Int. Cl. 7 : A61K 31/ Inventor/es: Pisano, C. y Riccioni, T. 74 Agente: Carpintero López, Francisco

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 31/36 A61P 3/02 A61P /0 A61K 31/3 A61P 43/00 A61P 3/ 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Composiciones útiles para el tratamiento de patologías que responden a la activación del receptor PPAR-γ. Prioridad: IT RM Titular/es: SIGMA-TAU Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. Viale Shakespeare, Roma, IT 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Pisano, C. y Riccioni, T. 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Composiciones útiles para el tratamiento de patologías que responden a la activación del receptor PPAR-γ. 1 La presente invención se refiere al uso de la espirolaxina en tratar aquellas patologías que responden a la activación del receptor de PPARγ (receptor activado del proliferador de peroxisomas), las cuales son las diabetes de Tipo 2 insulinorresistentes. La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica, la cual comprende la espirolaxina asociada con el ácido retinoico como un principio activo para el tratamiento de aquellas patologías que responden a la activación del receptor PPARγ, las cuales son hemopatías malignas. El PPARγ es un miembro de la superfamilia del receptor nuclear. Forman heterodímeros con el receptor retinoide X (RXR) y actúa como un regulador transcripcional de los genes ligados a la glucosa y el metabolismo de lípidos (Diabetes 47(4): de abril de 1998). La diabetes mellitus es un síndrome que resulta de la interacción de factores hereditarios y ambientales; se caracteriza por trastornos en la secreción de insulina y otros metabolitos y anormalidades vasculares, es decir una concentración elevada de glucosa en la sangre, aterosclerosis no específica acelerada, neuropatía y adelgazamiento de la lámina basal capilar causada por una degeneración del riñón y la retina. De acuerdo con una clasificación moderna, la diabetes se divide en dos categorías principales: Diabetes mellitus insulinodependiente (también conocida como diabetes de tipo 1); pacientes con este tipo de diabetes dependen literalmente de insulina para prevenir cetoacidosis y muerte. Hasta donde se refiere a la secreción de insulina endógena, los pacientes con diabetes mellitus de tipo 1 presentan insulinopenia. 2- Diabetes mellitus no insulinodependiente (también conocida como diabetes de tipo 2); pacientes con este tipo de diabetes no necesitan insulina para vivir; ellos pueden decidir si la usan o no para controlar los síntomas de la diabetes. Hasta donde se refiere a la secreción de insulina endógena, los pacientes con diabetes mellitus de tipo 2 se pueden clasificar adicionalmente en dos grupos. En el primer grupo, los niveles de insulina son bien normales o bien menores que los normales: en el segundo grupo los valores de insulina son más altos que lo normal y los pacientes presentan resistencia a insulina. Como se menciona anteriormente, los PPARγ también actúan como un regulador transcripcional de los genes unidos a lípidos y del metabolismo de glucosa. Las medicaciones sensibilizantes a insulina, ligandos de PPARγ, las cuales se usan para el tratamiento de la diabetes, ya se conocen. Por ejemplo, los derivados tiazolidinadiona se describen como agentes útiles para el tratamiento de pacientes con diabetes mellitus de tipo 2 insulinorresistente. Estos compuestos son ligandos altamente afines para PPARγ; su acción antidiabética in vivo se debe a su alta afinidad de unión con el citado receptor (Nippon Rinsho febrero de 00; 8 (2):1-4). De forma similar, el PPARγ se expresa a niveles generales en varias líneas celulares leucémicas, cuya incapacidad para diferenciarse lleva a una acumulación consecuente en los niveles más inmaduros (enero, exp. 4, , 199). Las hemopatías malignas agudas son cánceres de sangre, los cuales están creciendo progresivamente y constantemente entre las poblaciones de los países desarrollados. Más y más compuestos contaminantes están presentes en el aire, los cuales causan mutaciones en la reserva de genes humanos. Estas mutaciones son a menudo la causa tanto de cánceres sólidos como de hemopatías malignas. 6 Como se menciona anteriormente, las hemopatías agudas malignas se caracterizan por la incapacidad de las líneas celulares para diferenciarse, lo cual lleva a una acumulación consecuente en los niveles más inmaduros. Los medicamentos que pueden bien eliminar estas células tumorales o bien inducir su diferenciación terminal se usan comúnmente para tratar estas patologías (terapia diferenciadora). Los ligandos de PPARγ con actividad antiproliferativa se describen en la European Journal of Cell Biology 67, agosto 199 y European Journal of Cell Biology 77, noviembre 1998, los cuales muestran una sinergia prodiferenciadora sobre diferentes líneas celulares leucémicas mieloides cuando se asocian con retinoides. De hecho, heterodimerizando con el receptor de retinoides RXT, los PPARγ determinan un incremento en la actividad del complejo receptor activado y la activación simultánea de ambos receptores (Cell Vol. 93, 241-2, abril 1998). 2

3 La terapia combinada con ácido retinoico y ligandos de PPARγ proporciona una ventaja terapéutica para el tratamiento de aquellas patologías caracterizadas por la falta de diferenciación celular, tal como hemopatías malignas agudas. 1 La espirolaxina es un compuesto conocido; se describe en Phytochemistry, (1990) vol. 29, nº. 2, páginas , como un metabolito del hongo Sporotrichum laxum. La actividad antitumoral de la espirolaxina se reporta en la solicitud de patente japonesa nº. JP Los modelos experimentales descritos en esta solicitud se refieren a pruebas in vitro en la inhibición de la proliferación de líneas tumorales. Las pruebas muestran que la proliferación se inhibe significativamente mediante citotoxicidad directa en las líneas celulares tumorales. En el documento WO 94, la espirolaxina se describe como un compuesto útil para el tratamiento de las enfermedades gastroduodenales causadas por Helicobacter pylori. En la solicitud de patente japonesa nº.: JP , la espirolaxina se describe como un compuesto que baja los lípidos con actividad anticolesterolémica. El procedimiento para la preparación de la espirolaxina se describe en Phytochemistry, (1990) vol. 29, nº. 2, páginas El ácido retinoico es un compuesto conocido también. Los perfiles toxicológicos y teratógenos de este compuesto se publicaron por J.J. Kamm en J. Am. Dermatol. 6, 62 (1982). La síntesis de este compuesto se describe por C.D. Robertson y col. en J. Am. Chem. Soc. 77, 4111 (19). La espirolaxina, bien sola o bien en combinación con el ácido retinoico todo en trans, no se ha descrito nunca como un agente útil para el tratamiento de aquellas patologías que responden a la activación del receptor PPARγ. Gracias a su capacidad de estimular la diferenciación de los promielocitos de los clones de células tumorales (terapia de diferenciación), el ácido retinoico es un agente útil para el tratamiento de leucemia aguda promielocítica (APL), un tipo particular de hemopatía maligna. Comparado con los otros tipos de leucemia el APL muestra leucocitosis menos marcada, anemia y trombocitopenia, igual que menor porcentaje de remisión y mayores tasas de mortalidad cuando se trata con quimioterapias convencionales. La APL se caracteriza por una translocación anómala, la cual implica el brazo largo del cromosoma 1 y 17 [translocación t(1; 17)] que implica el gen del receptor alfa del ácido retinoico (Cin. Lab. Sci. 00 Spring; 13 (2):6-16). La administración oral de ATRA induce la remisión completa en la mayoría de los pacientes con APL. En algunos casos, sin embargo, el tratamiento con ATRA puede causar el así llamado síndrome del ácido retinoico. Este síndrome se caracteriza por un rápido y progresivo incremento de las cuentas de leucocitos en los pacientes tratados y se trata mediante otros quimioterápicos. Además, mientras que durante el tratamiento con ATRA las células tumorales llegan a ser progresivamente resistentes a este compuesto, es necesaria una terapia de post-remisión. A pesar de los esfuerzos realizados en años recientes, hay todavía una gran necesidad de nuevos compuestos, bien solos o bien en combinación, lo cual puede ser útil para el tratamiento de aquellas patologías que responden a la activación del receptor PPARγ. Se ha encontrado que la espirolaxina de fórmula (I): 6 3

4 es un agente útil para la preparación de un medicamento para tratar aquellas patologías que responden a la activación del receptor PPARγ. Un objeto de la presente invención es el uso de la espirolaxina de fórmula (I) para la preparación de un medicamento para tratar aquellas patologías que responden a la activación del receptor PPARγ, en el que la patología que responde a la activación de tal receptor es la diabetes mellitus insulinorresistente de Tipo 2. Un objeto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende la espirolaxina de fórmula (I) como principio activo 1 2 en combinación con el ácido retinoico todo en trans de fórmula (II) para el tratamiento de aquellas patologías que responde a la activación del receptor PPARγ, siendo dichas patologías hemopatías malignas agudas. Un objeto adicional de esta invención es la combinación de la espirolaxina de fórmula (I) con el ácido retinoico todo en trans de fórmula (II). Un objeto adicional de esta invención es una composición farmacéutica que comprende la espirolaxina de fórmula (I) como un principio activo, en combinación con el ácido retinoico todo en trans de fórmula (II) y al menos un excipiente y/o vehículo. Un objeto adicional de la invención es el uso de espirolaxina de fórmula (I) en combinación con el ácido retinoico todo en trans de fórmula (II) para la preparación de un medicamento para tratar aquellas patologías que responden a la activación del receptor PPARγ, en el que la patología que responde a la activación de PPARγ es una hemopatía maligna aguda incluida en el grupo que consta de: leucemia linfoide, leucemia mieloide, leucemia monocítica y leucemia megacarioblástica. Un objeto adicional de la invención es el uso de espirolaxina de fórmula (I) en combinación con el ácido retinoico todo en trans de fórmula (II) para la preparación de un medicamento para tratar la leucemia promielocítica aguda. Además, se conoce en el campo de la medicina el uso de los protocolos terapéuticos en los cuales se administran más medicamentos antitumorales bien al mismo tiempo o bien secuencialmente. La necesidad de administrar más medicamentos antitumorales en protocolos terapéuticos se justifica por el hecho de que, actuando a diferentes niveles metabólicos, en algunos casos pueden contribuir a la remisión completa del cáncer, mientras en otros casos pueden ayudar a los pacientes tratados a vivir más y/o mejorar su calidad de vida. La combinación de acuerdo con la presente invención se puede usar conjuntamente con uno o más medicamentos antitumorales para el tratamiento de hemopatías malignas agudas. Por lo tanto, un objeto adicional de la invención es también una combinación farmacéutica que comprende la espirolaxina de fórmula (I) en combinación con el ácido retinoico todo en trans de fórmula (II) combinado con uno o más medicamentos antitumorales conocidos para el tratamiento de hemopatías malignas agudas. Los medicamentos 4

5 antitumorales conocidos mencionados anteriormente se incluyen en el grupo que comprende: agentes alquilantes; inhibidores de topoisomerasa; fármacos antitubulínicos; intercalantes, antimetabolitos, productos naturales tales como alcaloides de vinca, epipodofilotoxinas, antibióticos, enzimas y taxanos. Los datos experimentales se pueden comunicar más adelante para mejor ilustrar la invención. Ejemplo Activación de la PPARγ mediante la espirolaxina (ST 1397) La capacidad de espirolaxina para unir al receptor PPARγ y determinar la activación de aquellos genes, los cuales tienen una secuencia de respuesta a PPAR-γ (PPAR-γ RE) se puso en evidencia a través de algunos experimentos de transfección con un plásmido que expresa el PPARγ y un vector comunicador que codifica un gen para luciferasa, el cual está bajo control de PPAR-γ RE (Cell 68; ; 1992; J. Biol. Chem. 272; ; 1997). La activación de la expresión de la luciferasa se puso en evidencia transfectando los fibroblastos murinos NIH- 3T3 con el plásmido PPARγ y el vector comunicador TK-PPAR-Reluc; la actividad luciferasa se midió después de 24 horas de tratamiento con la espirolaxina a una concentración de nm. La actividad de la espirolaxina se comparó a la actividad de un compuesto conocido usado para el tratamiento de diabetes mellitus insulinorresistente de tipo 2; la troglitazona (TZD), probada a una concentración de µm. Los resultados, ilustrados en la figura 1, muestran que la espirolaxina es más activa que los compuestos antidiabetes mencionados. De hecho, la actividad luciferasa inducida mediante el compuesto de referencia y mediada por el vector comunicador TK-PPAR-Reluc (como un índice de activación del receptor) fue cinco veces más alta que el control, mientras la actividad luciferasa inducida mediante la espirolaxina de acuerdo con la invención fue siete veces mayor que en control. Ejemplo 2 Efecto de la combinación de acuerdo a la invención en la diferenciación de una línea celular de leucemia promielocítica humana (NB4) La actividad pro-diferenciadora de la espirolaxina (ST 1397) y la ATRA, tanto solas como en combinación, se valoró en este modelo experimental. Se sabe bien que todos los ácidos retinoicos en trans llegan a estar activos a concentraciones que varían de 0,1 M y 1 µm; el efecto de pico diferenciador se observa normalmente en el día tercero/cuarto de tratamiento, cuando el crecimiento se detiene significativamente. Las células NB4 se crecieron en matraces de 2 cm 2 a una densidad de aproximadamente células/ml en ml de cultivo RPMI 16 con % de suero fetal de ternera (FCS). Después de un día, las células se trataron con ATRA a una concentración de 7 M o con ST 1397 a dosis de 0,1, 0, y 1 µm, o con volúmenes equivalentes de los dos compuestos en combinación. Después, las células se pusieron dentro del incubador durante 2-3 días sin reemplazar el medio de cultivo. Al final del segundo o tercer día de tratamiento, la diferenciación de las células en granulocitos se midió mediante la reducción de la tinción NBT y el ensayo espectrofotométrico de las muestras. 0 6 El ácido retinoico se disolvió en el medio de cultivo con una disolución 1 mm de DMSO. El control de cultivos se trató con volúmenes equivalentes de DMSO, dado que este compuesto (DMSO) se puede diferenciar en ciertas condiciones experimentales. Para medir el efecto diferenciador, células de cada muestra se han reunido, centrifugado y resuspendido en 1 ml de cultivo RPMI 16 con suero al %, 1 mg/ml de nitroazul de tetrazolio (NBT) y 0 ng de PMA. Las células resuspendidas se incubaron a 37ºC durante - minutos. Al final de la incubación, las células se centrifugaron y el sedimento así obtenido se resuspendió en 1 ml de PBS que contiene tritón X 0. Las muestras se sonicaron para completar lisis y después se leyeron con un espectrofotómetro a una longitud de onda de nm. Los resultados, ilustrados en la figura 2, muestran que la ST1397 no induce diferenciación en células NB4, cuando se administra sola. El efecto diferenciador de ATRA ya era bien conocido, pero se encontró que su efecto se potenció mediante la administración simultánea de ST1397, la cual es inactiva cuando se usa sola, como se mencionó anteriormente.

6 REIVINDICACIONES 1. Uso de la espirolaxina de fórmula (I) 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una patología que responde a la activación del receptor PPARγ, en la que dicha patología es la diabetes mellitus de tipo 2 insulinorresistente. 2. Un medicamento que comprende espirolaxina de fórmula (I) 2 3 y el ácido retinoico todo en trans de fórmula (II) Un medicamento en el cual la espirolaxina de fórmula (I) actúa como un principio activo 6 6

7 en combinación con los ácidos retinoicos todo en trans de fórmula (II) y al menos un excipiente y/o vehículo El uso de la combinación de compuestos de acuerdo con la reivindicación 2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una patología que responde a la activación del receptor PPARγ en el que dicha patología es una hemopatía maligna aguda.. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la hemopatía maligna aguda se selecciona a partir del grupo que consta de: leucemia linfoide, leucemia mieloide, leucemia monocítica y leucemia megacarioblástica. 6. El uso de acuerdo con la reivindicación, en el que la hemopatía maligna es la leucemia promielocítica aguda. 7. El uso de la combinación de acuerdo con la reivindicación 4 en combinación con uno o más medicamentos antitumorales conocidos. 8. El uso de la combinación de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el medicamento antitumoral se selecciona del grupo que consta de: agentes alquilantes, inhibidores de topoisomerasa, fármacos antitubulínicos, intercalantes, antimetabolitos, productos naturales, tales como alcaloides de vinca, epipodofilotoxinas, antibióticos, enzimas y taxanos

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