Técnicas de siembra para hongos y bacterias

Transcripción

1 OBJETIVOS. UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR Técnicas de siembra para hongos y bacterias - Practicar diferentes técnicas de siembra para el desarrollo de cultivos y subcultivos de hongos y bacterias, en medios de cultivo dispensados en tubos y cajas Petri, así como, en medios de diferente composición y estado. - Desarrollar en los estudiantes la capacidad de selección de una metodología específica, de acuerdo a los criterios proporcionados, para la aplicación correcta de las técnicas de siembra de acuerdo al microorganismo y al objetivo de la prueba. INTRODUCCIÓN. El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de cultivo, recibe el nombre de siembra; esta operación la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pus secreciones, etc.), de análisis para control de calidad (alimentos, aguas, cosméticos, medicamentos, etc.), procedente de muestras ambientales (agua, suelo, etc.), o de un cultivo microbiano a otro; si la realizamos de un cultivo a otro la denominamos subcultivo o repique. Para el estudio de las bacterias y otros microorganismos cultivables, es necesario, además, conocer y reconocer la morfología microscópica y macroscópica a partir de su crecimiento en medios de cultivo; adicionalmente, es posible evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos ó proporcionarles aquellos nutrientes adecuados para favorecer su desarrollo. Existen técnicas adecuadas para realizar estos cultivos, mediante el uso de algunos elementos importantes para realizar siembras, como: El mechero (de alcohol o de Bunsen), el asa bacteriológica (asa de argolla), o micológica (asa recta), cámaras de flujo laminar o el espacio adecuado en condiciones asépticas y los medios de cultivo ya preparados y atemperados a 37 C; esta última observación es importante tenerla en cuenta, ya que los microorganismos objeto de estudio y presentes en las muestras o cultivos, deben evitar ser estresados con cambios bruscos de temperatura o por otros factores (incluida la composición del medio de cultivo). Contando con estos implementos, es posible iniciar adecuadamente el proceso de cultivar o subcultivar muestras o aislamientos previamente obtenidos. TÉCNICAS DE SIEMBRA. La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Para determinar los caracteres de cultivo de las bacterias, hongos y otros cultivables, es preciso obtenerlas en cultivo axénico (o cultivo puro). Existen varios métodos para aislar las bacterias en cultivo puro con el fin de evaluar sus características en estos medios. Se entiende por cultivo puro, una población de células las cuales todas proceden de una misma célula. Existe gran variedad de técnicas por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas en cultivo puro.

2 TÉCNICAS DE SIEMBRA EN CAJAS PETRI. UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR Siembra en cajas de Petri por la Técnica de agotamiento, aislamiento o de estría cruzada. Es un buen método para el aislamiento de colonias (obtención de colonias aisladas); mediante esta técnica buscamos obtener colonias separadas a partir de un inóculo. Para su realización: (i) Se toma la caja de Petri en la palma de la mano y ligeramente inclinada; con la mano contraria, se manipula el asa de argolla previamente esterilizada por flameado directo a la llama y con ella se recoge el material de cultivo, para colocarlo en un área periférica de la caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inóculo. (ii) El asa debe ser nuevamente flameada y enfriada en un lateral del agar (procurando no dañarlo); a continuación, se realiza una estría partiendo de la primera y arrastrando los microorganismos presentes en ella hacia el extremo contrario de la superficie del agar. Se debe procurar que, en cada sección de la caja, las estrías queden trazadas con mayor separación. (iii) Repita el paso ii, por tres veces (algunos autores reportan solo dos), recordando flamear y enfriar el asa cada vez que culmine una estría y solo tocar con el asa la estría inmediatamente anterior, con el objetivo de ir reduciendo la carga microbiana arrastrada por la argolla. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla (Figura 1). Fig. 1. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento (y otros microorganismos emulsionables como las levaduras) (Fuente: Rojas, A.). Siembra en cajas de Petri por la Técnica de siembra en cuadrantes. El objetivo de esta técnica, es el de diluir el inóculo a medida que se realizan estrías en la superficie del agar. Para realizar la siembra, la caja se divide en cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un marcador vidriográfico por la base de la caja); se procede a esterilizar el asa en el mechero, se toma el inóculo y se inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente inóculo). Las cajas así sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la bacteria. Con esta técnica de siembra, se espera que al menos en el cuarto cuadrante (última estría realizada), se encuentren colonias de la bacteria aisladas (Figura 2).

3 UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR Fig. 2. Técnica de siembra en cuadrantes, donde se observan las cuatro estrías realizadas una a continuación de la otra y sin cargar el asa nuevamente (Fuente: Rojas, A.). Siembras en cajas de Petri por la Técnica de siembra masiva. Este método es muy utilizado para obtener un gran número de microorganismos (incremento de inóculo), en la superficie de un agar. Esta técnica de siembra utiliza un hisopo, el cual se pasa por toda la superficie de la placa en distintas direcciones y finalmente por el borde para que, el crecimiento de los microorganismos sea total en la superficie de la placa (Figura 3). Fig. 3. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica masiva, utilizando hisopos estériles y sobre la superficie de un agar en caja Petri (Fuente: Rojas, A.). Siembras en cajas de Petri por la Técnica de punción. Método de siembra utilizado para observar el crecimiento de hongos y así más adelante establecer su morfología; así como, para la transferencia o subcultivo de cepas previamente almacenadas y /o conservadas. Consiste en tomar parte de micelio con un asa micológica (o asa recta), y por una punción suave en el centro de la caja inocular el microorganismo a estudiar. Dependiendo del objetivo, pueden hacerse múltiples picaduras en el agar (varios puntos de siembra) (Figura 4).

4 UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR Fig. 4. Procedimiento para la realización de una siembra por la técnica de punción, utilizando asa micológica y sobre la superficie de un agar en caja Petri (Fuente: Rojas, A.). TÉCNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS. La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado, puesto que un solo organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de interés, por lo tanto, se deben tener las siguientes precauciones: - Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la boca de este. - Los tapones se deben mantener en la mano contraría a aquella que contiene el tubo, sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el dedo del corazón. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar. - Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo después de la siembra o inoculación. - Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porción que entra en contacto con el medio de cultivo). - Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo. - Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo. - Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo. - Siembre trabaje con material abierto, en cámara de flujo laminar o en su defecto con mecheros Bunsen. - En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, así como, utilice asas totalmente rectas. Siembra en tubos por estría simple. Se realiza en un tubo con medio sólido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marquen surcos o estrías (Figura 5A) Siembra mixta en tubos. Se realiza sobre medios inclinados o en bisel, haciendo una picadura hasta el fondo del tubo con asa recta y luego haciendo una siembra en estría sobre la superficie expuesta del agar, deslizando el asa por la superficie en bisel marcando las estrías; de tal manera que, con el asa cargada se realizan los dos tipos de siembra y sin retirarla del tubo (Figura 5B).

5 UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR Siembra en tubos por picadura. Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos con medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo (Figura 5C y 5D). Siembra en tubo en medio líquido. Para transferir material a partir de un medio líquido o sólido a otro líquido, puede usarse el asa bacteriológica (de argolla), o en algunos casos, pipetas estériles o hisopos. Si Usted utiliza asas bacteriológicas, inocule el microorganismo en el medio líquido haciéndola rotar del mango (Figura 5E). Fig. 5. Técnicas de siembras aplicadas a medios de cultivo contenidos en tubos, donde: (A) Siembra por estría simple, (B) siembra mixta (picadura y estría), (C y D) siembra por picadura en agar inclinado y recto y, (E) siembra con asa bacteriológica en medio líquido (Fuente: Rojas, A.). NOTA: En cualquier siembra que usted realice debe marcar previamente las cajas Petri o los tubos de manera clara, completa, legible, con la identificación respectiva y la fecha. Para análisis clínico, marcar siempre las cajas en la base de la caja Petri y para análisis de control de calidad de alimentos u otras materias primas, marcar las cajas en la tapa de la caja Petri. Luego de realizada la siembra, usted debe proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado para la proliferación o crecimiento bacteriano, para ello dispone de la incubadora o en dado caso, un lugar adecuado a temperatura ambiente. Recuerde que las cajas Petri se incuban invertidas; si el inóculo no se ha adsorbido, espere 10 minutos, si este tiempo no es suficiente incube las cajas con la tapa hacia arriba por 30 minutos antes de invertirlas. Lo anterior, tiene como objetivo impedir que el agua de condensación que pueda formarse en la tapa de la caja, caiga sobre el medio dispersando el crecimiento bacteriano y evitando la formación clara de las colonias. ACTIVIDAD PRÁCTICA. Materiales. - 1 asa bacteriológica recta y curva. - 1 asa micológica. - 1 mechero Bunsen. - Alcohol Antiséptico. - Toallas desechables.

6 - 1 rollo de cinta de papel. - Marcador (Sharpie o el de su preferencia) UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR CUESTIONARIO. 1. Cuál es el objetivo o finalidad de una siembra por agotamiento? 2. Mencione brevemente el proceso de purificación de un aislamiento bacteriano obtenido en agares. 3. Explique brevemente la metodología para realizar siembras en placa profunda y placa en superficie. BIBLIOGRAFÍA. Aquiahuatl Ramos, M. A., y Pérez Chabela, M. L Manual de prácticas del Laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa. México. Departamento de Biotecnología. 116 p. ARC-Plant Protection Research Institute Collecting and preserving fungi.biosystematics Division, ARC- PPRI, South Africa.86p. Baker, F. J., y Breach, M. R Manual de técnicas de Microbiología Médica. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 676 p. Castaño-Zapata, J. y Del Río Mendoza, L Manual para el diagnóstico de hongos, bacterias, virus y nematodos fitopatógenos. Zamorano- Universidad de Caldas. 210 p. CommonWealth Mycological Institute - C.A.B Manual para Patólogos Vegetales. Lamport Gilbert Printers Ltda. Gran Bretaña. 438 p. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, Madigan, M. T.; Martinko, J.M.; y Parker J Brock: Biología de los Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª Ed. Madrid. 1011p. Manual de medios de cultivo Merck. Editorial Merck Alemana Pascual Anderson, M. A., y Calderón y Pascual, V Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. 2ª Ed. Díaz de Santos S. A. 441 p. Pelczar, M., y Chan, E.C.S Elementos de Microbiología. Editorial MacGraw Hill, México. Pineda Vásquez, M.A., Sánchez de Praguer, M., Peña Rueda, A., Escarria Parra, L. P., Gallo Valdes, P. I., Ramos Naranjo, F., Molina Tirado, O. I., Martínez Cevera, L., y Escobar, F. A Microbiología. Guías para el Laboratorio. 2ª Ed. Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Facultad de Ingeniería y Administración. Palmira, Valle del Cauca. 115 p. Schaad, N. W Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. 2ª Ed. APS Press. St. Paul, Minnesota. 158 p.