M. en C. Rocío Parra-Laca

Transcripción

1 Urastoma sp. y Perkinsus marinus en los ostiones de importancia acuícola Crassostrea virginica y Crassostrea corteziensis Coevolución o Transfaunación? M. en C. Rocío Parra-Laca I& D

2 Los principales productores mundiales de ostión, de acuerdo con el volumen producido en 2004, fueron: China, Corea, Japón y EUA. México ocupó la sexta posición con un total de 50,149 toneladas, lo cual representa el 1.1% de la producción mundial (FAO, 2006). Tabla 1. Participación de la acuacultura en la producción pesquera nacional en peso vivo (toneladas), por especie, según volumen en 2008 (CONAPESCA, 2008)

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5 HOSPEDERO PATÓGENO ENFERMEDAD Crassotrea virginica Papilomavirus Hipertrofia gametocítica viral (VHG) Crasssotrea gigas, Mactra Bacterias tipo Rickettsias Rickettsiosis califórnica C. giga, Mytilus califórnica Bacterias tipo Vibrio Vibriosis Tivela stultorum C. virginica, C. corteziensis Perkinsus marinus Perkinsiosis C. gigas Stegotricha enterikos y otros ciliados Infección por ciliados tipo Ancistrocoma C. gigas Trichodina sp. y otros ciliados Infección por ciliados tipo Trichodina Mytilus galloprovincialis Steinhausiamytilovum Enfermedad de los gametos M. galloprovincialis, Nematopsis sp. Gregarinas M. californica Haliotis fulgens, Haliotis Candidatus Xenohaliotis Sindroma de deshidratación rufescens californiensis H. rufescens Margolisiella (Pseudoklossia) Coccidiosis haliotis C. gigas, C. virginica C. croteziensis, Pecten maximus, Ostrea edulis Herpesvirus (OsHV-1)

6 Urastoma sp. y Perkinsus marinus en los ostiones de importancia acuícola Crassostrea virginica y Crassostrea corteziensis Coevolución o Transfaunación? TESIS MAESTRÍA EN CIENCIAS EN ACUICULTURA PRESENTADA POR: ROCÍO PARRA LACA Director: Jorge A. Cáceres Martínez Ensenada, Baja California, México I& D 6

7 INTRODUCCIÓN Phyllum: Mollusca Additional%20Species/Donax.htm /

8 INTRODUCCIÓN Clases: Cephalopoda Gastropoda Monoplacophora Polyplacophora Bivalvia Crassostrea virginica Crassostrea corteziensis 8

9 INTRODUCCIÓN Ancestro común ACONTECIMIENTOS Plioceno hace 5.3 m.a. Ancestro común de C. virginica y C. corteziensis con carga parasitaria 9

10 INTRODUCCIÓN ACONTECIMIENTOS Plioceno hace 3.1 a 2.8 m.a. Cierre del Istmo de Panamá 10

11 INTRODUCCIÓN Crassostrea virginica Golfo de St. Lawrence Canadá hasta Brasil y Argentina Crassostrea corteziensis Golfo de California hasta Panamá 11

12 INTRODUCCIÓN 12 Tomado de Castillo y García-Cubas, 1986

13 INTRODUCCIÓN Producción anual: C. virginica 40,000 toneladas Sustitución del cultivo de Crassostrea gigas C. corteziensis 2,000 toneladas

14 INTRODUCCIÓN HASTA 1939 C. virginica Punta Banda 2.- Bahía San Jorge Crassostrea virginica 3.- Nayarit Crassostrea corteziensis 14

15 INTRODUCCIÓN Ancestro común Carga parasitaria C. virginica C. corteziensis C. corteziensis C. virginica Perkinsus marinus Urastoma sp. Caracterización genética Presencia Transfaunación Coevolución 15

16 INTRODUCCIÓN Perkinsus marinus Qué es? Protista (patógeno de moluscos) Orden Perkinsida, Familia Perkinsidae, Género Perkinsus Dermo descubierto en los 40 s Trofozoitos Hipnosporas 20 mm 10 mm 10 mm Tasumi y Vasta, 2007 Peyre y Faisal,

17 INTRODUCCIÓN Agente causal de mortalidades masivas en verano y otoño. Infecciones del 100 % con una mortalidad del 90%. Aumento de la infección con mayor temperatura y salinidad. Todos su estadios son infectivos. Infección sistémica, provoca lisis y desorganización del tejido conectivo y epitelial

18 INTRODUCCIÓN Ciclo reproductivo de Perkinsus spp. (Villalba, 2008) Hipnosporas Zoosporas Fase de desarrollo Fase de multiplicación vegetativa Fase de proliferación Trofozoitos Fase de vida libre Tomado de Villalba et al.,

19 INTRODUCCIÓN Urastoma sp. Qué es? Gusano plano o platelminto Phyllum Platyhelminthes, Clase Turbellaria, Familia Urastomidae Longitud de 0.4 a 0.8 mm Parásito de moluscos Localizado en las branquias del hospedero. Brun et al., 1999 Bataller et al.,

20 INTRODUCCIÓN Ciclo reproductivo de Urastoma cyprinae sugerido por Crespo et al., 2005? 1.- Turbelario maduro 2.- Cápside 3.- Formación de huevo 4.- Desarrollo de huevos 5.- Desarrollo de 12 turbelarios inmaduros 6.- Infección del hospedero Tomado y modificado de Crespo et al.,

21 HIPÓTESIS Si la carga parasitaria actual de Crassostrea virginica y Crassostrea corteziensis, representada por dos especies de parásitos clasificados como Urastoma sp. y Perkinsus marinus es resultado de un proceso coevolutivo, deben encontrarse variedades o diferencias específicas entre ellos, sino, es por un proceso de transfaunación. 21

22 OBJETIVOS Identificar especies de Urastoma sp. en Crassostrea corteziensis y Crassostrea virginica. Caracterizar y comparar por biología molecular a Perkinsus marinus y Urastoma sp. Corroborar si P. marinus y Urastoma sp. presentes en C. virginica y C. corteziensis son la misma especie. Determinar si la variación parasitaria está dada por efecto de transfaunación o como resultado coevolutivo. 22

23 METODOLOGÍA OBTENCIÓN DE MUESTRAS Perkinsus marinus y Urastoma sp. Nayarit : (C. corteziensis) Estero Boca de Camichín y Pozo Chino Tabasco: (C. virginica) Laguna de Mecoacán Sonora: (C. corteziensis) Bahía San Jorge Veracruz: (C. virginica) Laguna Mandinga 23

24 METODOLOGÍA ANÁLISIS DE MUESTRAS EN FRESCO Perkinsus marinus Urastoma sp. Recto Branquia Branquia Urastoma cyprinae Tabasco Nayarit Congelación -20 C Congelación -20 C Etanol 96% 24

25 METODOLOGÍA CARACTERIZACIÓN Perkinsus marinus y Urastoma sp. P. marinus Urastoma sp. Extracción ADN DNAzol Análisis por : Espectrofotometría Electroforesis 0.8% Kit QIAamp QIAGEN PCR (amplificado) Purificación del producto de PCR Secuenciación Electroforesis en agarosa 1.5 % NTS P. marinus 1.2 % ITS P. marinus 2.0% 18S Urastoma sp. 25

26 METODOLOGÍA AMPLIFICACIÓN DE NTS E ITS DE Perkinsus marinus Región Primer Producto NTS (Robledo, 1998) NTS-1 : 5 CAC TTG TAT TGT GAA GCA CCC 3 NTS-2 : 5 TTG GTC ACA TCT CCA AAT GAC 3 Aproximado de 307 pb ITS (Audemard et al., 2004) PerkITS85: 5 CCG CTT TGT TTG GAT CCC 3 PerkITS-750 : 5 ACA TCA GGC CTT CTA ATG ATG 3 Aproximado de 509 pb 26

27 METODOLOGÍA

28 METODOLOGÍA AMPLIFICACIÓN FRAGMENTO DE 18S de Urastoma sp. Urastoma sp. (Carranza et al., 1997) Urastoma cyprinae (Norén y Jondelius 1999) Urastoma cyprinae (Norén y Jondelius 1999) Región Primer Producto 18S ADNr 18S ADNr 18S ADNr 1F- 5 TAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT AG 3 1R- 5 CTT GGC AAA TGC TTT CGC 3 2F- 5 GCG AAA GCA TTT GCC AAG AA 3 2R- 5 GAT CCT TCC GCA GGT TCA CCT AC 3 1F- 5 AMC TGG TTG ATC CTG CCA G 3 1R- 5 TGA TCC ATC TGC AGG TTC ACC T R- 5 GAT CGT CTT CGA ACC TCT G F- 5 GGT GCC AGC NGC CGC GGT 3 Aproximado de 800 pb Aproximado de 1743 pb Aproximado de 500 pb 28

29 METODOLOGÍA ANÁLISIS DE SECUENCIAS Secuenciación MEGA versión 4 (Tamura et al., 2007) Alineamiento CLUSTAL W % de similitud # de cambios Transversiones Transiciones Árboles filogenéticos Transiciones Transversiones Purinas Pirimidinas A - G A - G C - T C - T 29

30 METODOLOGÍA 30

31 RESULTADOS AMPLIFICACIÓN DE NTS DE Perkinsus marinus Amplificación del NTS de Perkinsus marinus por medio de PCR en Crassostrea virginica y C. corteziensis de los estados de Sonora, Nayarit y Veracruz. Carriles 1 y 7) Marcador de peso molecular de 0.1 a 1 Kpb (GeneChoice); 2) Control positivo (ADN genómico del hospedero con infección por Perkinsus marinus, 100 ng por reacción); 3) Control negativo (agua estéril); 4) Muestra positiva de C. corteziensis de Nayarit; 5) Muestra positiva de C. virginica de Veracruz; 6) Muestra positiva de C. corteziensis de Sonora pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 100 pb Electroforesis en agarosa al 1.5 % 31

32 RESULTADOS BLAST DE NTS DE Perkinsus marinus BLAST gen NTS No. de Acceso Cobertura Valor E Identidad Eu Perkinsus marinus NTS, secuencia parcial 100% 4e % AF Perkinsus marinus cepa Txsc gen ARNr, secuencia parcial 97% 1e % S Perkinsus marinus región intergénica de ADN genómico 97% 7e % Seis nucleótidos diferentes de las secuencias reportadas y las secuencias obtenidas de NTS de Perkinsus marinus de Nayarit, Sonora y Veracruz. Dos transiciones y cuatro transversiones. 32

33 RESULTADOS ÁRBOL FILOGENÉTICO DE NEIGHBOR-JOINING DE LAS SECUENCIA NTS DE Perkinsus marinus Perkinsus sp. AF cepa P.sp.7 gen ARNr NTS (Australia) Perkinsus sp. AF cepa P.sp.4 gen ARNr NTS (Australia) Perkinsus atlanticus AF gen 5S ARNr incluye NTS (Espana) Perkinsus olseni AF cepa P.o6 gen ARNr incluye NTS (Australia) Perkinsus olseni AF cepa P.o3 gen ARNr NTS (Australia) Perkinsus sp. AF cepa P.sp.8 gen ARNr NTS (Australia) Perkinsus olseni AF cepa P.o4 gen ARNr incluye NTS (Australia) Perkinsus olseni AF cepa P.o2 gen ARNr NTS (Australia) Perkinsus marinus AF cepa TXsc gen ARNr incluye NTS (Texas) Perkinsus marinus S Region intergenica ADN genomico 307 nt (Maryland) Perkinsus marinus Nayarit (Crassostrea corteziensis) Perkinsus marinus Veracruz (Crassostrea virginica) Perkinsus marinus Sonora (Crassostrea corteziensis) Perkinsus marinus EU NTS (Nayarit)

34 RESULTADOS AMPLIFICACIÓN DE ITS DE Perkinsus marinus Amplificación del ITS de Perkinsus marinus por medio de PCR en Crassostrea corteziensis de los estados de Sonora y Nayarit. Carriles 1 y 6) Marcador de peso molecular de 0.1 a 1 Kpb (GeneChoice); 2) Control positivo (ADN genómico del hospedero con infección por Perkinsus marinus, 100 ng por reacción); 3) Control negativo (agua estéril); 4) Muestra positiva del estado de Nayarit; 5) Muestra positiva del estado de Sonora pb 700 pb 600 pb 400 pb 300 pb 200 pb 100 pb Electroforesis en agarosa al 1.2 % 34

35 RESULTADOS BLAST DE ITS DE Perkinsus marinus BLAST gen ITS No. de Acceso Cobertura Valor E Identidad DQ Perkinsus marinus aislado 7, ITS1, secuencia parcial 100% % DQ Perkinsus marinus aislado 6, ITS1, secuencia parcial 100% % AY Perkinsus marinus clon NJ3 1, subunidad 1K gen ARNr 100% % AY Perkinsus marinus clon MA2 11, subunidad 1K gen ARNr 100% % AY Perkinsus marinus clon LA23 7, subunidad 5 gen ARNr 100% % AF Perkinsus marinus cepa Txsc gen ARNr, secuencia parcial 100% % AF Perkinsus marinus aislado TCMD-1, gen 18S ARNr, secuencia 100% % parcial AF Perkinsus marinus aislado WIMD-2, gen 18S ARNr, secuencia 100% % parcial AF Perkinsus marinus aislado FPMD-6, gen 18S ARNr, secuencia 100% % parcial U Perkinsus marinus gen 18S y 28s ARNr, secuencia parcial 100% % AY Perkinsus marinus clon SC2 4 7, subunidad menor gen ARNr 100% % DQ Perkinsus marinus aislado 9, ITS1, secuencia parcial 100% % AY Perkinsus marinus clon SC2 4 8, subunidad menor ARNr 100% % EU Perkinsus marinus aislado EBPICv15-h6-g5 clon 2, subunidad 100% % menor ARNr DQ Perkinsus marinus aislado 10, ITS1, secuencia parcial 100% % Se encontraron seis nucleótidos diferentes respecto a las secuencias de Perkinsus marinus de Nayarit y Sonora y las secuencias de P. marinus reportadas transiciones y 3 transversiones.

36 RESULTADOS ÁRBOL FILOGENÉTICO DE NEIGHBOR-JOINING DE LAS SECUENCIAS ITS DE Perkinsus marinus Perkinsus marinus AF aislado TCMD 1 (Virginia) Perkinsus marinus AF aislado FPMD-6 ITS (Virginia) Perkinsus marinus AF cepa TXsc 5S ITS (Texas) Perkinsus marinus AY clon LA (Virginia) Perkinsus marinus AY clon MA2 11 1K (Virginia) Perkinsus marinus AY clon NJ3 1 1K (Virginia) Perkinsus marinus DQ gen ARNr incluye ITS (España) Perkinsus marinus DQ ITS gen ARNr incluye ITS (España) Perkinsus marinus Sonora (Crassostrea corteziensis) Perkinsus marinus Nayarit (Crassostrea corteziensis) Perkinsus marinus AF aislado WIMD-2 ITS (Virginia) Perkinsus marinus AY clon SC2 4 6 (Virginia) Perkinsus marinus DQ aislado 9 ITS (Virginia) Perkinsus marinus AY clon SC2 4 5 (Virginia) Perkinsus marinus AY clon SC2 4 4 (Virginia) Perkinsus marinus EU aislado EBPICv15 H6-G5 ITS (Virginia) Perkinsus marinus DQ aislado 5 ITS (España) Perkinsus marinus AY clon SC2 4 8 (Virginia) Perkinsus marinus AY clon NJ3 1 6 (Virginia) Perkinsus marinus AY clon MA (Virginia) Perkinsus marinus PMU07700 ITS (Australia) Perkinsus marinus DQ aislado 10 ITS (España) Perkinsus marinus DQ aislado 2 ITS (España) Perkinsus marinus AY clon SC3 (Virginia) Perkinsus marinus AY clon SC3 2 1B (Virginia) Perkinsus atlanticus AF aislado E8 (España) Perkinsus olseni GU aislado SS 3 (China) 36

37 RESULTADOS AMPLIFICACIÓN DEL GEN 18S DE Urastoma sp. DE Crassostrea corteziensis Amplificación del Gen 18S de Urastoma sp. por medio de PCR en Crassostrea corteziensis de los estados de Sonora y Nayarit. Carril 1) Marcador de peso molecular de 0.1 a 1 Kb (GeneChoice); 2) Control positivo de Urastoma cyprinae extraído de branquia de Mytilus galloprovincialis del estado de Baja California; 3) Control negativo (agua estéril); 4) Músculo del hospedero; 5) Muestra positiva de Urastoma sp. con los iniciadores 1F-UR1 y 1R-UR1; 6) Control positivo de U. cyprinae extraído de branquia de Mytilus galloprovincialis del estado de Baja California; 7) Control negativo (agua estéril); 8) Músculo del hospedero; 9) Muestra positiva de Urastoma sp. con los iniciadores 2F-UR1 y 2R-UR ,000 pb 1,000 pb 700 pb 500 pb Electroforesis en agarosa al 2.0 % 37

38 RESULTADOS AMPLIFICACIÓN DEL GEN 18S DE Urastoma sp. DE Crassostrea virginica ,000 pb 1,000 pb 700 pb 500 pb Electroforesis en agarosa al 2.0 % Amplificación del Gen 18S de Urastoma sp. por medio de PCR en Crassostrea virginica del estado de Tabasco. Carril 1) Marcador de peso molecular de 0.1 a 1 Kb (GeneChoice); 2) Control positivo de Urastoma cyprinae extraído de branquia de Mytilus galloprovincialis del estado de Baja California Muestra; 3) Control positivo de Urastoma sp. extraído de branquia de Crassostrea corteziensis del estado de Nayarit; 4) Control negativo (agua estéril); 5) Músculo del hospedero; 6) Muestra positiva de Urastoma sp. con los iniciadores 2F-UR1 y 2R-UR1 38

39 RESULTADOS BLAST DEL GEN 18S DE Urastoma sp. DE Crassostrea corteziensis y Crassostrea virginica BLAST gen 18S No. de Acceso Cobertura Valor E Identidad U Urastoma sp. gen 18S ARNr, 99% % AF AF secuencia completa. Urastoma cyprinae gen 18S ARNr, secuencia parcial. Urastoma cyprinae gen 18S ARNr, secuencia parcial. 99% % 99% % Se encontraron sesenta y siete nucleótidos diferentes respecto a las secuencias de Urastoma sp. reportadas. 23 transiciones y 23 transversiones para Urastoma sp. de Tabasco y Nayarit. 20 transiciones y 25 transversiones para Urastoma sp. de Baja California. 39

40 RESULTADOS ÁRBOL FILOGENÉTICO DE NEIGHBOR-JOINING DE LAS SECUENCIAS DEL GEN 18S DE Urastoma sp. Urastoma sp. (Crassostrea virginica) Tabasco Urastoma sp. (Crassostrea corteziensis) Nayarit Urastoma sp. (Mytilus galloprovincialis) Baja California Urastoma sp. USU S gen ARNr secuencia completa Urastoma cyprinae AF S gen ARNr secuencia parcial Urastoma cyprinae AF S gen ARNr secuencia parcial Notentera ivanovi AJ S gen ARNr Ichthyophaga sp. AJ S gen parcial ARNr Ciliopharyngiella constricta isolate NHM-London AY S gen ARNr secuencia parcial Trochonerilla mobilis AY S gen ARNr secuencia parcial Cossura candida AY S gen ARNr secuencia parcial Capilloventer australis AY S gen ARNr secuencia parcial Saccocirrus sp. BC-2003 AY S gen ARNr secuencia parcial Saccocirrus papillocercus AF S gen ARNr secuencia parcial Urastomidae-Platelminto Urastomidae-Platelminto Urastomidae-Platelminto Urastomidae-Platelminto Urastomidae-Platelminto Urastomidae-Platelminto Fecampiidae-Platelminto Urastomidae-Platelminto No hay familia descrita -Platelminto Nerillidae-Annelida Cossuridae-Annelida Capilloventridae-Annelida Saccocirridae-Annelida Saccocirridae-Annelida

41 DISCUSIÓN Clasificación de organismos por taxonomía convencional ha tenido fronteras. Estas fronteras han sido traspasadas con el desarrollo de la biología molecular. Cuál es el número de cambios suficientes para definir una especie?. Cambios moleculares son resultado de procesos de adaptación al medio externo que pueden reflejarse físicamente en los individuos. 41

42 DISCUSIÓN Cambio drástico fue el cierre del istmo de Panamá generándose, como resultado de un aislamiento reproductivo, dos especies de ostión con una carga parasitaria similar apoyando la hipótesis planteada. Para Perkinsus marinus, gracias a la información publicada y al conocimiento de su genoma, nos ha sido posible con las secuencias obtenidas en el estudio determinar su similitud en poblaciones de hospederos separadas. 42

43 DISCUSIÓN Para Urastoma sp. con las fracciones del genoma conocidas y su comparación con las secuencias obtenidas en el estudio nos permite determinar que pertenecen al mismo género y muy probablemente a la misma especie. Mas estudios morfológicos y moleculares de secuencias más específicas son necesarias para determinar si se trata de una especie diferente o de variaciones interespecíficas. 43

44 CONCLUSIONES Con el análisis de las secuencias de NTS de Perkinsus marinus con las secuencias del GenBank de la región NTS de P. marinus, se puede decir que Perkinsus marinus de Sonora, Nayarit y Veracruz son de la misma especie. Con el análisis de las secuencias de ITS de Perkinsus marinus con varios tipos de P. marinus, se puede decir que las muestras de Sonora y Nayarit son de la misma variedad. La presencia de Perkinsus marinus en las costas del Pacífico mexicano en los estados de Nayarit y Sonora son por efecto de transfaunación. Con el análisis del gen 18S de Urastoma sp. de Nayarit y Tabasco, se puede decir que la especie de Urastoma sp. del Golfo de México y del Pacífico pudieran ser del mismo género y probablemente de la misma especie. La presencia de Urastoma sp. en las costas del Pacífico mexicano, en el estado de Nayarit y en el Golfo de México, en el estado de Tabasco, se deben a un efecto de transfaunación. 44

45 CONCLUSIONES Los registros de movimientos de Crassostrea virginica del Golfo de México hacia Nayarit, así como de Louisiana hacia la costas de Sonora y entre las regiones de Nayarit, Sinaloa, Sonora y Baja California Norte contribuyen a explicar la distribución actual de Perkinsus marinus en las costas del Pacífico mexicano y la presencia de éste por transfaunación. La similitud de las secuencias de Urastoma sp. de los estados de Tabasco y Nayarit junto con las evidencias de los movimientos registrados por el CESANAY de lotes de ostión de la laguna de Tamiahua en el estado de Veracruz hacia Nayarit, sustentan la evidencia de que se trata probablemente del mismo género y especie de Urastoma sp. encontrado, tanto en la costa del golfo de México como en el Pacífico mexicano, resultado de un proceso de transfaunación. Son necesarios más estudios taxonómicos de los organismos del género Urastoma para determinar si existen más especies dentro de éste o si las diferencias pudieran estar dadas por variaciones dentro de la especie, debido a su distribución geográfica. 45

46 CONCLUSIONES La implementación de medidas de control para transfaunación, que consisten en: tiempos de cuarentena, certificación sanitaria de lotes y capacitación de productores y comerciantes, sumado a las buenas prácticas de manejo tales como evitar desechar ostiones muertos, vísceras o conchas a las orillas o dentro de los cuerpos de agua evitando así la dispersión de parásitos que pudiesen tener un efecto negativo en las producciones y los ecosistemas. 46

47 GRACIAS! 47

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49 GRACIAS! 49

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