RANTES, MCP-1, SUSTANCIA P Y PROTEINA C REACTIVA EN PACIENTES ASMÁTICOS INFECTADOS POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO

Transcripción

1 REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRÍA EN BIOLOGÍA - MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA RANTES, MCP-1, SUSTANCIA P Y PROTEINA C REACTIVA EN PACIENTES ASMÁTICOS INFECTADOS POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO Trabajo de grado para optar al Título de Magíster Scientarum en Biología Mención - Inmunología Básica. Autora: Lcda. Jennifer Gotera. C.I Tutora: Dra. Nereida Valero. C.I Maracaibo, 19 de Septiembre de 2008.

2 II RANTES, MCP-1, SUSTANCIA P Y PROTEINA C REACTIVA EN PACIENTES ASMÁTICOS INFECTADOS POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO Lcda. Jennifer L. Gotera Z. C.I: Urbanización Urdaneta Vereda 45 casa 8. Sabaneta Telf: (0261) Cel: (0414) Correo Electrónico: jennifergotera@hotmail.com Tutora: MgSc. Nereida Valero. C.I:

3 REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRÍA EN BIOLOGÍA - MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA III ACTA VEREDICTO En el día de hoy, 19 de Septiembre de 2008, se constituyeron los siguientes profesores: Dr. Héctor Pons C.I: (Coordinador), Dr. Heberto Suárez C.I: (Jurado Principal), Dra. Francisca Monsalve C.I: (Jurado Principal), Dra. Nereida Valero C.I: (Jurado Suplente), nombrados como jurado por el Consejo Técnico de la División de Estudios para Graduados de esta Facultad en sesión Nº de fecha 10 de Septiembre de 2008, para conocer y evaluar el Trabajo de Grado titulado: RANTES, MCP-1, SUSTANCIA P Y PROTEINA C REACTIVA EN PACIENTES ASMÁTICOS INFECTADOS POR VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO, presentado por la maestrante: Lcda. Jennifer Lucila Gotera Zambrano C.I: , para optar al grado de MAGISTER SCIENTARUM EN BIOLOGÍA MENCIÓN INMUNOLOGÍA BÁSICA, siendo las 4:00 de la tarde en el Salón Nº 01, situado en el Edificio Grano de Oro. El acto se inició con la exposición de la maestrante: Lcda. Jennifer Lucila Gotera Zambrano. A continuación los miembros del jurado intervinieron, hicieron y solicitaron aclaratorias. Concluida esta sesión, el jurado se reunió a puerta cerrada para discutir sobre dicha evaluación. Acto seguido procedió a emitir el siguiente veredicto: APROBADO Luego se procedió a declarar públicamente el juicio emitido y a suscribir la presente acta EL JURADO Dr. Héctor Pons (Coordinador) C.I: Dr. Herberto Suárez (Jurado Principal) C.I: Dra. Francisca Monsalve (Jurado Principal) C.I: Dra. Nereida Valero (Jurado Suplente) C.I: Ave. Universidad Edif. Grano de Oro. Aptdo. 526 Maracaibo-Venezuela Telf. (0261) Fax:

4 IV DEDICATORIA A mi Dios por darme esa guía y luz permanente para alcanzar esta meta tan deseada. A mi padre, se que estas conmigo y eso completa mi felicidad a pesar de tu ausencia física. Te amo Papi, me haces mucha falta!!!!!!

5 AGRADECIMIENTO V - A la Dra. Nereida Valero por darme la oportunidad de trabajar en su proyecto, por ser una excelente docente, digno ejemplo de lucha y conocimiento. - A la Dra. Yraima Larreal, por su asesoría constante, y por creer siempre mí. - A mi amiga y compañera la Lcda. Alibeth Mavárez por su ayuda ilimitada durante todo este tiempo y amistad invalorable. - A la MgSc. MeryBell Maldonado por haber sido un pilar fundamental en para lograr este trabajo, por su amistad y su orientación académica. - A la MgSc. Luz Marina Espina por su colaboración y preocupación en el mantenimiento de las líneas celulares, las cuales fueron importantes para este trabajo. - Al Profesor Hector Pons, por haberme brindado su amistad, guía y sus consejos desde el comienzo de esta maestría. - Al Dr. Jesús Mosquera, por ser un docente por excelencia, digno de ejemplo y guía en todo momento. - Al Lcdo. Jhon Bermúdez por su apoyo y colaboración en la parte experimental. - Al MgSc. Ricardo Atencio, por su amistad incondicional y ayuda constante durante todo este camino. - Al MgSc. Atilio Ferrebuz, a la Dra. Yasmir Quiroz por su ayuda y siempre hacerme el camino más fácil. - A la MgSc. Alegría Levy por sus palabras de apoyo y animarme en los momentos difíciles.

6 - Al personal de la Sección de Virología del Instituto de Investigaciones Clínicas Dr. Américo Negrette por su colaboración. VI - Al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad del Zulia (CONDES) por el financiamiento del presente trabajo de investigación. - A la máxima casa de estudios, La Universidad del Zulia especialmente a la División de Postgrado de la Facultad Experimental de Ciencias por darme la oportunidad de seguir adquiriendo mas conocimientos. - Al los diferentes centros de salud por su cooperación en la adquisición de la mayoría de las muestras que formaron parte de este trabajo. - A mi mamá Lucila, el máximo apoyo en mi vida, por ser mi todo, mi mayor guía, amiga y por ser la mejor madre del mundo. También te dedico este éxito a ti. Te Amo. - A mis hermanos José Joaquín y Johana, por estar orgullosos siempre de mi y por su apoyo incondicional. - A ni nana, por estar siempre conmigo y por darme esas ganas de seguir adelante ante cualquier dificultad. - A mi sobrina bella y preciosa Alehanna, por regalarme siempre su sonrisa e inocencia, sin saber lo importante que es para mí. - Y finalmente a mi novio Carlos Eduardo, aunque estas de último en la lista, eres muy importante para mi, gracias por darme siempre una palabra de apoyo en los momentos difíciles, comprensión, y por sentirte orgulloso de tu osita preciosa.

7 INDICE DE CONTENIDO VII pág. PORTADA I FRONTISPICIO II VEREDICTO. III DEDICATORIA... IV AGRADECIMIENTOS. V ÍNDICE DE CONTENIDO.. VII ÍNDICE DE FIGURAS. VIII INDICE DE TABLAS X RESUMEN. XI ABSTRACT.. XII ABREVIATURAS. XIII I. INTRODUCCIÓN 1 II. OBJETIVOS 9 III. MATERIAL Y MÉTODOS 10 Población Estudiada.. 10 Toma de Muestra. 11 Aislamiento e Identificación Viral por Inmunofluorescencia 11 Cultivo e Infección de Monocitos.. 13 Ensayo de Proteínas por el Método de Bradford.. 14 Cuantificación de RANTES 15 Cuantificación de MCP-1 15 Cuantificación de Sustancia P.. 15 Cuantificación de la Proteína C Reactiva 16 Análisis Estadístico. 17 IV. RESULTADOS. 18 V. DISCUSIÓN.. 31 VI. CONCLUSIONES 36 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 37 ANEXOS 45

8 ÍNDICE DE FIGURAS VIII Fig. 1. Distribución de la población estudiada de pacientes asmáticos y no asmáticos infectados por el virus sincicial respiratorio (VSR).18 Fig. 2. Concentraciones séricas de RANTES en pacientes asmáticos y no asmáticos 19 Fig. 3. Concentraciones séricas de RANTES en pacientes asmáticos infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR) y en no asmáticos con o sin infección por VSR 20 Fig. 4. Concentraciones séricas de RANTES según el tipo de infección: viral y mixta y según el agente causal: VSR y otros virus respiratorios 21. Fig. 5. Concentraciones séricas de MCP-1 en pacientes asmáticos y no asmáticos...22 Fig. 6. Concentraciones séricas de MCP-1 en pacientes asmáticos infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR) y en no asmáticos con o sin infección por VSR.. 23 Fig. 7. Concentraciones de RANTES en sobrenadante de cultivo de monocitos humanos infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR) 25 Fig. 8. Concentraciones de MCP-1 en sobrenadante de cultivo de monocitos humanos infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR).. 26 Fig. 9. Concentraciones de MCP-1 en sobrenadantes de cultivo de monocitos de individuos asmáticos infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR)..27 Fig. 10. Concentraciones de Sustancia P en sobrenadantes de monocitos humanos infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR) 28 Fig. 11. Concentraciones de Sustancia P en sobrenadantes de monocitos de individuos asmáticos infectados o no por el virus sincicial respiratorio (VSR).29 Fig. 12. Concentraciones de Sustancia P en sobrenadante de células de HEp-2 infectadas o no por el virus sincicial respiratorio (VSR) 30

9 Gotera Z. Jennifer G. RANTES, MCP-1, SUSTANCIA P Y PROTEINA C REACTIVA EN PACIENTES ASMATICOS INFECTADOS CON VIRUS SINCICIAL RESPIRATORIO. Trabajo presentado para optar el Grado de Magíster Scientarum en Biología, Mención Inmunología Básica. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de Estudios para Graduados. Maestría en Biología Mención Inmunología Básica. Maracaibo, Venezuela págs (46). IX RESUMEN En actualidad, numerosos estudios clínico-epidemiológicos a nivel mundial, han identificado al Virus Sincicial Respiratorio (VSR) como uno de los principales patógenos en infantes y niños como primera causa de bronquiolitis severa y neumonía, predisponiéndolos a un subsiguiente desarrollo de asma. Aunque se ha descrito una fuerte asociación entre la infección por VSR y el desarrollo de sibilancias e hiperreactividad bronquial, aun se desconoce el papel de este virus en la patogénesis del asma. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue determinar las concentraciones de RANTES, MCP-1, SP y PCR en pacientes asmáticos infectados por VSR. Se seleccionaron 31 pacientes con infección respiratoria aguda (15 asmáticos y 16 no asmáticos) sin distingo de edad y sexo y 10 individuos controles. Se tomaron muestras de tracto respiratorio y sangre sin anticoagulante. Se utilizó cultivo de células HEp-2 para el aislamiento e identificación del VSR por la técnica de Inmunofluorescencia Directa. La determinación de RANTES, MCP-1, SP y PCR se realizó a través de la técnica de ELISA. RANTES, MCP-1 y SP se cuantificaron en sobrenadantes de cultivo de células HEp-2 y de monocitos humanos (provenientes de individuos normales y con antecedente de asma) a las 24 horas post infección. Se observaron concentraciones aumentadas (p<0,01) de RANTES y MCP-1 en pacientes asmáticos viralmente infectados. Las concentraciones séricas de PCR y SP permanecieron inalteradas. En los cultivos se obtuvieron concentraciones elevadas (p<0,01) de RANTES, MCP-1 y SP en monocitos infectados por el virus, mientras que en HEp-2 solo se observaron cambios importantes en las concentraciones de SP. Estos datos sugieren la posibilidad de la contribución de estas quimiocinas y de la SP en la patogénesis del asma ante la presencia del VSR, no así de la PCR la cual no evidencio relación a la presencia de infección por VSR, ni de asma. Palabras Claves: VSR, Asma, Sustancia P, MCP-1, RANTES, PCR Correo Electrónico: jennifergotera@hotmail.com

10 Gotera Z. Jennifer G. RANTES, MCP-1, SUBSTANCE P AND REACTIVE PROTEIN C IN ASTHMATIC PATIENTS INFECTED WITH THE RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS. Trabajo presentado para optar el Grado de Magíster Scientarum en Biología, Mención Inmunología Básica. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de Estudios para Graduados. Maestría en Biología Mención Inmunología Básica. Maracaibo, Venezuela págs (46). X ABSTRACT At the present time numerous clinical and epidemiological studies in the world, have identified the Respiratory Syncytial Virus as a the main pathogen in infants and children as the first cause of severe bronchiolitis and pneumonia and it is able to predispose children to a subsequent development of asthma. Although a strong association between the infection by VSR and the development of sibilances and bronchial hyperreactivity has been found there is not a clear information regarding the role of this virus in the pathogenesis of asthma. Therefore, the objective of this work was to determine the concentrations of RANTES, MCP-1, Substance P (SP) and Reactive Protein C (RPC) in asthmatic patients infected by RSV. Thrirty one patients with acute respiratory infection (15 asthmatic and 16 nonasthmatic), without distintion of age and sex, and 10 individual controls were selected. Samples from the respiratory tract and blood, without anticoagulant, were taken. Culture of HEp-2 cells was used for the viral isolation and the identification of the VSR by the technique of Direct Immunofluorescence. The determination of RANTES, MCP-1, SP and RPC was done through the ELISA technique. RANTES, MCP-1 and SP were determination the supernatant of cultures of HEp-2 cells and of monocytes (originating from normal individuals and those with a history of asthma) 24 hours after the infection. Increased concentrations (p<0.01) of RANTES, MCP-1 y SP in asthmatic patients virally infected were detected. The seric concentrations of PCR and SP remained inaltered. In cultures eleveted levels of RANTES, MCP-1 and SP were found in monocytes infected with the virus. However in HEp-2 only significant changes were detected in the SP concentrations. These data suggest the possibility of the contribution of these chimiokines and SP in the pathogenesis of asthma in the presence of RSV, but not in the presence of RPC which was not related both to the presence of the infection witch RVS and asthma. Key Words: RSV, Asthma, Substance P, MCP-1, RANTES, CRP jennifergotera@hotmail.com

11 LISTA DE ABREVIATURAS XI VSR: Virus Sincicial Respiratorio. IRA: Infección Respiratoria Aguda. PCR: Proteína C Reactiva. RANTES: Regulated on activaction, normal T cell - expressed and secreted protein. MCP-1: Monocyte chemotactic protein-1. SP: Sustancia P. HRB: Hiperreactividad Bronquial. IFD: Inmunofluorescencia directa. Hep-2: Línea celular de carcinoma laríngeo. CMN: Células Mononucleares. UFP: Unidades Formadoras de Placas PI: Post-infección SFB: Suero Fetal Bovino