso, de 400 gr., se dejaba caer de una altura de 75 cms. Las fracturas así producidas fueron en su inmensa mayoría transversas u oblícuas cortas, mínimamente desplazadas. Una vez producida la fractura, se comprobaba ésta mediante un aparato de radioscopia convencional (General Electric-Estenoscop: 2 segs, 49 Kv, 0.7 ma), y si en algún caso ésta no se había conseguido, se repetía el procedimiento. También se practicaba radiografía (Cabinet X- Ray System - Faxitron series. Hewlett Packard) en placa de alta sensibilidad Agfa Mamoray RP3 (exposición 15 segs, 34 Kv)(Foto 3), para posterior comprobación de la morfología de la fractura. Aquéllos casos en los que la fractura no se situaba en el tercio medio del fémur, fueron desechados para algunos estudios posteriores (histología y prueba mecánica). Sin embargo, sí se les realizó la densitometría, porque se consideró que en este caso la localización de la fractura no influiría excesivamente en los resultados. En este momento se inyectaba un analgésico (buprenorfina, vía subcutánea, en una dosis de mgr/kgr. de peso) para disminuir el dolor a la rata en el postoperatorio inmediato. También entonces se procedía a suplementar con 25-OH-vitamina D (calcidiol) a aquellos grupos así programados (NS y DS), vía subcutánea. Posteriormente se colocaba a la rata en su jaula, permitiendo la carga inmediata.

68 Material y métodos 56 3º.- Sacrificio y conservación Tras 5 semanas desde la producción de la fractura, se procedía al sacrificio. Se volvió a anestesiar con el mismo preparado (ketamina, atropina, valium) al animal. Tras la realización de una laparotomía media, se identificaba la vena cava y se canalizaba ésta con una aguja intramuscular, extrayendo la máxima cantidad de sangre posible (unos 10 ml), para el análisis bioquímico. Posteriormente se extraían ambos fémures y ambas tibias, liberándolos de partes blandas y extrayendo la aguja intramedular del fémur. No existieron signos clínicos de infección (rubor, calor) en ninguno de los fémures extraídos. Ninguna aguja extraída del fémur tuvo una angulación superior a los 5, ni hubo problemas de extracción. Las tibias se introdujeron en gasas húmedas (suero fisiológico) y se conservaron a -20 C. Los fémures se dividieron en dos grupos. 16 de ellos, elegidos al azar, se introdujeron en una solución de alcohol de 70, para realizar posteriormente estudios histológicos. El resto fueron introducidos en una gasa húmeda (suero fisiológico) y se conservaron a -20 C. 4º.- Análisis bioquímico bioquímico. Durante todo el proceso, a cada rata se le realizaron 3 tomas de sangre para análisis La primera (BASAL), se realizó al cumplir cada rata los 18 meses de edad. Bajo anestesia (ketolar, atropina, diacepam) se realizó la sección de los 2 cms. distales de la cola, extrayendose así una cantidad aproximada de 2 ml. de sangre. La segunda toma (PREFRACTURA), realizada con la misma metodología, se realizó a las 6 semanas de la primera, siempre 2 días antes de la producción de la fractura experimental, para evitar una excesiva pérdida sanguínea en un mismo momento (la derivada de la extracción y la de la fractura), y así permitir una cierta recuperación de la volemia. La tercera y última toma (SACRIFICIO) fue la del sacrificio, obtenida mediante laparotomía y venopunción de la vena cava abdominal, obteniéndose una cantidad aproximada de 10 ml.

69 Material y métodos 57 Tras la extracción de la sangre, en tubo de vidrio, se permitió la coagulación de la misma a temperatura ambiente durante un periodo mínimo de 15 minutos. Después, se procedió a la centrifugación del mismo en una centrífuga a 3000 revs/min. durante 15 minutos. Posteriormente se separó el suero en tubo aparte y se congeló a -20 C, hasta su análisis bioquímico. En todas las muestras de sangre se determinó: a) 25-OH-vitamina D, analizado por RIA, mediante método comercial INSTAR (Stillwater-Minnesota, USA). Aquellos animales que no disminuyeron su tasa de vitamina D tras la dieta deficitaria, y aquéllos que no la aumentaron tras la suplementación serían excluidos del estudio. b) Calcitriol, por citorreceptor de timo comercializado por Nichol (San Juan Capistrano, California, USA), tras extracción con acetonitrilo y purificación por microcartucho de carbono C-18-OH. c) PTH intacta, específico para rata, mediante ensayo RIA con kit comercial comercializado por Nichol (San Juan Capistrano, California, USA). Debido a la escasa cantidad de sangre disponible en las dos primeras tomas, hubo algunas mediciones de calcitriol y PTH algunas ratas que no se pudieron realizar por falta de muestra. 5º.- Histología El estudio histológico se llevó a cabo sobre 16 fémures elegidos al azar (5 del grupo N, 3 del NS, 4 del D y 4 del DS). Inmediatamente tras el sacrificio y la extracción del fémur, se retiró la aguja intramedular y se introdujo el hueso en una solución de alcohol etílico al 70% (fijador) hasta el momento de su procesamiento.

70 Material y métodos 58 Posteriormente, se incluyeron los fémures (sin descalcificar) en metilmetacrilato. La inclusión consistió en colocar la pieza en un tubo de vidrio con fondo plano de 23 mm. de diámetro y añadir monómero de metilmetacrilato, compuesto que contiene hidroquinona como inhibidor de la polimerización. También contiene dibutilftalato, un compuesto que se añade para mejorar las propiedades del metilmetacrilato. La polimerización del monómero se consiguió añadiendo metilmetacrilato parcialmente polimerizado al monómero (iniciador). También se añadió un catalizador (benzoilperóxido), que inhibe a la hidroquinona. Una vez incluida la pieza (una semana después), se rompió el tubo de vidrio y se cortó la pieza. Los cortes se realizaron con un microtomo de Reichert-Jung (Reichert-Jung, Buffalo, New York, USA) de forma seriada en el plano sagital de la pieza, resultando cada corte de 5 micras de espesor. Posteriormente se montaron en un portaobjetos recubiertos con una lámina de polietileno y fueron prensados durante 12 horas a 37 C. El corte central de cada pieza, es decir, aquél en el cual el canal medular que había estado ocupado por la aguja intramedular aparecía más grueso, fue teñido con azul de Toluidina 38,183, una tinción que tiñe el tejido osteoide de azul pálido y el hueso mineralizado de azul violeta (Foto 4). La tinción se llevó a cabo introduciendo la muestra durante 5-7 minutos en una solución al 1% de azul de toluidina, a un ph de 4. Con ayuda de un microscopio y un ocular milimetrado Zeiss R, se determinó la anchura máxima media de los ribetes de osteoide de cada pieza. Para ello, en cada corte se seleccionó al azar un campo de visión a 40 aumentos localizado en la zona de tejido óseo neoformado del callo externo. En dicho campo, se hicieron 10 mediciones. Cada medición expresaba la anchura máxima de un ribete determinado. Los 10 ribetes que se midieron en cada pieza estaban situados unos junto a otros, pero todos individualizados. En cada pieza se halló la media aritmética de las 10 mediciones, obteniéndose un valor para cada callo. Por otro lado, también se realizó en el corte central de cada callo una medición de la superficie total del callo externo, así como del porcentaje de tejido fibroso, cartilaginoso y óseo que se observaba en dicho callo externo. Para ello se utilizó un retroproyector, con el que se

71 Material y métodos 59 dibujaron sobre papel las áreas de las distintas zonas de cada corte. Posteriormente, con ayuda de un equipo informático (Videoplan Kontron R ), se determinaron la superficie y porcentaje de cada tipo de tejido en cada corte estudiado. Las mediciones efectuadas se hicieron según la descripción de Aro 8. 6º.- Densitometría Para determinar la masa ósea, se utilizó un densitómetro tipo Hologic QDR-1000TM (S/N 277), gracias a la colaboración de la Fundación Jiménez Díaz (Clínica de la Concepción. Madrid). Este es un densitómetro radiológico digital (DEXA) que emite dos haces de energía de 70 y 140 Kv, provisto de un colimador de rayos de 1 mm para su aplicación en huesos de pequeño tamaño. Se usó un programa informático especial para el análisis con alta resolución. Los huesos congelados (fémures y tibias) se descongelaron a temperatura ambiente y se introdujeron en suero salino, donde se realizó la lectura. Los datos suministrados por el densitómetro fueron procesados por ordenador, obteniéndose la densidad ósea de una serie de zonas predeterminadas. En los fémures, estas zonas fueron (Foto 5): 1.- Extremidad distal del fémur, hasta donde comenzaba el callo (L1). 2.- Zona del callo (L2). 3.- Zona diafisaria proximal, desde el final del callo hasta la zona subtrocantérea (L3). 4.- Cabeza del fémur, hasta la zona subtrocantérea (L4). 5.- Total del fémur, resultado de sumar los valores de las 4 zonas anteriores. En las tibias, fueron (Foto 6): 1.- Epífisis distal de la tibia, desde la articulación del tobillo hasta el punto donde se estrecha para pasar a convertirse en diáfisis (L1). 2.- Diáfisis, la zona comprendida entre las otras dos (L2). 3.- Epífisis proximal, desde la articulación de la rodilla hasta el punto donde la epífisis

72 Material y métodos 60 se estrecha para convertirse en diáfisis (L3). 4.- Total de la tibia, resultado de sumar los valores de las 3 zonas anteriores. Tanto para cada zona, así como para cada hueso completo, se obtuvieron: a) Area (cm 2 ) de la zona. b) Cantidad de masa ósea, en gramos. c) Densidad de masa ósea, en gramos/cm 2, resultado de dividir a) por b). 7º.- Prueba mecánica La realización de la prueba mecánica se llevó a cabo gracias a la colaboración de la Universidad Nacional de Educación a Distancia (UNED), en cuyas instalaciones se desarrolló el procedimiento. Tras la realización de la densitometría, e inmediatamente después de ésta, se procedió a embutir los extremos óseos en unos cabezales especialmente diseñados (Foto 7). Para ello, se diseñaron unos moldes que permitían la colocación de una cabeza de resina epoxi de 16 mm. de diámetro, mediante fraguado de la resina, que se aplicaba semilíquida en el molde. Estos moldes hacían que el hueso estuviera siempre en una posición central respecto a los cabezales. Durante todas las manipulaciones, el hueso permanecía húmedo y rodeado de una capa de parafilm, para evitar la desecación (Foto 7). Posteriormente, se volvía a congelar a - 20 C hasta el momento del ensayo mecánico. El ensayo mecánico al que se sometieron los huesos fue el de torsión a baja velocidad (10 /min). Se utilizó una máquina de ensayo electromecánica tipo Schenk-Trebel modelo RTP 0.6 (Foto 8), con indicador digital M1602, a la que se acopló un sensor de alta definición para medir pares de fuerza de un rango nominal en el entorno de 1 Nm. En los amarres de la máquina se colocó un equipo especialmente diseñado para el anclaje de los cabezales de resina epoxi de 16 mm de diámetro, provistos de sistema de llave cardan para anular los momentos flexores que se pudieran generar al ensamblar el hueso a la máquina (Foto 8). La máquina suministraba dos señales: por un lado, el ángulo girado por uno de los

73 Material y métodos 61 cabezales, que lo hacía a una velocidad homogénea de 10 /min., frente al otro, que estaba fijo. Por otro lado, el sensor de alta definición indicaba el par de fuerzas registrado sobre el cabezal fijo. Estas dos señales se enviaban a un equipo informático que comprendía una tarjeta de adquisición de datos, un terminal de conexión para entrada de señales analógicas, y un sistema básico de software especialmente diseñado para la digitalización, presentación en pantalla e impresión de los datos. Mediante éste, se obtuvieron en cada ensayo: 1.- Curva XY de momento (par torsor) - ángulo girado (Fotos 9 y 10). 2.- Valor máximo del par alcanzado por la probeta. 3.- Deformación angular correspondiente al valor del par máximo. 4.- Rigidez de la probeta, calculada como interpolación entre los puntos 10%-50% de la deformación angular correspondiente al valor del par máximo (equivalente a la rigidez de la zona elástica). Representa la pendiente de la curva en esta zona. 5.- Energía absorbida por la probeta, calculada como el área bajo la curva XY. Para determinar la exactitud del método, y como fase previa a la realización de los experimentos definitivos, se realizó la torsión de 4 fémures sin fractura pertenecientes a 2 ratas hembras, tipo Wistar, de 3 meses de edad, con lo que se comprobó la fiabilidad del método (véase resultados y discusión). 8º.- Métodos de análisis estadístico Los datos cuantitativos se expresaron como la media ± la desviación típica. Para definir la variabilidad del método de torsión, se calculó el coeficiente de variación 110. Este coeficiente es igual a la desviación típica partido por la media y multiplicado por 100. El efecto que tuvieron, tanto el déficit previo, así como de la suplementación de vitamina D postfractura, sobre los datos bioquímicos, histológicos, densitométricos y mecánicos se analizaron entre los 4 grupos mediante un análisis de la varianza de 2 vías (deficit o no; suplementación o no), realizándose el método de Scheffé para comparaciones múltiples posthoc. El nivel de significación aceptado fue de La tabla esquemática del análisis de los grupos aparece en el esquema 2.

74 Material y métodos 62 La evolución de la bioquímica (25-OH-vitamina D; 1,25 (OH)2-vitamina D; PTH) entre las 3 muestras sucesivas se analizaron mediante t de Student para muestras apareadas, con corrección de Bonferroni cuando se realizaron comparaciones múltiples. La comparación entre los grupos Normal y Deficitario en la segunda muestra de sangre, se realizó mediante t de Student para muestras independientes. La correlación entre la bioquímica, densitometría y prueba mecánica se estudió mediante el coeficiente de correlación de Pearson y su intervalo de confianza del 95%. Esquema 2: División de los grupos experimentales para su análisis.

75 Material y métodos 63 Foto 1: Visión general del aparato empleado para la producción de la fractura experimental. Foto 2: Momento de la realización de la fractura: el peso cae de forma brusca sobre el fémur de la rata, colocado sobre dos puntos de apoyo.

76 Material y métodos 64 Foto 3: Radiografía de control de las fracturas producidas. Se observan dos fracturas transversas puras, el tipo de fractura más frecuentemente conseguido. Foto 4: Corte histológico de un callo teñido con azul de toluidina (15 aumentos). A la derecha, detalle de la misma preparación (75 aumentos).

77 Material y métodos 65 Foto 5: Densitometría realizada sobre un fémur. Obsérvense las distintas zonas en las que se midió la densidad ósea (L1-4). Foto 6: Densitometría realizada sobre una tibia. Obsérvense las distintas zonas en las que se midió la densidad ósea (L1-3).

78 Material y métodos 66 Foto 7: Tibia con sus cabezales de resina epoxi colocados. Está protegida de la R desecación por una capa de parafilm. Foto 8: Máquina de torsión, con sensor de alta definición y sistemas de amarre con mecanismo de llave cardan.