C5-Aplcacones en medcna 1 5. APLCACONES EN MEDCNA 5.1 Radacón láser sobre el tejdo vvo. Las característcas prncpales de la luz láser (coherente y monocromátca) permten enfocar el haz emtdo por estos sstemas de manera muy precsa y a dmensones muy pequeñas. El poder concentrar una gran cantdad de energía en una pequeña regón en el espaco es de suma mportanca para aplcacones qurúrgcas, ya que, entre otras cosas, permte realzar cortes con gran precsón. Los tpos de sstemas láser que tenen aplcacones médcas varían de acuerdo a la aplcacón en partcular. Es necesaro determnar, por ejemplo, de acuerdo al problema a tratar, cual es la longtud de onda más adecuada así como la potenca requerda. Fundamentalmente, estos parámetros y la nteraccón de la luz con los organsmos vvos a tratar determnan la utldad de un sstema láser para aplcacones médcas y de análss clínco. 5.1.1 nteraccones entre la luz y el tejdo. Procesos báscos que causan atenuacón y ocurren durante la nteraccón de un haz de luz con una muestra de materal: Reflexón: dependendo del tpo de superfce (suave o rugosa) puede ser smlar a la reflexón de un espejo o dfusa. Absorcón: por lo general se debe a agentes de color dentro de la muestra (cromóforos) y generalmente, la luz absorbda se transforma en calor. Esparcmento (scatterng): la trayectora del haz se dvde en dstntas dreccones; es obva, por ejemplo, cuando el haz de luz pasa a través de humo o nebla. Todos estos procesos son altamente dependentes de la longtud de onda del haz de luz ncdente. El tejdo bológco atenúa la luz por los msmos procesos: se presenta reflexón del haz en la superfce del tejdo (e.g., la pel), y hay además un efecto dspersvo grande dentro del tejdo. La absorcón, que es altamente dependente de la longtud de onda, se presenta debdo a agentes cromóforos como el agua, hemoglobna y melanna. Agua: absorcón alta en el UV y en partes del espectro R, transmsón alta en el vsble. Hemoglobna: absorcón en el UV y en la parte azul-verde del espectro (λ<0.6 µm); no absorbe en el rojo. Melanna: varía dependendo del tpo; el pgmento de melanna en la pel absorbe en las partes vsble y NR del espectro. En general, la nteraccón entre la luz y el tejdo puede ser de dos tpos: térmca y notérmca. Esta últma es la que se genera por medo de otros agentes que se sumnstran al tejdo para analzarlo o para realzar algún tpo de tratamento (e.g., terapa fotodnámca). Exste tambén el proceso de foto-ablacón, en el que el tejdo se expone a un haz enfocado provenente de un láser de excímero producéndose un corte lmpo del tejdo. Este proceso se produce por una nteraccón en la que aparentemente no se genera calor, en prncpo, debdo a la alta energía que contenen los fotones a esta
C5-Aplcacones en medcna 2 longtud de onda (UV). Sn embargo, este efecto ha sdo observado tambén con otros tpos de láser (CO 2 y Er:YAG). nteraccón térmca: se genera debdo a la absorcón de luz en el tejdo; este ntercambo de energía se manfesta en forma de calor, causando un ncremento en la temperatura. Los efectos mportantes orgnados por este tpo de nteraccón son la coagulacón, el daño térmco (quemaduras) y la vaporzacón del tejdo. La descrpcón teórca de este tpo de nteraccón, por ejemplo, las varacones de la temperatura del tejdo en funcón del tempo (T(t)), se basa en las teorías desarrolladas para la cenca de materales (transferenca de calor). Para temperaturas menores a los 40 C, generalmente se observan efectos que no son dañnos. Al aumentar la temperatura a un rango mayor y mantenerla por un tempo largo se pueden presentar daños en las células. Para temperaturas mayores a los 100 C el agua comenza a evaporarse y s esta se evapora por completo la temperatura sgue elevándose hasta la temperatura de ablacón (T A ), a la cual los otros componentes del tejdo se comenzan a evaporar. Este proceso es el que se sgue para remover tejdo. En la crugía láser, el haz se enfoca en un punto muy pequeño y s la densdad de potenca es lo sufcentemente grande, la temperatura se eleva hasta un valor mayor al de T A. En toda la regón cercana al punto de exposcón se genera un gradente de temperatura, localzándose el máxmo en la regón central de exposcón, mentras que en las regones vecnas comenza a decrecer. En la regón central se forma un agujero y se remueve el tejdo, mentras que la varacón de temperaturas en las regones vecnas genera dstntos efectos como daño térmco al tejdo y coagulacón. Para entender los efectos que ocurren durante la nteraccón de un haz de luz láser con el tejdo, es convenente revsar que pasa cuando un haz de luz de este tpo nteractúa con un materal de manera general. Transmsón de luz láser a través de materales Cuando un haz de luz colmado pasa a través de una muestra de materal, úncamente una fraccón de la energía se transmte. El resto se perde por tres procesos fundamentales: reflexón, absorcón y esparcmento (scatterng). Conocendo la ntensdad o rradanca del haz y por conservacón de energía podemos establecer que: = + + + (1) r s a t en donde se desprecan reflexones en la segunda superfce del materal. Reflexón: Puede caracterzarse por un coefcente que es funcón del índce de refraccón del materal. Puede demostrarse que para una ncdenca normal a la superfce del
C5-Aplcacones en medcna 3 materal con índce de refraccón n, y consderando que el haz no es absorbdo por el materal, la reflectanca está dada por: R = r = 2 ( n 1) ( n + 1) 2 (2) Absorcón: El proceso de absorcón puede presentarse de dferentes maneras ncluyendo transcones electróncas y vbracones moleculares. En la gran mayoría de los casos, la atenuacón del haz debda a la absorcón se expresa en térmnos de la ley de Beer- Lambert: [ αx] ( x) = (0) Exp (3) El factor α (undades de L -1 ) se conoce como coefcente de absorcón y es característco para cada materal. Un par de cantdades mportantes dervadas de esta expresón son la profunddad de penetracón (longtud a la cual se obtene un terco de la ntensdad de entrada) y la longtud de extncón (longtud a la cual se obtene el 1% de la ntensdad a la entrada). En general, el coefcente de absorcón, y por lo tanto las longtudes antes menconadas, son dependentes de la longtud de onda. Dspersón: se relacona con el cambo de dreccón que sufre alguna fraccón del rayo; esta fraccón eventualmente se absorbe o se escapa de la muestra. Puede
C5-Aplcacones en medcna 4 dvdrse en dspersón de superfce (superfces rugosas sn pulr) y dspersón del grueso del materal (defectos en la muestra como fracturas o mpurezas). La atenuacón de un haz de luz por dspersón puede aproxmarse con la fórmula: ( x) = (0) Exp βx (3) [ ] en donde β es el coefcente de dspersón del materal. S hay atenuacón por absorcón y por dspersón podemos escrbr: [ ( α + β ) x] = (0 Exp[ γx] ( x) = (0) Exp ) (4) A partr de la ecuacón (1) podemos defnr los sguentes parámetros: t t = = 1 r r a a s s de donde pueden reconocerse: r a s r reflectanca absorbanca razón de dspersón + a + s razón de atenuacón Procesamento de materales con sstemas láser. Consderemos un haz de luz láser con seccón L transversal A [cm 2 ] e rradanca [W/cm 2 ] que ncde en un materal. Supongamos que el rayo se absorbe totalmente a una longtud L [cm] dentro del materal. Desprecando efectos de dspersón podemos calcular la potenca total absorbda como: A Materal P= A [W] P representa entonces la potenca absorbda en el clndro cuya base tene área A y altura L. Suponendo que el perodo de tempo de exposcón es t, la energía depostada en el clndro es:
C5-Aplcacones en medcna 5 E=P t [J] De aquí podemos obtener la fluenca (energía por undad de área): E F = = t [ J 2 ] A cm Las propedades térmcas relevantes del materal son la masa (m) y la capacdad térmca (C). El cambo de temperatura por absorcón de energía puede estmarse como: E T =, mc que es una expresón válda para paredes con aslamento térmco, y sn consderar cambos de fase en el materal. Esto se puede expresar en térmnos de la densdad del materal como: E = Pt = mc T = ε = Pt LA T = = ρc T ε = ρc t ρlc ( ρ ) LA C T La temperatura fnal (T f ) se calcula como la temperatura ncal mas el ncremento en la temperatura. S T f es lo sufcentemente grande, el materal puede evaporarse. El cambo de fase en el materal puede consderarse con el calor latente de evaporacón (entalpía, H). Desprecando pérddas térmcas, la energía requerda para que el tejdo cambe de fase (.e., se evapore) puede calcularse como: E = mc T + mh = ρ LA( C T + H ) F = E A = t = ρl ( C T + H ) Con esto podemos fnalmente calcular la razón a la cual se remueve el materal (espesor de la capa evaporada por undad de tempo): E = At Adt = de = ρ CA Tdx + ρhadx de representa la energía necesara para vaporzar una capa de tejdo de espesor dx durante un tempo dt. La razón de vaporzacón es entonces: u = dx dt = ρ C T + ρh
C5-Aplcacones en medcna 6 De esta expresón se puede dstngur que el procesamento de materales está basado en ncrementos de temperatura. El ncremento necesaro para procesar el materal está determnado por la combnacón de parámetros del materal y del láser (longtud de onda, dámetro del haz, tempo de exposcón). Los efectos de los parámetros del sstema láser pueden descrbrse de la sguente forma: ) Operacón pulsada: los pulsos cortos se absorben cas totalmente en el materal. S el materal se aísla térmcamente pueden reducrse las pérddas por calor. ) CW: hay más tempo para que se presenten pérddas por conveccón, conduccón y radacón. Eventualmente, se alcanza un equlbro (energía absorbda por undad de tempo gual a pérddas de energía). ) Longtud de onda: se elge dependendo del objetvo y del materal (profunddad de penetracón, longtud de extncón, etc.) v) Potenca: a mayor potenca el ncremento de temperatura es mayor. v) Dámetro del haz: s el haz es gaussano, puede enfocarse en un área pequeña. S el volumen de exposcón es pequeño, T es grande y es más fácl vaporzar el materal. nteraccón de luz láser con el tejdo. La mayoría de los tejdos del cuerpo humano contenen más del 70% de agua. Cada tejdo tene un espectro de absorcón característco. Aproxmacón de prmer orden: propedades smlares a las del agua (ver fgura). El tejdo absorbe bastante la luz UV y la azul, pero transmte la luz roja. Además, la luz que se absorbe en el tejdo cas no expermenta dspersón. Este parámetro se vuelve mportante úncamente cuando se utlzan sstemas láser operando en el vsble o en el cercano nfrarrojo. Otro efecto mportante es la lumnscenca del tejdo. Exsten báscamente dos tpos de lumnscenca: ntrínseca (endógena): exsten varos fluoróforos nternos como las proteínas, ácdos nuclécos. Las proteínas, por ejemplo, tenen una energía de exctacón pco a los 280 nm y emten en el rango de 320 a 350 nm. En el colágeno la emsón ocurre a los 380 nm mentras que la melanna tene un pco de emsón amplo centrado a los 540 nm.
C5-Aplcacones en medcna 7 Extrínseca (exógena): cuando el tejdo se excta con luz UV, todos los dferentes fluoróforos pueden emtr luz smultáneamente. Esto hace complcado el estudo de la lumnscenca ntrínseca. Para poder utlzar técncas como la espectroscopa de fluorescenca, se deben ncorporar fluoróforos extrínsecos que permtan dentfcar el tejdo que se desea estudar. Es evdente que el efecto de un haz de luz láser con el tejdo depende de todos los parámetros del sstema láser. Tarea: 1. Calcular el ncremento de temperatura en una muestra de agua expuesta al haz de un láser Nd:YAG con los sguentes parámetros: Seccón transversal: 1mm 2 Potenca de salda: 1 W Tempo de duracón del pulso: 2 s Consderar una temperatura ncal del agua de 20 C y una profunddad de absorcón de 1 cm. Desprecar la dspersón y las pérddas por calor. Solucón. ε t El ncremento en la temperatura puede evaluarse con T = = ρc ρlc ( )( ) Pt 1W 2 s J Evaluando la densdad de energía: ε = = = 200 2 LA 1cm 0.01cm cm ( )( ) 3 g cal La densdad del agua es ρ = 1 3 cm, y la capacdad térmca es C = 1 g C Consderando que 1J 0.25cal, el ncremento de temperatura es entonces: o. J cal 200 0.25 3 ε cm J T o = = = 50 C ρc g cal 1 1 3 cm o g C S la temperatura ncal del agua es de 20 C, la temperatura fnal será entonces de 70 C. Nótese que la profunddad de penetracón puede obtenerse tambén de las gráfcas del coefcente de absorcón del agua utlzando la longtud de onda del laser (en este caso el Nd:YAG). Tambén, hay que enfatzar que no se consderan efectos de esparcmento n pérddas térmcas. 2. Calcular la energía necesara para vaporza 1 cm 3 de agua ncando a la temperatura corporal (T =37 C). A partr de este resultado, obtener una expresón que permta determnar la energía de umbral de vaporzacón, la densdad de energía de umbral de vaporzacón y la fluenca de umbral de vaporzacón. Evaluar estos parámetros para cuando se utlza un sstema láser de CO 2 con una seccón transversal de haz de 1 mm 2,
C5-Aplcacones en medcna 8 cuya profunddad de absorcón es de 0.004 cm. Cuánto tempo de exposcón se necesta para llegar al umbral de vaporzacón? Cuál es la razón de vaporzacón? Solucón. Para llegar a la temperatura de vaporzacón (100 C), se requere un ncremento de temperatura de 63 C. Para 1 g de agua, se requeren entonces 265 J de energía para llegar de la temperatura corporal (37 C) a la temperatura de vaporzacón. El calor latente de vaporzacón del agua es H=540 cal/g, por lo cual se requeren 2270 J para convertr 1 g de agua a 100 C de líqudo a vapor (1 cal = 4.2 J). Esto mplca que se necestan aproxmadamente 2500 J para vaporzar 1 cm 3 de agua a partr de la temperatura corporal. Con este resultado podemos evaluar (para el agua) el umbral de energía de vaporzacón para un haz láser con seccón transversal A y profunddad de penetracón L: [ ] E = Pt = 2500 AL J El umbral de densdad de energía es entonces 2500[ J ] El umbral de fluenca de energía para vaporzacón es: TH Pt ε TH = =. LA J FTH = t = 2500 L cm 2 Supongamos que utlzamos un laser de CO 2 con seccón transversal del haz (A) de 1 mm 2. El coefcente de absorcón del agua para la longtud de onda de este laser es α = 1000 cm -1, y podemos asumr (arbtraramente) que L = 4/α =0.004 cm. Con estos datos podemos calcular: a) Energía de umbral para ablacón (evaporacón del agua): E TH =100 mj b) Fluenca de energía mínma para ablacón: F TH =10 J/cm 2 c) Supongamos que el laser tene una potenca constante P = 10W. Esto mplca que se requere un tempo de exposcón de 10 ms para alcanzar el umbral de ablacón. d) S consderamos que en 10 ms se evapora un dsco de agua de espesor de 40 µm, podemos estmar que la razón de remocón de agua es de 0.4 cm/s. Alternatvamente podemos establecer que s un pulso de 100 mj remueve 4x10-5 cm 3 de agua, la remocón de bulto es entonces de 4x10-4 cm 3 /J. 5.1.2 Ablacón, regeneracón y reestructuracón de tejdo. El uso de sstemas láser para modfcar el tejdo es parte de un campo llamado ngenería del tejdo, en el que nteractúan dversas dscplnas como la químca, la ngenería y la cenca de materales. Los procesos que pueden realzarse con sstemas láser son:
C5-Aplcacones en medcna 9 Reestructuracón y conformacón de tejdo: los sstemas láser se utlzan para evaporar, dar forma o cambar la pgmentacón del tejdo. Fusón o unón de tejdos: los sstemas láser se utlzan para nducr la unón de los tejdos ( soldadura ) con el fn de reparar desgarramentos o nhbr crecmento vascular. Generacón de tejdo: el láser se utlza para actvar el crecmento de tejdo, o ben para realzar ncsones que estmulen el crecmento de nuevos tejdos. Reestructuracón y conformacón de tejdo. Las aplcacones con más desarrollo se encuentran en la dermatología y en la oftalmología. Dermatología: El desarrollo de sstemas láser para estas aplcacones se ha basado en la teoría de fototermólss selectva (Anderson y Parrsh, 1983). Fundamentalmente, se han establecdo las condcones para la destruccón altamente localzada de blancos absorbentes de luz en la pel, causando un daño mínmo al tejdo de los alrededores. La dea básca es elegr la longtud de onda, tempo de exposcón adecuados, así como tambén la fluenca de energía sufcente para que los blancos elegdos sean los úncos que absorban la energía del láser. Ejemplos de aplcacón: Malformacones vasculares (manchas o lunares rojos de gran tamaño). El cromóforo a atacar es la ox-hemoglobna. La luz láser la absorbe la hemoglobna y se converte en calor; este a su vez daña las paredes vasculares y se presenta un bloqueo de los vasos sanguíneos. Remocón de lesones pgmentadas y tatuajes. El blanco es la melanna o el pgmento del tatuaje. La luz láser causa un calentamento extremadamente rápdo de la melanna o el pgmento, lo que fractura estas partículas matando a las células que los contenen. Resurgmento de tejdo (resurfacng). El cromóforo a atacar es el agua. En el caso de remocón de arrugas se evapora una capa superfcal de la pel (1 µm o 20 µm) por medo de la absorcón de energía en el contendo de agua de la pel. Remocón de cabello. Se ataca la melanna folcular. Hasta la fecha, no se han establecdo los procedmentos para garantzar que este proceso es permanente. Oftalmología: Este campo de aplcacón es el que tene más antecedentes y lleva más o menos tres décadas de haberse ncado. Los mecansmos de nteraccón entre el tejdo y los sstemas láser utlzados son muy varados debdo a la estructura del ojo humano. Los ejemplos de aplcacón pueden agruparse en dos categorías: Tratamento de enfermedades retnales o glaucoma. Se utlzan sstemas láser que operan en el vsble o en el cercano nfrarrojo. Con estos pueden tratarse retnopatías dabétcas, oclusones de venas retnales, degeneracón macular, rasgados retnales, y el glaucoma. Crugía para correccones refractvas. Se utlzan longtudes de onda nvsbles (UV) para darle la forma correcta a la córnea con el fn de corregr la mopía, la hpermetropía y el astgmatsmo. Fundamentalmente se utlzan dos tpos de
C5-Aplcacones en medcna 10 procedmentos: PRK y LASK. Recentemente se ha aprobado tambén el uso de LTK (keratoplastía térmca) que se basa en el calentamento de regones anulares concéntrcas en la córnea para ncrementar su curvatura (no hay ablacón del tejdo de la córnea). Fusón de tejdos. Los tejdos que se han tratado con estas técncas son hasta la fecha tejdos blandos. Procedmentos típcos: a) Fusón drecta. Calentamento local a 60-80 C por absorcón de energía láser para nducr la unón del colágeno. b) Soldadura láser. Se emplean proteínas que tenen propedades de soldadura que se actvan por la nteraccón con luz láser. La longtud de onda se seleccona de tal forma que las proteínas la absorban para calentarse y sellar el tejdo crcundante. c) Soldadura láser mejorada por tntes. Se añaden tntes que aumentan la absorcón del láser hacendo más efcente el proceso de soldado. Los sstemas láser utlzados son el Nd:YAG, CO 2, y el uso de tntes ha permtdo el uso de dódos láser operando a 808 nm. Estos procedmentos pueden usarse en conjunto con endoscopía o lamparoscopía, lo que ofrece ventajas como: Posbldad de realzar mcrocrugía nflamacón reducda Recuperacón más rápda que con otro tpo de tratamento Sellado mpermeable Facldad y rapdez de aplcacón Aplcacones: Crugía cardovascular Crugía toráxca (sellado de fugas de are en pulmones después de bopsas) Dermatología (sutura de pel con mejor cosmétca y sanado más rápdo) Neurocrugía (reparacón y fusón de nervos perfércos) Oftalmología (sellado de ncsones en la esclerótca y la córnea) Urología (sellado de la uretra y próstata, en ambos casos es mportante la mpermeabldad) Regeneracón de tejdos. Este tpo de tratamento se encuentra todavía en etapa de nvestgacón y es un gran prospecto para la reparacón de tejdo después de que se ha sufrdo alguna lesón. La nvestgacón en este campo se ha ncado gracas a reportes que han estudado los efectos de la luz para sanar herdas y regenerar tejdo. En general, se ha establecdo que con fluencas bajas de radacón vsble e R se puede estmular el crecmento caplar y la granulacón durante la formacón del tejdo. La dea básca de este tratamento es tratar de deshacer los coágulos en el tejdo de las ccatrces para favorecer la regeneracón del tejdo natvo. Con ablacón láser,
C5-Aplcacones en medcna 11 por ejemplo, los coágulos se mnmzan y por lo tanto puede favorecerse la regeneracón de tejdos. 5.2 Correccón de la vsón. 5.3 Crugía con técncas laser. 5.4 Terapa fotodnámca. La terapa fotodnámca (PDT) ha emergdo como un tratamento promsoro del cáncer y otras enfermedades. Este tpo de terapa se basa en el empleo de un agente químco externo llamado fotosensblzador (droga PDT) que se actva por luz. Sumnstro de medcna PDT: ntravenoso Tópco Etapas claves de la PDT: Sumnstro del fotosensblzador Retencón selectva durante tempos largos de la droga PDT por parte del tejdo a tratar Llevar la luz (generalmente láser) a la zona afectada Absorcón de luz en el fotosensblzador para generar oxígeno de alta reaccón que destruya células cancerígenas con daño mínmo al tejdo vecno Elmnacón del fotosensblzador para reducr la sensbldad a la luz solar En general, todos los tejdos absorben la droga PDT, sn embargo, sólo el tejdo malgno lo retene por un tempo mucho más prolongado. Se debe selecconar tambén la longtud de onda adecuada para la actvacón de la droga. Dado que la luz que se utlza es generalmente luz láser, pueden utlzarse sstemas de fbra óptca para llevar la luz a las zonas afectadas. En el caso de cáncer de pel, puede utlzarse lumnacón drecta. El proceso de generacón de oxígeno en las células se conoce como fotooxdacón, y es el responsable de destrur las células malgnas. 5.4.1 Fotosensblzadores. Característcas: Habldad para acumularse selectvamente en el tejdo a tratar. Debe ser capaz de dspersarse en el torrente sanguíneo y de penetrar membranas celulares (puede lograrse químcamente) Absorcón consderable en la regón espectral de máxma transparenca para tejdos bológcos (de 800 a 1300 nm). Esto permte que la luz penetre más profundamente en el tejdo para actvar la droga. Debe consderarse tambén que las longtudes de onda mayores a los 900 nm son de energía muy baja como para lograr la generacón de oxígeno en las células. Capacdad de ser expulsadas del cuerpo rápdamente después del tratamento. Algunos ejemplos de drogas comercales:
C5-Aplcacones en medcna 12 Dervados de fotoporfrnas: se utlza para tratar una varedad de tumores cancerígenos. Se excta con luz roja (630 nm) aunque esta longtud de onda no penetra más de 2 mm en el tejdo bológco. A pesar de que algunos tumores gruesos pueden tratarse con la ayuda de fbras óptcas, no puede ser utlzada para tratamentos de tumores que se extendan más de 4 mm. Por lo general se requeren de 4 a 6 semanas posterores a la aplcacón de la nyeccón para elmnarla y durante este perodo se debe evtar la luz drecta del sol, luces artfcales muy brllantes o luces muy fuertes. Fotosensblzadores catóncos: la carga postva permte que sean atraídos por las mtocondras celulares, aunque su efectvdad para generar oxígeno es baja. Para esto se añaden otras moléculas que permten aumentar la efcenca de produccón de oxígeno. Ejemplo: azul de metleno. Fotosensblzadores dendrítcos: los dendrímeros son estructuras con ramfcacones que están lgadas secuencalmente para formar varas capas de crecmento. Estas estructuras proveen stos múltples para enlazar fotosensblzadores y, en algunos casos, pueden ncorporarse varos de ellos en dferentes ramas. 5.4.2 Aplcacones. Potencales (no han sdo aprobados por la FDA): Algunos tpos de cáncer pulmonar Cáncer de esófago Algunos tpos de cáncer de pel Cáncer de mama Cáncer colo-rectal Tumores cerebrales En la actualdad, para tratamentos de cáncer, el únco fotosensblzador autorzado es la Fotoporfrna. Otras enfermedades: Cardovasculares (alternatva a la angoplastía) Enfermedades cróncas en la pel (psorass) Degeneracón macular Antbacteral 5.4.3 Mecansmos de accón. Los mecansmos que producen la destruccón de las células cancerígenas no han sdo exactamente determnados. Sn embargo, se reconocen tres mecansmos nvolucrados en la accón fotodnámca: Celulares: los fotosensblzadores atacan drectamente a certos organelos de las células tales como las mtocondras o los plasmas de las membranas. En este caso, se produce necross y las células vecnas destruyen a las células pulverzadas por la accón fotodnámca.
C5-Aplcacones en medcna 13 Vasculares: se produce daño vascular provocando la actvacón de plaquetas y un ncremento en la permeabldad vascular. La sobreproduccón de sangre genera exceso de oxígeno en las células hasta que estas mueren. nmunológcos: estmulan la produccón de sustancas que atacan las zonas nflamadas por los tumores y eventualmente matan el tejdo cancerígeno. 5.4.4 Luz para terapa fotodnámca. Los prmeros estudos de esta tpo de terapa utlzaban lámparas de flamentos ncandescentes (tugsteno) y lámparas de arco (xenón o mercuro), ya que no se requere una fuente coherente n con alta potenca pco. Sn embargo, los sstemas láser ofrecen ventajas tales como: Luz monocromátca para actvar selectva y efcentemente fotosensblzadores específcos. Efcenca de acoplamento a fbras alta, hacendo posble el uso de endoscopos para uso nterstcal. Tpos de sstemas láser utlzados: Láser de tnte (Rodamna 6B, 665 nm, CW y pulsado) En el futuro: Dodos láser (CW y cuas-cw, 780-850 nm) Barras de dodos láser de alta potenca (100 W) Sstemas láser de estado sóldo en el NR (cáncer subcutáneo) Sntonzables de estado sóldo (T:zafro, 690-1100 nm, Alejandrta, 720-800 nm) Oscladores paramétrcos óptcos Requermentos para luz láser La doss apropada de luz para un tratamento específco depende del tamaño, localzacón y tpo de tumor. Para fotoporfrnas exctadas a 630 nm los requermentos son: Fluenca de 25-500 J/cm2 para tratamentos de superfce, 100-400 J/cm2 para aplcacones nterstcales. rradanca máxma de 200 mw/cm2 para tratamentos superfcales, 400 mw/cm2 para aplcacones nterstcales Potenca de salda de la fuente de 1-2 W Las nuevas generacones de fotosensblzadores tendrán los msmos requermentos ya que el objetvo es ncrementar la longtud de onda de exctacón con el fn de lograr mayor penetracón en el tejdo. 5.5 Estudo y dagnóstco de organsmos vvos. Los estudos boquímcos se encargan de determnar el contendo de dversos tpos de moléculas en sstemas de todo tpo. Exsten varos campos de nvestgacón e ndustras que requeren del análss rápdo y precso de dstntos productos o muestras; algunos ejemplos son:
C5-Aplcacones en medcna 14 nvestgacón: Determnacón de contendo molecular (concentracones) en sustancas de nterés. Dagnóstco clínco y medcna deportva: Medcón del contendo de nveles de glucosa en sangre y plasmas, así como el contendo de otras sustancas en fludos corporales como el cerebro-espnal. ndustra de bebdas y almentos: Establecer el contendo en cantdades correctas de elementos almentcos claves en los productos durante la etapa de produccón (tempo real). Bo-procesamento: Se requere del control precso de nutrentes y productos secundaros para optmzar el crecmento de células en cultvos y maxmzar los productos fnales a obtener. En general, todo este tpo de estudos se realza con dstntas tecnologías, y las aplcacones bológcas y boquímcas de estas se conocen como BOTECNOLOGÍA. La ndustra de la botecnología se ha desarrollado rápdamente en los últmos años gracas a las nnovacones tecnológcas en áreas que tenen aplcacón drecta en dcha ndustra. Tal es el caso de la optoelectrónca, en la que gran parte del gasto de nversón ha sdo destnado a aplcacones de botecnología. Los sensores desarrollados para el estudo de organsmos vvos en un sstema bológco se llaman BO-SENSORES. Estos detectan la nteraccón de moléculas bológcas báscamente en tempo real, y lo hacen medante un elemento sensor de orgen bológco que se ntegra a un transductor que proporcona una señal físca que puede medrse más fáclmente. La señal generada en el transductor es causada por la nteraccón entre el elemento sensor bológco (una molécula de boreconocmento nmovlzada) y la molécula bajo análss (analyte). Exsten dversas técncas de análss que se basan en el empleo de dspostvos optoelectróncos. En algunos casos, pueden utlzarse dspostvos de uso general para desarrollar aparatos de uso específco, aunque tambén se desarrollan dspostvos para satsfacer necesdades específcas de deteccón y análss de dversos tpos. Algunas de las técncas relaconadas con optoelectrónca son: Fluorescenca: Se basa en la deteccón de luz emtda específcamente por moléculas de nterés, ya sea de manera natural, o por medo de tntes que se ntroducen al sstema bológco. El efecto fluorescente se presenta al exctar a las moléculas (o en su caso al tnte) por medo de luz láser o, en algunos casos, utlzando fuentes de luz de otro tpo (e.g., LEDs, lámparas de mercuro). Por lo general se utlzan técncas espectroscópcas para analzar las muestras. Cromatografía: En general, la cromatografía se encarga de estudar el desplazamento de dstntos componentes en una solucón. El método utlzado para determnar el desplazamento de un componente en partcular se basa en el montoreo de el índce de refraccón o la absorcón de luz UV en una columna que contene la muestra en estudo. La nformacón se presenta en una gráfca
C5-Aplcacones en medcna 15 llamada cromatograma que grafca los cambos en índce de refraccón o absorcón en funcón del tempo. Esta nformacón se compara con cálculos teórcos para determnar las velocdades de desplazamento de las dstntas especes contendas en la columna y así poder dentfcar alguna en partcular. La cromatografía por afndad se basa en la nteraccón de un lgando con el soluto de nterés. Exsten dos tpo de lgandos: específcos (se lga úncamente a una espece) y generales (se lgan a grupos específcos contendos en las especes de estudo). Ejemplos de lgandos: o Antígenos, vrus o células: se lgan con atcuerpos. o Proteínas, polmerasas: se lgan con ácdos nuclécos. o Proteínas portadoras: se lgan con dstntos tpos de hormonas. La preparacón de las muestras nvolucra dstntas etapas que hacen el proceso relatvamente laboroso. Los componentes de la muestra son transportados por una fase móvl (líqudo o gas) a través de una fase estaconara. Las especes ndvduales retardan su desplazamento a través de la fase estaconara por medo de las nteraccones con el lgando. Las nteraccones fundamentales son adsorcón en la superfce, solubldad y carga. Generalmente se utlzan columnas que contenen todos los componentes. El análss se basa en medr el índce de refraccón de la columna, o en algunos casos, la absorcón de luz ultravoleta. Se utlza luz láser o lámparas UV y un detector que se montorea en tempo real para detectar pcos de absorcón o reflexón. Resonanca superfcal de plasma: (Surface Plasmon Resonance, SPR) Este fenómeno ocurre cuando un haz de luz se refleja al ncdr sobre películas delgadas de materales metálcos (generalmente oro). Una fraccón de la energía ncdente a un ángulo específco nteractúa con los electrones lbres de la película metálca y esto genera una reduccón en la ntensdad de luz reflejada por el arreglo óptco. Para poder utlzar este efecto, se requere la generacón de un campo evanescente entre la película y la nterfaz opuesta a la superfce de ncdenca (cara sensora del areglo). Esto mplca que las sustancas colocadas en la porcón de sensado debe tener un índce de refraccón menor.
C5-Aplcacones en medcna 16 Los aparatos basados en SPR mden la ntensdad de luz reflejada por el arreglo en funcón del ángulo de ncdenca. El ángulo al cual ocurre la reduccón de ntensdad reflejada se le conoce como ángulo SPR, y es funcón del índce de refraccón de la sustanca colocada en la cara sensora del arreglo. El índce de refraccón camba al lgarse macromoléculas a la superfce y, como resultado, se produce un cambo en el ángulo SPR en funcón del número de macromoléculas lgadas. La relacón entre la cantdad de materal que se lga y el desplazamento en el ángulo es lneal. Exsten aparatos que barren el ángulo de ncdenca del haz de luz láser para determnar el ángulo SPR. Estos mden el desplazamento del ángulo en mlradanes como una undad de respuesta para cuantfcar el lgado de las macromoléculas en la superfce del sensor. La respuesta depende tambén del índce de refraccón de toda la solucón utlzada. Un cambo de 120 mlradanes, por ejemplo, representa un cambo en el recubrmento de la superfce por proteínas de aproxmadamente 1 ng/mm 2, o equvalentemente, un cambo en el índce de refraccón de aproxmadamente 10-3. SPR parameter SPR angle shft Change n proten surface concentraton Change n bulk refractve ndex Equvalent value 120 mlldegrees 1 ng/mm 2 0.001 La parte clave de este tpo de sensores es la superfce de lgado. Aquí es donde la nteraccón molecular se lleva a cabo y un evento de lgado se traduce en una señal optoelectrónca. Es por esta razón que la arqutectura a nvel nanométrco de esta superfce es de gran mportanca. Por lo general se utlzan dstntos tpos de recubrmentos que ncorporan agentes bológcos que lgan certas moléculas de manera preferencal. Estos pueden ncorporarse en capas de materal polmércos o en otros tpos de materales. Otros métodos: Dferentes técncas espectroscópcas y de fluorescenca.
C5-Aplcacones en medcna 17 5.1 Análss celular Las técncas de análss celular se basan en análss de fluorescenca. Estas se combnan con técncas de mcroscopía que permten dentfcar las células contendas en un grupo. Exsten dferentes métodos con dferentes resolucones para dentfcacón de células. ndependentemente de la técnca utlzada, cualquer tpo de mcroscopo puede modfcarse de manera smple para que proporcone mágenes más claras y defndas. Entre las opcones más sencllas se encuentra el manpular la luz que llega al objeto que se desea observar. Esta manpulacón requere úncamente de fltros espacales que permten defnr los colores o los nveles de oscurdad en las dstntas alturas del objeto lumnado. La mcroscopía se basa en la absorcón de la luz en cada célula. En algunos casos, la absorcón de dstntas células es smlar, por lo que basarse en el efecto de absorcón de cada una de las células que conforman un grupo no proporcona mucha nformacón. En estos casos se debe aprovechar otra característca que permta establecer dferencas que puedan dstngurse en las mágenes. Un ejemplo es la mcroscopía de contraste de fase, en la que el objetvo ncorpora una regón anular que modula la fase de la luz utlzada para lumnar la muestra. Esta modulacón permte aumentar el contraste en las mágenes. Otra técnca smlar aunque más elaborada es la de contraste dferencal nterferométrco, que permte obtener mágenes con aspecto de tercera dmensón y agregar colores. La mcroscopía de fluorescenca se basa en la emsón de luz de tntes o dspostvos de prueba que se mezclan con la muestra. Se han desarrollado dferentes materales que pueden ser lgados no sólo por células específcas, sno tambén por
C5-Aplcacones en medcna 18 organelos ntracelulares para hacer posble su dentfcacón. En la fgura se muestra una célula de una artera pulmonar de bovno etquetada con tres tntes fluorescentes dferentes. Pueden dstngurse claramente el núcleo (azul), los mcrotubos que forman el esqueleto celular (verde) y las mtocondras (rojo). 5.2 Técncas óptcas no nvasvas para bopsa Los métodos óptcos utlzados para bopsas se basan en la nteraccón de las células cancerígenas con la luz. Los efectos que proporconan nformacón mportante son: Lumnscenca (fosforescenca y fluorescenca) Efecto de Raman Dspersón (Raylegh, Me) ******** Técncas para obtencón y análss de mágenes. Las técncas óptcas para adqurr mágenes pueden ser utlzadas para estudar un amplo rango de especmenes bológcos en un rango que cubre varas escalas de tamaño. En general, las técncas óptcas utlzadas para adqurr mágenes bológcas utlzan contrastes generados por dferencas entre la luz transmtda, reflejada y la fluorescenca de la regón que quere estudarse y la zona aledaña. 5.5.1 Técncas de mcroscopa.
C5-Aplcacones en medcna 19 Los métodos utlzados en la mcroscopa óptca se basan en el montoreo de las propedades óptcas de las muestras a analzar. Una clasfcacón general de estos métodos puede hacer de la sguente manera: Transmsón (translumnacón): se basa en la varacón espacal de la absorcón y dspersón de luz generada por las estructuras mcroscópcas y macroscópcas del tejdo. Durante su propagacón en el tejdo, la luz se descompone en: o Luz sn dspersar (dspersa coherentemente): se propaga en la dreccón del haz ncdente y por lo tanto sguen la trayectora más corta para salr del tejdo. Estos fotones contenen la máxma nformacón sobre la estructura nterna del tejdo. o Dspersa déblmente: sguen trayectoras osclantes y tambén se copropagan con el haz de luz ncdente. Estos fotones tenen un retraso temporal con respecto a los que componen la luz sn dspersar, y tambén contenen nformacón sobre el tejdo como medo dspersor. o Dspersa en forma múltple: compuesta por los fotones que vajan dstancas muy largas debdo a dspersón con las dferentes que componen el tejdo. Esta luz es la que no trae nnguna nformacón útl sobre el tejdo y por lo tanto debe dscrmnarse. Para elmnar la luz dspersa en forma múltple pueden utlzarse las sguentes técncas: o Fltrado espacal (mcoscopía confocal): método más smple, se utlza un fltro que elmna la luz que se propaga fuera del eje óptco del mcroscopo (una fbra, un pnhole). o Fltrado por polarzacón: la luz dfusa perde su polarzacón ncal y se elmna con fltros de polarzacón. o Fltrado por tempo: utlza un láser pulsado y una compuerta óptca sncronzada con el láser (e.g., efectos no-lneales). o Métodos en el domno de la frecuenca: se modula en ntensdad el láser y se mde el cambo de fase de la señal transmtda utlzando métodos como la mezcla heterodna. Reflexón (retro-dspersón): esta se basa en la recoleccón de la luz retro-dspersa por la muestra. Al gual que en el caso anteror, la luz que contene la nformacón mportante es la que contene la luz que se dspersa de manera coherente. La dscrmnacón se logra medante dos técncas: o Mcroscopía confocal (fltrado espacal): msma dea que para mcroscopía de transmsón. o Mcroscopía nterferométrca: esta técnca ha llevado al establecmento de la tomografía por coherenca óptca (OCT). Con esta, es posble obtener mágenes de tejdo con alto coefcente de dspersón. Fluorescenca: es la técnca más utlzada para la obtencón de mágenes bológcas ya que proporcona el sondeo más detallado de la estructura y la dnámca de especmenes bológcos tanto n vtro como n vvo.
C5-Aplcacones en medcna 20 Tarea: Explcar cómo están consttudos un mcroscopo smple y un mcroscopo compuesto. En qué consste el método de lumnacón de Kohler? Qué representan la resolucón y la abertura numérca en un mcroscopo? nvestgar las sguentes técncas de mcroscopía: o Contraste de fase (Phase contrast mcroscopy) o Campo obscuro (dark-feld mcroscopy) o Fluorescenca (fluorescence mcroscopy) o Tomografía por coherenca óptca (optcal coherence tomography) o Campo cercano (near-feld optcal mcroscopy) o Reflexón total nterna de fluorescenca (Total nternal reflecton fluorescence mcroscopy) Fuentes de nformacón: o http://mcro.magnet.fsu.edu o http://www.mcroscopyu.com o http://www.olympusmcro.com Mcroscopo smple. Este es báscamente una lente que magnfca la magen. El prncpo de funconamento se basa en la formacón de la magen por medo de una lente. S un objeto se coloca a una dstanca u de una lente, se forma una magen real de este a una dstanca v al otro extremo de la lente. Esta magen es la versón magnfcada por un factor v/u. En un mcroscopo, el objeto se coloca en el plano focal para formar la magen magnfcada y ser observada por el ojo o grabada en una cámara. Para obtener una magen ben defnda el objeto debe colocarse dentro de una dstanca cercana al plano focal conocda como profunddad de foco. Mcroscopo compuesto. Utlza una combnacón de lentes para mejorar sgnfcatvamente la magnfcacón de las mágenes. La magen magnfcada por el objetvo se vuelve a magnfcar con otro sstema de lentes (el ocular). La magnfcacón fnal está dada entonces por el producto de las magnfcacones de ambas etapas. La resolucón del mcroscopo depende no sólo de los objetvos sno tambén de la lumnacón. El método más utlzado de lumnacón es el método de Kohler.
C5-Aplcacones en medcna 21 5.5.2 Técncas en el domno del tempo y espectrales. Las técncas anterores permten obtener mágenes de alta resolucón a nveles subcelulares. Sn embargo, el sondeo de funcones bológcas requere de la combnacón de todas las técncas anterores con técncas en el domno del tempo y en el domno de la frecuenca. Esto permte estudar la dnámca de las funcones bológcas. Estas técncas se usan prncpalmente en conjunto con la deteccón de fluorescenca.