(ISO :1986) LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:

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1 norma española UNE-EN ICS Junio 1995 TÍTULO Calidad del agua Detección y recuento de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) Parte 1: Método por enriquecimiento en un medio líquido (ISO :1986) Water quality. Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia). Part 1: Method by enrichment in a liquid medium. (ISO :1986) Qualité de l'eau. Recherche et dénombrement des spores de micro-organismes anaérobies sulfitoréducteurs (clostridia). Partie 1: Méthode par enrichissement dans un milieu liquide. (ISO :1986) CORRESPONDENCIA Esta norma UNE es la versión oficial en español de la Norma Europea EN de fecha enero de 1993, que a su vez adopta íntegramente la Norma Internacional ISO :1986. OBSERVACIONES ANTECEDENTES Esta Norma Española ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN 77 Medio Ambiente cuya Secretaría desempeña AENOR. Editada e impresa por AENOR Depósito legal: M 18450:1995 AENOR 1995 Reproducción prohibida LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A: Fernández de la Hoz, 52 Teléfono (91) MADRID-España Telefax (91) Páginas Grupo 9

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3 NORMA EUROPEA EUROPEAN STANDARD NORME EUROPÉENNE EUROPÄISCHE NORM EN Enero 1993 CDU: 628.1/.3:620.1:543.39: Descriptores: Agua, calidad, ensayo de aguas, análisis, microbiológico, microorganismo, bacteria sulfito-reductora, clostridium. Versión en español Calidad del agua Detección y recuento de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) Parte 1: Método por enriquecimiento en un medio líquido (ISO :1986) Water quality. Detection and enumeration of the spores of sulfitereducing anaerobes (clostridia). Part 1: Method by enrichment in a liquid medium. (ISO :1986) Qualité de l'eau. Recherche et dénombrement des spores de microorganismes anaérobies sulfito-réducteurs (clostridia). Partie 1: Méthode par enrichissement dans un milieu liquide. (ISO :1986) Wasserbeschaffenheit. Nachweis und Zählung der Sporen sulfitreduzierender Anaerobier (Clostridien). Teil 1: Flüssigkeitsanreicherung. (ISO :1986) Esta Norma Europea ha sido aprobada por CEN el Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la Norma Europea como norma nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales, pueden obtenerse en la Secretaría Central de CEN, o a través de sus miembros. Esta Norma Europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada a la Secretaría Central, tiene el mismo rango que aquéllas. Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria, Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos, Portugal, Reino Unido, Suecia y Suiza. CEN COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN European Committee for Standardization Comité Européen de Normalisation Europäisches Komitee für Normung SECRETARÍA CENTRAL: Rue de Stassart, 36 B-1050 Bruxelles 1993 Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

4 EN : ANTECEDENTES Esta Norma Europea es la adopción de la Norma ISO La adopción de la Norma ISO fue recomendada por el Comité Técnico CEN/TC 230 Análisis del agua, bajo cuya competencia de ahora en adelante recae esta Norma Europea. Esta Norma Europea deberá recibir el rango de norma nacional, bien por la publicación de un texto idéntico, o bien por ratificación, lo más tarde en julio de 1993, y deberán ser retiradas todas las normas nacionales en contradicción lo más tarde en julio de La norma ha sido adoptada y conforme al reglamento de Régimen Interior de CEN/CENELEC, los países siguientes deben poner esta norma en aplicación: Alemania, Austria, Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos, Portugal, Reino Unido, Suecia y Suiza. DECLARACIÓN El texto de la Norma Internacional ISO :1986 ha sido adoptado por CEN como Norma Europea sin ninguna modificación.

5 - 5 - EN :1993 NORMA INTERNACIONAL ISO :1986 Calidad del agua Detección y recuento de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) Parte 1: Método por enriquecimiento en un medio líquido 0 INTRODUCCIÓN Los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) están ampliamente difundidos en el ambiente. Están presentes en la materia fecal humana y animal, en las aguas residuales y en el suelo. A diferencia de Escherichia coli y de otros organismos coliformes, los esporos sobreviven en el agua durante grandes períodos de tiempo y son más resistentes que los organismos vegetativos en lo que respecta a la acción de los factores químicos y físicos. De ahí que ellos puedan representar una señal de contaminación remota o intermitente. Incluso, dichos microorganismos pueden ofrecer resistencia al cloro a los niveles que normalmente se utilizan en el tratamiento de agua, y por tanto resultan útiles para las necesidades de control. La Norma ISO 6461 está compuesta de las partes siguientes: Parte 1: Método por enriquecimiento en un medio líquido. Parte 2: Método de filtración por membrana. 1 OBJETO Esta parte de la Norma ISO 6461 especifica un método para la detección y el recuento de los esporos de los microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) por enriquecimiento en un medio líquido. 2 CAMPO DE APLICACIÓN Este método es válido para todos los tipos de agua, incluyendo el agua turbia. 3 NORMAS PARA CONSULTA ISO 3696 Agua para uso en laboratorios. Especificaciones. ISO Calidad del agua. Muestreo. Parte 2: Guía general sobre las técnicas de muestreo. ISO Calidad del agua. Muestreo. Parte 3: Guía general para la conservación y manipulación de las muestras. ISO 8199 Calidad del agua. Guía general para el análisis microbiológico mediante la enumeración de microorganismos en un medio de cultivo. 4 DEFINICIÓN Para los fines de esta parte de la Norma ISO 6461, se aplica la definición siguiente: clostridia: Microorganismos anaerobios sulfito-reductores que forman esporos y que pertenecen a la familia de las Bacillaceae y al género Clostridium.

6 EN : PRINCIPIO La detección de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) en un volumen específico de una muestra de agua pasa por las etapas siguientes: 5.1 Selección de los esporos La selección de los esporos presentes en la muestra se realizará mediante la aplicación de calor durante un período de tiempo suficiente para destruir las bacterias vegetativas. 5.2 Cultivo de enriquecimiento Se detectan y recuentan los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores por medio de la inoculación de volúmenes de la muestra en un medio líquido de enriquecimiento, seguida de la incubación a una temperatura de 37 C ± 1 C durante de 44 h ± 4 h en condiciones anaerobias. 6 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 6.1 Materiales básicos Con objeto de mejorar la reproducibilidad de los resultados, se recomienda que, en el momento de la preparación de los diluyentes y los medios de cultivo, se utilicen compuestos básicos deshidratados. Asimismo, también se pueden emplear reactivos comerciales. Deben seguirse rigurosamente las instrucciones del fabricante. Los productos químicos que se utilicen en la preparación de los medios de cultivo y los reactivos deben ser de calidad analítica reconocida. El agua que se emplee debe ser destilada o desionizada y debe estar libre de sustancias que puedan inhibir el desarrollo de los microorganismos durante la realización del ensayo (véase la Norma ISO 3696). Las mediciones del ph se llevarán a cabo con un ph-metro y a una temperatura de 25 C. Si los medios de cultivo preparados no se van a utilizar inmediatamente, deben guardarse en la oscuridad a una temperatura aproximadamente de 4 C por un período de tiempo no mayor de un mes, a menos que se especifique lo contrario. 6.2 Medios de cultivo y diluyente Diluyente. Debe utilizarse uno de los diluyentes que se establecen en la Norma ISO Medio reforzado especial para la clostridia (DRCM) Medio base de concentración simple Composición Carne digerida en la triptona 10 g Extracto de carne 10 g Extracto de levadura 1,5g Almidón 1 g Acetato de sodio dihidratado 5 g Glucosa 1 g Hidrocloruro-L-Cistina 0,5 g Agua ml

7 - 7 - EN :1993 Preparación Se diluye la triptona, el extracto de carne, el acetato de sodio y extracto de levadura en 800 ml de agua. Con los otros 200 ml de agua destilada se prepara una solución de almidón de la manera siguiente: se mezcla el almidón con un poco de agua fría con el fin de formar una pasta. Se calienta el resto de agua hasta el punto de ebullición y se añade lentamente a la pasta, con agitación constante. Posteriormente, se agrega esta solución de almidón a la primera mezcla y se calienta hasta alcanzar su punto de ebullición con el fin de que se disuelva completamente. Finalmente, se agrega la glucosa y el hidrocloruro-l-cistina, y se disuelve toda la mezcla. Se ajusta el ph entre 7,1 y 7,2 con una solución de hidróxido de sodio (1 mol/l). Se transfieren alícuotas de 25 ml del medio a frascos de tapa roscada de 25 ml de capacidad. Se esterilizan dichos frascos en autoclave a una temperatura de 121 C ± 1 C durante 15 min Medio base de concentración doble. Se prepara el medio de concentración doble según se muestra en el apartado pero se reduce el volumen de agua a la mitad. Se transfieren alicuotas de 10 ml y de 50 ml del medio a frascos de tapa roscada de 25 ml y de 100 ml de capacidad respectivamente Sulfito de sodio (Na 2 SO 3 ), solución al 4% (m/m). Se diluyen 4 g de sulfito de sodio anhidro en 100 ml de agua. Se esteriliza la solución por filtración. Se guarda la mezcla a una temperatura comprendida entre los 2 C y los 5 C Citrato de hierro (III) (C 6 H 5 O 7 Fe), solución al 7% (m/m). Se disuelven 7 g de citrato de hierro (III) en 100 ml de agua. Se esteriliza la solución por filtración. Se guarda la mezcla a una temperatura comprendida entre los 2 C y los 5 C. Se aconseja preparar una solución nueva cada 14 días Medio completo El día del análisis, se mezclan volúmenes iguales de las soluciones de sulfito de sodio (véase apartado 6.2.3) y citrato de hierro (III) (véase 6.2.4) Se añaden 0,5 ml de la mezcla (véase ) a cada frasco que contenga el medio de concentración simple (véase ), el cual se habrá calentado y enfriado recientemente Se añaden 0,4 ml de la mezcla (véase ) a cada frasco de 10 ml, y 2 ml a cada frasco de 50 ml, que contenga el medio de concentración doble (véase ), el cual se habrá tratado de manera similar a como se realizó en el apartado anterior. 7 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO Material de laboratorio empleado normalmente en bacteriología y, 7.1 Frascos o matraces de tapa roscada de cristal o boro silicatados, de 200 ml, 100 ml y 25 ml de capacidad.

8 EN : Pipetas volumétricas, de 10 ml y 1 ml de capacidad. 7.3 Baños María, controlados termostáticamente. 7.4 Tubos de ensayo, 150 mm 13 mm. 7.5 Alambre de hierro 7.6 Estufa de cultivo, que se pueda mantener a una temperatura de 37 C ± 1 C. 8 MUESTREO Véanse las Normas ISO e ISO 8199 para las técnicas de muestreo. 9 PROCEDIMIENTO OPERATORIO 9.1 Tratamiento de las muestras Véanse las Normas ISO e ISO 8199 relativas al método a seguir para la conservación y manipulación de las muestras. 9.2 Selección de los esporos (técnica) Antes de la realización del ensayo, la muestra de agua se debe calentar en un baño María a 75 C ± 5 C durante 15 min a partir del momento en que se alcanza la mencionada temperatura. Un frasco similar que contenga el mismo volumen de agua que la muestra de ensayo se debe utilizar periódicamente como medida de control a fin de verificar el tiempo de calentamiento que precisa. La temperatura del agua del frasco de control se puede registrar constantemente con la ayuda de un termómetro. 9.3 Inoculación e incubación Se añaden 50 ml de la muestra (véase apartado 9.2) a un frasco de 100 ml con tapa roscada que contenga 50 ml del medio completo de concentración doble (véase ). Se añaden 10 ml de la muestra (véase 9.2) a una serie de cinco frascos de 25 ml con tapa roscada que contenga 10 ml del medio completo de concentración doble (véase ). Se añade 1 ml de la muestra (véase 9.2) a una serie de cinco frascos de 25 ml con tapa roscada que contenga 25 ml del medio completo de concentración simple (véase ). Si es necesario, se añade 1 ml de una solución 1:10 de la muestra (véase 9.2) a una serie de cinco frascos de 25 ml con tapa roscada que contenga 25 ml del medio completo de concentración simple (véase ). Con objeto de realizar un examen cualitativo de 100 ml de agua potable o embotellada sin llevar a cabo un conteo NMP, se utiliza un matraz de 200 ml lleno con una mezcla de 100 ml del medio completo de concentración doble (véase ) y 100 ml de la muestra (véase 9.2). Si fuera necesario, se llenan todos los frascos con el medio completo de concentración simple (véase ) para así llevar el volumen del líquido hasta el cuello de los frascos y garantizar que exista sólo un pequeño volumen de aire. Posteriormente, se sellan herméticamente los frascos en cuestión o se incuban en condiciones anaerobias.

9 - 9 - EN :1993 Se incuban los frascos que han sido inoculados a una temperatura de 37 C ± 1 C durante 44 h ± 4 h. Los frascos de cristal herméticamente sellados que contengan grandes volúmenes de cultivos pueden estallar debido a la producción de gases. La adición de alambre de hierro, calentado al rojo vivo y colocado dentro del medio de cultivo con anterioridad a la inoculación, puede ayudar a la anaerobiosis. 9.4 Interpretación Los frascos en los que se observe un ennegrecimiento como consecuencia de la reducción del sulfito y la precipitación del sulfuro de hierro (III), se considerarán como positivos. 10 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Expresar los resultados conforme se establece en la Norma ISO INFORME DEL ENSAYO El informe del ensayo debe indicar el método empleado y expresar los resultados obtenidos como el número más probable de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) por volumen de la muestra. También se debe mencionar cualquier detalle del procedimiento operatorio no especificado en esta parte de la Norma ISO 6461 que no se considere como opcional. Así como cualquier otro incidente que pueda haber influido en los resultados del ensayo. El informe del ensayo debe incluir toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra.

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