Parte 2: Método de filtración por membrana (ISO :1986) LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:

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1 norma española UNE-EN ICS Junio 1995 TÍTULO Calidad del agua Detección y recuento de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) Parte 2: Método de filtración por membrana (ISO :1986) Water quality. Detection and enumeration of the spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia). Part 2: Method by membrane filtration. (ISO :1986) Qualité de l'eau. Recherche et dénombrement des spores de micro-organismes anaérobies sulfitoréducteurs (clostridia). Partie 2: Méthode par filtration sur membrane. (ISO :1986) CORRESPONDENCIA Esta norma UNE es la versión oficial en español de la Norma Europea EN de fecha enero de 1993, que a su vez adopta íntegramente la Norma Internacional ISO :1986. OBSERVACIONES ANTECEDENTES Esta Norma Española ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN 77 Medio Ambiente cuya Secretaría desempeña AENOR. Editada e impresa por AENOR Depósito legal: M 18451:1995 AENOR 1995 Reproducción prohibida LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A: Fernández de la Hoz, 52 Teléfono (91) MADRID-España Telefax (91) Páginas Grupo 9

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3 NORMA EUROPEA EUROPEAN STANDARD NORME EUROPÉENNE EUROPÄISCHE NORM EN Enero 1993 CDU: 628.1/.3:620.1:543.39: Descriptores: Agua, calidad, ensayo de aguas, análisis microbiológico, microorganismo, bacteria sulfito-reductora, clostridium, método de filtración. Versión en español Calidad del agua Detección y recuento de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) Parte 2: Método de filtración por membrana (ISO :1986) Water quality. Detection and enumeration of the spores of sulfitereducing anaerobes (clostridia). Part 2: Method by membrane filtration. (ISO :1986) Qualité de l'eau. Recherche et dénombrement des spores de microorganismes anaérobies sulfito-réducteurs (clostridia). Partie 2: Méthode par filtration sur membrane. (ISO :1986) Wasserbeschaffenheit. Nachweis und Zählung der Sporen sulfitreduzierender Anaerobier (Clostridien). Teil 2: Membranfiltrationsverfahren. (ISO :1986) Esta Norma Europea ha sido aprobada por CEN el Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la Norma Europea como norma nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales, pueden obtenerse en la Secretaría Central de CEN, o a través de sus miembros. Esta Norma Europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada a la Secretaría Central, tiene el mismo rango que aquéllas. Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria, Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos, Portugal, Reino Unido, Suecia y Suiza. CEN COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN European Committee for Standardization Comité Européen de Normalisation Europäisches Komitee für Normung SECRETARÍA CENTRAL: Rue de Stassart, 36 B-1050 Bruxelles 1993 Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

4 EN : ANTECEDENTES Esta Norma Europea es la adopción de la Norma ISO La adopción de la Norma ISO fue recomendada por el Comité Técnico CEN/TC 230 Análisis del agua, bajo cuya competencia de ahora en adelante recae esta Norma Europea. Esta Norma Europea deberá recibir el rango de norma nacional, bien por la publicación de un texto idéntico, o bien por ratificación, lo más tarde en julio de 1993, y deberán ser retiradas todas las normas nacionales en contradicción lo más tarde en julio de La norma ha sido adoptada y conforme al reglamento de Régimen Interior de CEN/CENELEC, los países siguientes deben poner esta norma en aplicación: Alemania, Austria, Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos, Portugal, Reino Unido, Suecia y Suiza. DECLARACIÓN El texto de la Norma Internacional ISO :1986 ha sido adoptado por CEN como Norma Europea sin ninguna modificación.

5 - 5 - EN :1993 NORMA INTERNACIONAL ISO :1986 Calidad del agua Detección y recuento de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) Parte 2: Método de filtración por membrana 0 INTRODUCCIÓN Los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores están ampliamente difundidos en el ambiente. Están presentes en el material fecal humano y animal, en las aguas residuales y en el suelo. A diferencia de Escherichia coli y de otros organismos coliformes, los esporos sobreviven en el agua durante grandes períodos de tiempo y son más resistentes que los organismos vegetativos en lo que respecta a la acción de los factores químicos y físicos. De ahí que ellos puedan representar una señal de contaminación remota o intermitente. Incluso, dichos microorganismos pueden ofrecer resistencia al cloro a los niveles que normalmente se utilizan en el tratamiento del agua, y por lo tanto resultan útiles para los propósitos de control. La Norma ISO 6461 está compuesta de las partes siguientes: Parte 1: Método por enriquecimiento en un medio líquido. Parte 2: Método de filtración por membrana. 1 OBJETO Esta parte de la Norma ISO 6461 especifica un método para la detección y recuento de los esporos de los microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) de filtración por membrana. 2 CAMPO DE APLICACIÓN Este método se aplica a todos los tipos de agua, salvo en los casos en los que es probable que una gran cantidad de partículas se vea retenida en la membrana. 3 NORMAS PARA CONSULTA ISO 3696 Agua para uso en laboratorios. Especificaciones. ISO Calidad del agua. Muestreo. Parte 2: Guía general sobre las técnicas de muestreo. ISO Calidad del agua. Muestreo. Parte 3: Guía general sobre la conservación y manipulación de las muestras. ISO 7704 Calidad del agua. Evaluación de las membranas filtrantes que se utilizan en los análisis microbiológicos. ISO 8199 Calidad del agua. Guía general para el análisis microbiológico mediante la enumeración de microorganismos en un medio de cultivo.

6 EN : DEFINICIÓN Para los fines de esta parte de la Norma ISO 6461, se aplica la siguiente definición: clostridia: Microorganismos anaerobios sulfito-reductores que forman esporos y que pertenecen a la familia de los Bacillaceae y al género Clostridium. 5 PRINCIPIO La detección de los esporos de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) en un volumen específico de una muestra de agua pasa por las etapas siguientes: 5.1 Selección de los esporos La selección de los esporos presentes en la muestra se realizará mediante la aplicación de calor durante un período de tiempo suficiente para destruir las bacterias vegetativas. 5.2 Filtración con membrana y cultivo Se filtra la muestra de agua a través de un filtro de membrana, cuyos poros tengan una dimensión tal que retengan los esporos bacterianos (0,2 µm) en el interior o sobre la membrana. Se coloca el filtro de membrana en un medio de cultivo especialmente selectivo (medio agar-sulfito de hierro), seguido de la incubación a una temperatura de 37 C ± 1 C durante 20 h ± 4 h y 44 h ± 4 h, y del recuento de cualquier colonia ennegrecida. 6 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS 6.1 Materiales básicos Con objeto de mejorar la reproducibilidad de los resultados, se recomienda que, en el momento de la preparación de los diluyentes y los medios de cultivo, se utilicen compuestos básicos deshidratados. Asimismo, también se pueden emplear reactivos comerciales. Deben seguirse rigurosamente las instrucciones del fabricante. Los productos químicos que se utilicen en la preparación de los medios de cultivo y los reactivos deben ser de calidad analítica reconocida. El agua que se emplee debe ser destilada o desionizada y debe estar libre de sustancias que puedan inhibir el desarrollo de los microorganismos durante la realización del ensayo (véase la Norma ISO 3696). Las mediciones del ph se llevarán a cabo con un ph-metro y a una temperatura de 25 C. Si los medios de cultivo preparados no se van a utilizar inmediatamente, deben guardarse en la oscuridad a una temperatura aproximadamente de 4 C durante un período no mayor de un mes, a menos que se especifique lo contrario.

7 - 7 - EN : Medio agar-sulfito de hierro Medio base (agar nutritivo) Composición Extracto de carne Peptona Cloruro de sodio (NaCl) Agar Agua 3 g 10 g 5 g 15 g ml Preparación Se calienta hasta disolución total, se completa hasta 1 litro con agua, y se ajusta el ph a 7,6 con solución de hidróxido de sodio (1 mol/l). Se esteriliza la mezcla en autoclave a una temperatura de 121 C ± 1 C durante 20 min. Se guarda el medio en el refrigerador después de que haya solidificado Solución del sulfito de sodio (Na 2 SO 3 ). Se disuelven 10 g de sulfito de sodio en 100 ml de agua. Se aconseja preparar una solución nueva cada 2 semanas Solución de sulfato de hierro (II) (FeSO 4 ). Se disuelven 8 g de cristales de sulfato de hierro (II) en 100 ml de agua Medio completo. Inmediatamente antes de su utilización, se licúa el medio base (véase apartado 6.2.1) y a cada volumen de 18 ml se agrega 1 ml de la solución de sulfito de sodio (véase 6.2.2) y cinco gotas de la solución de sulfato de hierro (II) (véase 6.2.3). Se añade 1 ml de la solución de sulfito de sodio y cinco gotas de la solución de sulfato de hierro (II) a los tubos de agar antes del procedimiento de inoculación e incubación (véase 9.3). 6.3 Medio agar-triptosa-sulfito (medio alternativo de cultivo) Composición Triptosa Peptona de soja Extracto de levadura Metabisulfito de sodio Citrato de hierro(iii) amonio Agua 15 g 5 g 5 g 1 g 1 g ml Preparación Se calienta hasta dilución total y se ajusta el ph a 7,6 ± 1 a una temperatura de 25 C. Se distribuye la mezcla en diferentes tubos de ensayo en volúmenes de 18 ml. Se esteriliza el medio de cultivo durante 15 min a una temperatura de 121 C ± 1 C. Se guarda la solución en el refrigerador a una temperatura entre 4 C y 5 C. Se descartan los medios de cultivo que no hayan sido utilizados después de 2 semanas de su preparación.

8 EN : APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO Material de laboratorio empleado normalmente en bacteriología y, 7.1 Frascos y matraces de cristal (Erlenmeyer, matraz de fondo redondo o cónico), de 2 litros de capacidad. 7.2 Tubos de ensayo, 160 mm 16 mm. 7.3 Pipetas graduadas, de 10 ml de capacidad graduadas con divisiones de 0,1 ml. 7.4 Pipetas volumétricas, de 10 ml de capacidad. 7.5 Frascos, de 1 litro de capacidad. 7.6 Bomba de vacío 7.7 Baño María 7.8 Equipo de filtración por membrana 7.9 Membranas filtrantes estériles, con dimensiones nominales de poro de 0,2 µm. NOTA La calidad de los filtros de membrana puede variar según la marca o incluso de lote en lote. De ahí que sea aconsejable verificar la calidad regularmente conforme la Norma ISO Estufa de cultivo, que se pueda mantener a una temperatura de 37 C ± 1 C Placas Petri 8 MUESTREO Véanse las Normas ISO e ISO 8199 para las técnicas de muestreo. 9 PROCEDIMIENTO 9.1 Tratamiento de las muestras Véanse las Normas ISO e ISO 8199 relativas al método a seguir para la conservación y manipulación de las muestras. 9.2 Selección de los esporos (técnica) Antes de la realización del ensayo, la muestra de agua se debe calentar en un baño María 75 C ± 5 C durante 15 min a partir del momento en que se alcanza la mencionada temperatura. Un frasco similar que contenga el mismo volumen de agua que la muestra de ensayo se debe utilizar periódicamente como medida de control a fin de verificar el tiempo de calentamiento que precisa. La temperatura del agua del frasco de control se puede registrar constantemente con la ayuda de un termómetro.

9 - 9 - EN : Inoculación e incubación Véase la Norma ISO 7704 para la descripción general de la técnica de filtración con membrana. Conforme a las instrucciones de ese documento, se filtra un volumen adecuado de agua. Para el agua potable, de lluvia, de pozo, así como las aguas minerales, marinas o de superficie, cuya contaminación clostridia es menor, se filtran 100 ml. Para aguas altamente contaminadas o para las aguas residuales, se utilizan volúmenes más pequeños, completando con diluyente estéril hasta 100 ml. Se diluyen las muestras de forma tal que se pueda separar y contar fácilmente cualquier colonia ennegrecida resultante. Después de realizada la filtración, se retira la membrana con ayuda de pinzas esterilizadas y se coloca boca abajo en el fondo de una placa Petri de manera que no quede ninguna burbuja de aire debajo del filtro. Posteriormente y con mucho cuidado, se vierten 18 ml del medio completo de cultivo licuado, el cual se ha enfriado previamente hasta lograr una temperatura de alrededor de 50 C, sobre la membrana, la cual aún no se ha dejado de sostener con las pinzas esterilizadas. Después que esta capa del medio cultivo haya asentado, se hace incubar la membrana anaeróbicamente o bajo otras condiciones que garanticen la anaerobiosis a una temperatura de 37 C ± 1 C durante 20 h ± 4 h y 44 h ± 4 h. Si se utilizara un frasco o una cámara de anaerobios, el filtro de membrana se puede colocar en la superficie del agar boca arriba. 9.4 Interpretación Se cuentan todas las colonias ennegrecidas que aparecen después de la incubación durante 20 h ± 4 h y 44 h ± 4 h. 10 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS Se expresan los resultados conforme a la Norma ISO INFORME DE ENSAYO El informe del ensayo debe indicar el método empleado y expresar los resultados como el número más probable de microorganismos anaerobios sulfito-reductores (clostridia) por volumen de la muestra. El recuento después de 44 h ± 4 h se debe indicar habitualmente. Si esto no es posible, el recuento después de 20 h ± 4 h se indicará únicamente como valor aproximado. El informe del ensayo también mencionará cualquier detalle operativo que no se especifique en esta parte de la Norma ISO 6461 o que se considere como opcional, así como cualquier otro incidente que pueda haber influido en los resultados del ensayo. El informe del ensayo debe incluir toda la información necesaria para la completa identificación de la muestra.

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