19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: 2 2 723 1 Int. Cl. 7 : A61K 9/2 A01N 1/02 A61K 3/2 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud: 98122633. 86 Fecha de presentación: 27.11.1998 87 Número de presentación de la solicitud: 092241 87 Fecha de publicación de la solicitud: 16.06.1999 4 Título: Microcápsulas que contienen material seminal para la inseminación artificial de cerdos. Prioridad: 28.11.1997 IT MI97262 73 Titular/es: LA CORTE DE MONACI S.A.S. di Zanotti Adelino & C. Piazzetta Caduti Sul Lavoro, 2 Crema, Cr, IT 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: 01.04.04 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: 01.04.04 72 Inventor/es: Conte, Ubaldo; Torre, María Luisa Marina; Maggi, Lauretta; Giunchedi, Paolo; Vigo, Daniele; Maffeo, Giovanni y Russo, Vincenzo 74 Agente: Sanz-Bermell Martínez, Alejandro ES 2 2 723 T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 28036 Madrid
ES 2 2 723 T3 DESCRIPCIÓN Microcápsulas que contienen material seminal para la inseminación artificial de cerdos. Alcance de la invención La presente invención se refiere a unas microcápsulas que contienen material seminal porcino, que pueden ser utilizadas para la inseminación artificial en los cerdos, así como el proceso correspondiente de elaboración. 1 2 3 4 0 6 Dichas cápsulas permiten una liberación prolongada y controlada del material seminal y además protegen el material contra su degradación, permitiendo de este modo la simplificación del procedimiento de inseminación artificial y un aumento de la fertilidad de las cerdas. Estado de la técnica En las últimas décadas, la inseminación artificial (I.A.) se ha extendido de forma considerable entre ganaderos y ha permitido realizar la inseminación en base a datos fisiológicos exactos que posibilitan intervenciones con considerable precisión y grandes probabilidades de éxito. Esta técnica implica casi exclusivamente el uso de semen fresco y/o refrigerado, cuya elaboración se realiza en los centros I.A. de explotaciones de ganado, junto con el uso de material seminal procedente de suministros externos. Numerosas técnicas han sido desarrolladas con el fin de mejorar la probabilidad de éxito de la inseminación artificial, sobre todo en el sector del ganado para la producción láctea. En algunas especies domésticas, la técnica de congelar material seminal fresco ha conducido a una estandarización de los métodos de conservación y buenas probabilidades de éxito de la inseminación artificial (por ejemplo, en el ganado). Entre los métodos utilizados para mejorar la posibilidad de la fertilización en el ganado, se recordará que Nebel, ya hace 1 años, intentó realizar una serie de modificaciones de inseminación artificial en el ganado utilizando material micro-encapsulado en lugar de material seminal fresco (ver R.L. Nebel et al, J. Anim. Sci.,, 1631 (198); R.L. Nebel et al, Reprod. Fértil. Deb.,, 701 (1993)) y adoptando una técnica que trataba del uso de alginatos y poliaminas (poli-l-lisina, sulfato de protamina, amina de polivinilo) para obtener microcápsulas compuestas por membranas semipermeables. Dicho procedimiento constaba de tres pasos: 1) formación de una matriz de alginato cálcico que contenía el material seminal; 2) formación de la membrana semipermeable mediante la reticulación superficial de la matriz con poliaminas; 3) disolución del núcleo de matriz de alginato cálcico por sustitución del calcio con sodio. Con este procedimiento, el material seminal fue inmovilizado inicialmente en la matriz de alginato cálcico y suspendido posteriormente en alginato sódico. Esta técnica de protección de material seminal bovino tuvo bastante éxito en cuanto dicho material es especialmente estable y soporta los tratamientos de micro-encapsulamiento sin una pérdida excesiva de energía. Por otra parte, la inseminación artificial (I.A.) es especialmente problemática en los cerdos en cuanto la técnica de congelación, que ha significado una buena estandarización de los métodos de conservación en otras especies domésticas, es prácticamente inaplicable con el material seminal porcino, puesto que existen considerables diferencias de eficacia en la conservación utilizando el proceso de congelación. Los resultados obtenidos experimentalmente con semen congelado han permitido demostrar una excesiva variabilidad de parámetros, como la fertilidad y prolificidad. En concreto, la reducción de los porcentajes de prolificidad y fertilidad ha sido identificada en una ralentización y /o incapacidad del crecimiento del embrión durante los primeros 4- días de vida (ver F. Cairoli et al. Selezion Veterinaria, 32 (1 b) 297 (1991)). Además las cerdas presentan una duración del estro que varía entre y 48 horas, con una dinámica folicular y ovulatoria influenciada por varios factores, tanto de tipo endógeno como exógeno. Por este motivo, los técnicos suelen realizar una intervención I.A. doble a fin de garantizar la presencia a nivel tubario, de una alta concentración de espermatozoides con elevada capacidad de fertilización. Evidentemente, la técnica de intervención doble representa un inconveniente considerable, tanto por la necesidad de recurrir a operadores especializados como el elevado consumo de material seminal. La reducción de la capacidad de fertilización de los espermatozoides es probablemente una de las causas que limitan la prolificidad. Se detecta además una alta incidencia de la pérdida de capacidad de fertilización a raíz de los aspectos problemáticos de los procesos de conservación de material seminal referidos anteriormente. De hecho, mientras en otras especies domésticas la técnica de congelación ha significado una estandarización de los procedimientos de conservación, esta técnica todavía no ha tenido resultados satisfactorios con los cerdos. Además, a fin de mejorar la productividad en los cerdos, existe por parte de los operadores la demanda cada vez más urgente de una solución que les permita realizar una sola intervención de I.A. para reducir los costes operativos. 2
ES 2 2 723 T3 Resumen de la intervención 1 2 3 4 0 6 Ahora hemos encontrado inesperadamente que es posible producir microcápsulas que contienen material seminal activo. Por consiguiente, la presente invención se relaciona con microcápsulas compuestas por: a) un núcleo líquido que contiene una suspensión de material seminal porcino y un polímero biodegradable y/o biocompatible; b) una película compuesta por un alginato posiblemente entrecruzado de un metal bivalente o trivalente, posiblemente reticulado. Con este tipo de preparaciones es posible tanto superar las desventajas asociadas con la estabilidad limitada del material seminal como permitir el uso de una operación única de inseminación artificial, consiguiendo de este modo considerables ventajas económicas gracias a la drástica reducción en la intervención del operador y al uso de una cantidad reducida de material seminal. Además, el material seminal queda debidamente protegido y se libera de la formulación que constituye el objeto de la presente patente durante un tiempo prolongado. Hay que destacar además que otra complicación más de la fertilización en las cerdas se asocia con los periodos y modalidades de ovulación típicos de esta especie. De hecho, el periodo fértil es muy corto y puede variar de forma estacional, como ya hemos indicado. Por este motivo, una única intervención de fertilización con material seminal diluido y refrigerado no proporciona actualmente suficientes garantías de éxito para una completa fertilización de las células ovulares. Ahora hemos detectado y demostrado experimentalmente que, con el micro- encapsulamiento de material seminal porcino, en la que no se espera ningún tipo de reacción dentro del núcleo que contiene el material seminal, es posible proteger el semen porcino, caracterizado éste por su elevada inestabilidad. Por consiguiente, logramos el encapsulamiento del semen porcino en el polímero biocompatible y biodegradable indicado, que permite una liberación prolongada y controlada del material seminal activo. De este modo, es posible mantener elevadas concentraciones de espermatozoides en el útero durante toda la duración del estro, y por consiguiente conseguir un aumento de la fertilidad y prolificidad. Además, el uso de material seminal porcino micro-encapsulado permite realizar una única operación de inseminación artificial, ya que los espermatozoides activos se liberan en un intervalo de tiempo que abarca toda la duración del estro de la cerda. La presente invención se relaciona además con una nueva técnica de elaboración de las microcápsulas de acuerdo con la presente invención, que se compone concretamente de los siguientes pasos: 1. El material seminal porcino se suspende en una cantidad adecuada de solución, que se suele denominar diluidor, generalmente compuesta de una solución acuosa que contiene: glucosa en una concentración de entre 0, y %, bicarbonato sódico en una concentración de entre 0,02 y 4,0%, cloruro potásico en una concentración de entre 0,01 y 3,0%, penicilina en una concentración de entre 2 U.l/l y U.l./l., estreptomicina en una concentración de entre 0,01 y 2,0%, u otro antibiótico normalmente utilizado a este efecto en concentraciones adecuadas, de forma que se obtenga una concentración de espermatozoides de entre 1 x 4 y x células/ ml. 2. Se añade a la suspensión obtenida en la fase (1) el polímero biocompatible y/o biodegradable y a continuación una solución acuosa de haluros de metales bivalentes, tales como sales de calcio, estroncio, cinc o haluros de metales trivalentes, como aluminio, hierro, cromo, etc.. 3. La suspensión obtenida del paso (2) se añade, gota a gota, a una solución de alginato sódico, manteniendo la temperatura del sistema entero entre ºC y 4ºC y se obtienen microcápsulas de un tipo gelatinoso, posteriormente dispersadas en el diluidor de semen porcino anteriormente descrito; 4. Una posibilidad es que las microcápsulas obtenidas en el paso anterior sean reticuladas por suspensión en una solución acuosa de un agente entrecruzado de tipo poliamina, que se mantiene agitada, para conseguir unas microcápsulas rígidas. Descripción detallada de la invención Por consiguiente, las microcápsulas de acuerdo con la presente invención pueden ser de tipo gelatinoso o de tipo rígido, según si la película exterior compuesta por una alginato de un metal bivalente o trivalente se ha sometido a entrecruzamiento o no. Las microcápsulas de tipo gelatinoso constan de un núcleo líquido que contiene la suspensión de material seminal y un polímero biodegradable, y una película gelatinosa bio-erosionable de un alginato no-entrecruzado. El material biodegradable y/o biocompatible polimérico según la presente invención contenido en el núcleo líquido de las microcápsulas que constituyen el objeto de la presente invención se elige preferentemente entre el grupo compuesto por glucanos, escleroglucanos, mánanos, galactomananos, gelanos, carrageninas, chitosanos, pectinas, xantanos, polanhídridos, ácidos poliamínicos, poli-éteres (metílico, vinílico /anhídrido maleico) celulosa carboximetílica y derivados, celulosa carboximetil sódica, alcoholes polivinílicos, celulosa hidroxipropílica de un peso molecular medio 3
ES 2 2 723 T3 de entre 2,000 y 4,000,000 pero preferentemente de entre,000 y 2,000,000, hidroxipropil metilcelulosa, polímeros de carboxivinilo, ácido algínico y derivados del mismo, alcoholes polivinílicos, etilcelulosa, metilcelulosa y derivados de celulosa en general, almidones, derivados de almidón, así como ciclodextrinas alfa, beta, gama y derivados de dextrina en general. Existen en el mercado distintos tipos de todos los polímeros indicados caracterizados por sus diferentes propiedades físico-químicas de solubilidad y gelación. Dichos polímeros suelen estar presentes en concentraciones de entre 1,0 y 90% del peso total de la microcápsula, pero preferentemente entre el y el 80%. 1 2 3 4 0 6 Preferentemente se utiliza hidroxipropil metilcelulosa, con distintos pesos moleculares, en general de entre 00 y 4,000,000 daltones, y preferentemente entre,000 y 1,00,000 y un distinto grado de sustitución de metoxilo, en general entre 1 y %, y un grado de sustitución de hidroxipropoxilo de entre 4 y % como polímero biodegradable y/o biocompatible para el núcleo líquido de las microcápsulas según la presente invención. Por consiguiente, este polímero presenta una naturaleza predominantemente erosionable o gelificable, de acuerdo con la viscosidad y el grado de sustitución en la cadena polimérica. De acuerdo con una solución específicamente preferente, se utiliza la hidroxipropil metilcelulosa disponible en el mercado bajo la marca registrada METHOCEL E 0 con un peso molecular de 22,000 y un grado de sustitución de metoxilo de 29 y sustitución de hidroxipropoxilo de 8,. Los alginatos de los metales bivalentes que forman las microcápsulas que constituyen el objeto de la presente invención son generalmente los de calcio, estroncio y cinc. Los alginatos de los metales trivalentes son, por ejemplo, los de aluminio, hierro y cromo. Preferentemente, la película de las microcápsulas de acuerdo con la presente invención consta de alginato cálcico o alginato de cinc. Los alginatos que constituyen la película de las microcápsulas de acuerdo con la presente invención suelen presentar, al 2% en solución acuosa, una viscosidad de entre 0 cps y,000 cps a una temperatura de 2ºC. Las cápsulas obtenidas se suelen caracterizar por tener unas dimensiones de entre 0 micra y 8 mm, preferentemente entre 0 micra y,0 mm, lo que permite su fácil manipulación, transporte y conservación, así como el uso de catéteres normales para la inseminación artificial. En el paso (1) del proceso de acuerdo con la presente invención, el diluidor del material seminal de cerdos contiene glucosa en una concentración de preferentemente entre 1, y % por peso, bicarbonato sódico en una concentración de entre 0,0 y 0,8%, cloruro potásico en una concentración preferentemente entre 0,01 y 0,%, penicilina en una concentración preferentemente entre 4 U.l/l y 8 U.l/l., estreptomicina en una concentración de entre 0,04 y 0,90% p.p. u otro antibiótico en concentraciones adecuadas, con el propósito de obtener una concentración de entre 2 x y x 8 células/ml. En el paso (2) del proceso que constituye el objeto de la presente invención, los haluros de los metales bivalentes preferentemente utilizados son cloruro de calcio o cloruro de cinc, utilizados en una solución acuosa en una concentración de entre 0,001 M y 2, M, pero preferentemente entre 0,01 y 1,0 M. El paso (3) se lleva a cabo preferentemente a una temperatura de entre y 2ºC y la suspensión se extrusiona por agujas hipodérmicas de dimensiones y abertura adecuadas mediante una bomba peristáltica, a una velocidad que produce aproximadamente gotas por minuto. Conforme los iones metálicos se difunden hacia la superficie exterior, concretamente, de la gota, reaccionan con el alginato para formar una película de alginato de un metal de tierra alcalina (por ejemplo, alginato cálcico) que permite obtener unas microcápsulas suficientemente rígidas. Estas se lavan varias veces, preferentemente con una solución fisiológica, o preferentemente con el diluidor. Estas microcápsulas de un tipo gelatinoso pueden constituir ellas mismas, sin someterse a tratamientos posteriores, un primer tipo de material utilizable para I.A.. En el paso (4) las cápsulas de tipo gelatinoso preparadas del modo descrito pueden someterse a entrecruzamiento por la polimerización de interfaz del alginato. Este procedimiento consigue la conversión de la membrana gelatinosa en una membrana rígida semi-permeable de entrecruzamiento de alginato con un agente entrecruzado del tipo de poliamina. Preferentemente dichos agentes de entrecruzamiento se seleccionan de: sulfato o fosfato de protamina preferentemente en forma de una solución acuosa en concentraciones de entre 0,1 y,0% peso/volumen, incluso más preferentemente sulfato de protamina en una concentración de entre 0, y 3,0% p/v, bromohidrato de polilisina de un peso molecular de entre 00 y 800,000 en una solución acuosa a una concentración preferentemente de entre 0,01 y,0% p/v, incluso más preferentemente de entre 0,03 y 3,0% p/v y amina polivinílica en una concentración de entre 0,001 y,0% p/v, incluso más preferentemente de entre 0,01 y 1,0% p/v. El paso (4) se realiza preferentemente de acuerdo con el siguiente procedimiento operativo: Velocidad de agitación: -0 rpm 4
ES 2 2 723 T3 Tiempos de reacción: 2-180 min. 1 2 Las cápsulas obtenidas, que pueden ser clasificadas como de tipo rígido se filtran y respectivamente se lavan y se suspenden en el mismo diluidor para semen porcino anteriormente descrito. Se incluyen los siguientes ejemplos como ilustraciones de la preparación de las cápsulas que constituyen el objeto de la presente invención. Ejemplo 1 Elaboración de las cápsulas (TIPO GELATINOSO) Se añade hidroxipropil metilcelulosa (Methocel E0 Premium EP) (4% p/v) y cloruro cálcico (0,3 M) a una suspensión de material seminal de un cerdo semental Large white con una concentración de 26 x 6 células/ml (motilidad 90%, integridad acrosomal superior al 90%) y la suspensión resultante, a la que se añade el material polimérico, se añade a su vez a una solución acuosa de alginato sódico (0,% p/v) mientras se agita suavemente ( rpm). Las gotas se producen mediante extrusión por agujas hipodérmicas (2G x /8 ) empleando una bomba peristáltica (Esapump, Advanced Products, Milano, Italia) a una velocidad que produce aproximadamente gotas por minuto. Conforme los iones metálicos se difunden hacia la superficie exterior de la gota, reaccionan con el alginato para formar una película de alginato cálcico. Las cápsulas obtenidas de este modo se filtran, se lavan tres veces y se suspenden en una solución fisiológica y se suspenden en un diluidor para semen porcino compuesto de una solución acuosa que contiene 2,9% de glucosa, 0,2% bicarbonato sódico, 0,03% de cloruro potásico, 6 U.l./. de penicilina y 0,1% de estreptomicina. Las cápsulas constan de un núcleo líquido que contiene la suspensión de material seminal y metilcelulosa hidroxipropílico y una membrana gelatinosa bio- erosionable. Dichas cápsulas (TIPO GELATINOSO) pueden constituir un primer tipo de material utilizable para I.A.. En relación con la preparación obtenida en el Ejemplo 1, la Tabla I proporciona los resultados de las determinaciones del tiempo de supervivencia del material seminal, integridad acrosomal y motilidad; los últimos dos parámetros se expresan en porcentajes. Ejemplo 2 3 Preparación de las cápsulas (TIPO RÍGIDO) Las cápsulas de TIPO GELATINOSO, elaboradas del modo descrito en el Ejemplo 1, comenzando a partir de una suspensión de material seminal (26 x 6 células /ml) se suspenden en una solución acuosa de sulfato de protamina (1% p/v), se mantiene agitado ( rpm) durante min. Mediante este procedimiento se obtiene la polimerización de interfaz del alginato cálcico y se preparan cápsulas de TIPO RÍGIDO. Este procedimiento determina la conversión de la membrana gelatinosa en una membrana rígida semi-permeable de alginato entrecruzado con protamina. Las cápsulas se filtran, se lavan tres veces con solución fisiológica y se suspenden en diluidor para semen porcino. Los resultados de los controles realizados se presentan en la Tabla I. 4 Ejemplo 3 Preparación de cápsulas (TIPO RÍGIDO) 0 Se utiliza el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 con la única diferencia que se emplea una suspensión de material seminal con una concentración de 2 x 6 células /ml. Los resultados de los controles realizados son presentados en la Tabla I. TABLA I Código Tiempo de supervivencia Integridad acrosomal (%) Motilidad (%) Material espermático fresco 96,0 90,0,0 Ejemplo 1 72,0 3,0,0 Ejemplo 2 96,0 68,0,0 6 Ejemplo 3 48,0,0,0
ES 2 2 723 T3 De los resultados indicados en la Tabla I, es evidente que la preparación descrita en el Ejemplo 2 presenta un tiempo de supervivencia del material seminal idéntico al del material espermático fresco, una integridad acrosomal de 7%, en comparación con el material seminal fresco, y una buena motilidad en comparación con las otras preparaciones. 1 2 3 4 0 6 6
ES 2 2 723 T3 REIVINDICACIONES 1 2 3 4 0 6 1. Microcápsulas compuestas por: a) un núcleo líquido que contiene una suspensión de material seminal porcino y un polímero biodegradable y/o biocompatible; b) una película compuesta por un alginato posiblemente entrecruzado de un metal bivalente o trivalente. 2. Microcápsulas de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizadas porque son gelatinosas y la película de alginato no es entrecruzado y es bio-erosionable. 3. Microcápsulas de acuerdo con la reivindicación 1 de un tipo rígido, caracterizadas porque la película de alginato es entrecruzado. 4. Microcápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizadas porque el polímero biodegradable y/o biocompatible se elige del grupo compuesto por glucanos, escleroglucanos, mananos, galactomananos, gelanos, carrageninas, chitosanos, pectinas, xantanos, polanhídridos, ácidos poliamínicos, poli- éteres (metílico/vinílico/anhídrido maleico) celulosa carboximetílica y derivados, celulosa carboximetil sódica, alcoholes polivinílicos, celulosa hidroxipropílica de un peso molecular medio de entre 2,000 y 4,000,000, hidroxipropil metilcelulosa, polímeros de carboxivinilo, ácido algínico y derivados del mismo, alcoholes polivinílicos, etilcelulosa, metilcelulosa y derivados de celulosa en general, almidones, derivados de almidón, así como ciclodextrinas alfa, beta, gama y derivados de dextrina.. Microcápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-, caracterizadas porque dicho polímero biodegradable se elige del grupo compuesto por celulosa hidroxipropílica con un peso molecular medio entre,000 y 2,000,000. 6. Microcápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizadas porque se utiliza hidroxipropil metilcelulosa de un peso molecular entre,000 y 1,00,000 y un grado de sustitución metoxílica entre 1 y % y un grado de sustitución con hidroxipropoxilo de entre 4 y % como polímero biodegradable y/o biocompatible. 7. Microcápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizadas porque dichos polímeros biodegradables y/o biocompatibles están presentes en concentraciones entre 1,0 y 90% del peso total de la microcápsula. 8. Composiciones de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizadas porque dichos polímeros biodegradables están presentes en concentraciones entre y 80% del peso total de la microcápsula. 9. Microcápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizadas porque la película de alginato de un metal bivalente se selecciona de alginato de calcio, estroncio y cinc; los alginatos de los metales trivalentes se seleccionan de los de aluminio, hierro y cromo.. Microcápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizadas porque la película consta de alginato de calcio o de cinc. 11. Microcápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-, caracterizadas porque presentan, en soluciones acuosas al 2%, una viscosidad de entre 0 cps y,000 cps a una temperatura de 2ºC. 12. Cápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizadas porque tienen dimensiones de entre 0 micra y 8 mm. 13. Microcápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizadas porque tienen dimensiones entre 0 micra y,0 mm. 14. Proceso para preparar las microcápsulas según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, compuesto por los siguientes pasos: 1. El material seminal porcino se suspende en una cantidad adecuada de solución, compuesta por una solución acuosa que contiene: glucosa en una concentración entre 0, y %, bicarbonato sódico en una concentración entre 0,02 y 4,0%, cloruro potásico en una concentración entre 0,01 y 3,0%, penicilina en una concentración entre 2 U.l./l y U.I./L, estreptomicina en una concentración entre 0,01 y 2,0%, u otros antibióticos normalmente utilizados a este efecto en concentraciones adecuadas, para obtener una concentración de espermatozoides entre 1 x 4 y x células/ml; 2) el polímero biocompatible y/o biodegradable y, a continuación, una solución acuosa de haluros de metales bivalentes o haluros de metales trivalentes se añaden a la suspensión obtenida en el paso (1); 3) la suspensión resultante del paso (2) se añade, gota a gota, a una solución de alginato sódico, manteniendo la temperatura del sistema entero entre ºC y 4ºC, para obtener microcápsulas de tipo gelatinoso, que se dispersan posteriormente en el diluidor para semen porcino descrito anteriormente; 4) las microcápsulas obtenidas en el paso anterior posiblemente pueden ser reticuladas mediante una suspensión en una solución acuosa de un agente entrecruzado de un tipo poliamínico, que se mantiene agitada, para formar unas microcápsulas rígidas. 7
ES 2 2 723 T3 1 2 1. Proceso de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque en el paso (1), el diluidor para material seminal porcino contiene glucosa en una concentración de entre 1, y % peso, bicarbonato sódico en una concentración de entre 0,0 y 0,8%, cloruro potásico en una concentración preferentemente de entre 0,01 y 0,%, penicilina en una concentración preferentemente entre 4 U.I./l. y 8 U.I./l., estreptomicina en una concentración entre 0,04 y 0,90% peso, con el objeto de obtener una concentración de entre 2 x y x 8 células/ml. 16. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 y 1, caracterizado porque en el paso (2), los haluros de metales bivalentes son cloruro cálcico o cloruro de cinc, utilizados en una solución acuosa en una concentración de entre 0,001 M y 2, M. 17. Proceso de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque la concentración de cloruro de calcio y el cloruro de cinc es entre 0,01 y 1,0 M. 18. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el paso (3) se realiza a una temperatura de entre y 2ºC, y la suspensión se extrusiona entre agujas hipodérmicas de unas dimensiones y abertura adecuadas. 19. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-18, caracterizado porque en el paso (4) el agente de entrecruzamiento se selecciona de sulfato o fosfato de protamina, preferentemente en forma de una solución acuosa en concentraciones de entre 0,1 y,0% p/v, bromohidrato de polilisina de peso molecular entre 00 y 800,000 en una solución acuosa a una concentración de entre 0,001 y,0% p/v y amina polivinílica en una concentración entre 0,001 y,0% p/v.. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-19, caracterizado porque en el paso (4), el agente de entrecruzamiento se selecciona de sulfato o fosfato de protamina en forma de una solución acuosa en concentraciones entre 0, y 3,0% p/v, bromohidrato poli l-lisina de peso molecular entre 00 y 800,000 en una solución acuosa a una concentración de entre 0,03 y 3,0 p/v, y amina polivinílica en una concentración de entre 0,01 y 1,0% p/v. 21. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-, caracterizado porque se realiza durante un tiempo entre 2 min. y 180 min. 22. Microcápsulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para la inseminación artificial de cerdos. 3 4 0 6 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7--1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 8