Estudio de la auto(in)compatibilidad en albaricoquero (Prunus armeniaca): estructura del locus-s, genotipado y análisis de mutantes.

Transcripción

1 Estudio de la auto(in)compatibilidad en albaricoquero (Prunus armeniaca): estructura del locus-s, genotipado y análisis de mutantes. S. Vilanova 1, C.Romero 2, M.L. Badenes 2 1 Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana, Universidad Politécnica de Valencia, Camino de Vera 14, Valencia 2 Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Moncada, Valencia Palabras clave: alelos S, S-RNasa, SFB, F-Box, incompatibilidad gametofítica, diversidad alélica Resumen Se ha estudiado el mecanismo de autoincompatibilidad gametofítica en albaricoquero (Prunus armeniaca) mediante distintas aproximaciones. Primero se ha detectando en una genoteca BAC el locus-s. El análisis del mismo ha dado como resultado la identificación y caracterización de los genes S-RNasa y SFB en albaricoquero por primera vez. Gracias a esta caracterización se han podido desarrollar cebadores que permiten la identificación de alelos de auto(in)compatibilidad en albaricoquero de una manera rápida y sencilla mediante PCR. Finalmente el análisis de dos mutantes autocompatibles naturales ha permitido profundizar en el estudio de las bases moleculares del mecanismo de autoincompatibilidad, detectando dos mutaciones de diferente naturaleza en el factor del polen: una causada por una delección en el gen SFB y otra asociada a una mutación en un factor adicional que se encuentra fuera del locus-s. INTRODUCCIÓN La autoincompatibilidad gametofítica (AG) es un mecanismo ampliamente utilizado en plantas, controlado por un único locus multialélico llamado locus-s, que previene la autofecundación y promueve la polinización cruzada (de Nettancourt, 2001). Este locus contiene al menos dos genes ligados; uno que codifica glicoproteínas con actividad RNasa en el pistilo (S-RNasa) y otro que codifica una proteína F-Box que se expresa en el polen (SFB; S-locus F-Box). La autoincompatibilidad floral complica las prácticas de cultivo, ya que obliga a la introducción de polinizadores en campo. Este carácter es además especialmente importante para la realización de cruzamientos controlados entre genotipos seleccionados para programas de mejora genética. La determinación del genotipo de compatibilidad mediante el método tradicional es lenta y es necesario disponer de árboles adultos. Recientemente la caracterización molecular de los alelos-s ( Ushijima et al., 1998; Ma y Oliveira, 2001) han proporcionado un método más rápido para la identificación mediante PCR. En este trabajo se describe la detección y el análisis del locus-s en albaricoquero, la identificación y caracterización de los genes S-RNasa y SFB responsables de la autoincompatibilidad gametofítica, el desarrollo de cebadores específicos para el genotipado de los alelos S mediante PCR y el estudio de las bases moleculares del mecanismo de la autoincompatibilidad gametofítica mediante el análisis de dos mutantes autocompatibles. 1258

2 MATERIAL Y MÉTODOS Material vegetal Para el estudio de la estructura del locus-s se usaron los cultivares Harcot (S 2 S 4 ) y Goldrich (S 1 S 2 ). Para la identificación de alelos de auto(in)compatibilidad se usaron dieciséis accesiones de albaricoquero incluyendo de distintos orígenes. En el apartado de análisis de mutantes del polen se usaron los cultivares Goldrich (S 1 S 2 ), Pepito (S 2 S C ), Currot (S C S C ) y Canino (S 2 S C ), así como descendientes de los cruces realizados entre ellos. Amplificaciones mediante PCR Todos los cebadores usados para la amplificación de fragmentos mediante PCR fueron diseñados a partir de secuencias provenientes de Prunus dulcis (Ushijima et al. 2003) (Tao et al. 1999a, b), Prunus mume (Entani et al. 2003) y Prunus armeniaca. (Romero et al. 2004) (Vilanova et al. 2005) (Vilanova et al. 2006). Las amplificaciones se llevaron a cabo usando los programas de PCR descrito por Sonneveld et al. (2003), Romero et al. (2004), Vilanova et al. (2005) y Vilanova et al. (2006). Análisis de las secuencias, alineamientos y búsquedas de homologías Las secuencias se unieron mediante el programa informático Bioedit (Hall, 1999). Los cebadores se diseñaron usando el programa Primer3 (Rozen y Skaletsky,2000). El alineamiento de las secuencias nuceotídicas y aminoacídicas fueron realizadas mediante los programas CLUSTALW y CLUSTALX (Thompson et al. 1997) respectivamente. La búsqueda de homologías se realizó mediante BLASTX y BLASTN (Altschul et al.1990). RT-PCR Se extrajo RNA total de hojas, granos de polen y estilos del cultivar Goldrich (S 1 S 2 ) siguiendo el método descrito por Salzman et al (1999). La amplificación se llevó a cabo usando el programa de PCR descrito por Romero et al. (2004). Polinización y ensayo de crecimiento del tubo polínico Los ensayos de autocompatibilidad se llevaron a cabo en campo mediante la autopolinización los descendientes de los cruces. Para ello se embolsaron varias ramas que contenían entre botones florales por árbol y se analizó el cuajado y número de frutos obtenido. El ensaya del crecimiento del tubo polínico se realizaron mediante el cruzamiento controlado y posterior tinción con azul de anilina. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Detección y análisis del locus-s en albaricoquero: identificación y caracterización de los genes S-RNasa y SFB El sistema de autoincompatibilidad gametofítica en rosáceas está controlado por dos genes localizados en el locus-s: una S-RNasa que se expresa en el pistilo y un gen F- box (SFB) que se expresa específicamente en polen. Sin embargo estos genes todavía no habían sido descritos en albaricoquero (Prunus armeniaca). En este trabajo se ha secuenciado un total de 21 Kb de la región del locus-s en tres diferentes haplotipos de albaricoquero (Fig. 1). Estos fragmentos contenían genes homólogos a los genes S-RNasa y F-box de otras especies de Prunus, manteniendo las características típicas de los genes y sus dominios aminoacídicos. La distancia física entre estos dos genes pudo ser 1259

3 determinada de manera exacta en el haplotipo S2 (2,9 Kb) y aproximadamente inferida en el haplotipo S1 (<49 Kb), lo que confirma que estos genes se encuentran ligados físicamente. El análisis de la región 5 de las S-RNasas indica la presencia de de una región conservada aguas arriba de la caja TATA. Los tres alelos de la S-RNasa identificados (S1, S2 y S4) presentan secuencias con una alta diversidad alélica (75,3% de identidad aminoacídica). De la misma manera, las variantes alélicas del gen F-box de albaricoquero analizadas (SFB1, SFB2 y SFB4) presentan también una alta especificidad de haplotipo (79.4 % de identidad aminoacídica). Tanto los genes S 1 -RNasas y S 2 -RNasa se expresan específicamente en estilos, pero no en polen u hojas. Por otra parte, los genes SFB 1 y SFB 2 se expresan solo en polen y no en estilos ni hojas. En conclusión, nuestros resultados proveen evidencias de que los genes SFB y S- RNasa identificados podrían ser candidatos a ser los determinantes S para el pistilo y el polen del sistema de autoincompatibilidad gametofítica de Prunus armeniaca. Además, la caracterización de los genes del locus-s permite el desarrollo de cebadores de PCR específicos con los cuales podremos determinar de una manera rápida los genotipos S. Identificación de alelos de auto(in)compatibilidad en albaricoquero mediante PCR y análisis de secuencia. En las accesiones de albaricoquero evaluadas en este estudio, se amplificaron mediante PCR fragmentos que contenían el primer y segundo intrón de las S-RNasa.Estos fragmentos fueron asignados a un alelo-s en particular (S 1 a S 7 y S c ) por comparación con los genotipos S conocidos y siguiendo la nomenclatura establecida por Burgos et al. (1998). La figura 2 muestra que la mayoría de los alelos S pudieron ser distinguidos mediante el tamaño de los fragmentos amplificados del primer intrón (desde 250 a 400 pb), excepto los alelos S 1 y S 7. El segundo intrón se amplificó usando los cebadores Pru-C2/Pru-C4R. Se encontraron dos alelos-s en la mayoría de las accesiones excepto en los cultivares homocigotos para el alelo S c. La identificación y clonación de los primeros tres alelos de S-RNasa en albaricoquero (Romero et al. 2004) nos permitió diseñar cebadores específicos (SRc- F/SRc-R) para la amplificación del primer intrón. Sin embargo, los cebadores diseñados por Tao et al (1999a) para amplificar el segundo intrón (Pru-C2/Pru-C4R) parecen estar mejor conservados en todas las especies de Prunus analizadas y por tanto pudieron ser utilizados en albaricoquero. La autocompatibilidad de dos selecciones de albaricoquero está asociada a dos mutaciones de diferente naturaleza en el factor del polen. La pérdida de función del factor del polen en mutantes autocompatibles en Prunus han sido asociadas a delecciones o inserciones en algunos haplotipos de los genes F-Box. En este trabajo se han estudiado dos cultivares autocompatibles de albaricoquero, Currot (S c S c ) y Canino (S 2 S c ), los cuales comparten el haplotipo de compatibilidad S c. Los análisis de las secuencias muestran que mientras la S c -RNasa se mantiene intacta, el gen SBF c presenta una inserción de 358 pb, lo que da lugar a la expresión de una proteína truncada. La alteración de este gen está asociada con la rotura del sistema de autoincompatibilidad, apoyando las evidencias previas que apuntaban al gen SFB como el factor del polen dentro del sistema de autoincompatibilidad de Prunus. 1260

4 Por otra parte, el análisis de las progenies de Canino mediante PCR muestra que los granos de polen que contienen el haplotipo S 2 son también capaces de superar la barrera de la autoincompatibilidad (Fig. 3). Sin embargo no se han detectado alteraciones en los genes S 2 -RNasa ni SFB 2, ni existe evidencia de duplicación génica. Estos resultados sugieren que el cultivar Canino posee una mutación adicional, no ligada al locus-s, que causa la pérdida de la autoincompatibilidad del polen cuando está presente en el. En conclusión, estos resultados apoyan la hipótesis propuesta de la existencia de factores externos al locus-s necesarios para el funcionamiento de la autoincompatibilidad gametofítica en Prunus. Referencias Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, and D.J. Lipman Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: Burgos, L., O. Pérez-Tornero, J. Ballester, and E. Olmos Detection and inheritance of stylar ribonucleases associated with incompatibility alleles in apricot. Sex. Plant Reprod. 11: De Nettancourt D Incompatibility and incongruity in wild and cultivated plants. Springer, Berlin, pp Entani, T., Iwano, M., Shiba, H., Che, F.S., Isogai, A., Takayama, S Comparative analysis of the self-incompatibility (S-) locus region of Prunus mume: identification of a pollen-expressed F-box gene with allelic diversity. Genes to Cells 8: Hall, T.A BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41: Ma, R.C. and M.M. Oliveira Molecular cloning of the self-incompatibility genes S1 and S3 from almond (Prunus dulcis cv. Ferragnès). Sex. Plant Reprod. 14: Romero, C., S. Vilanova, L. Burgos, J. Martínez-Calvo, M. Vicente, G. Llácer, and M.L. Badenes Analysis of the S-locus structure in Prunus armeniaca L. Identification of S-haplotype S-RNase and F-box genes. Plant Mol. Biol. 56: Rozen, S. and Skaletsky, H.J Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz, S., Misener, S. (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp Salzman, R.A., Fujita, T., Zhu-Salzman, K., Hasegawa, P.M. and Bressan R.A An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Reptr 17: Sonneveld, T., K.R. Tobutt, and T.P. Robbins Allele-specific PCR detection of sweet cherry self-incompatibility (S) alleles S1 to S16 using consensus and allelespecific primers. Theor. Appl. Genet. 107(6): Tao, R., H. Yamane, and A. Sugiura. 1999a. Molecular typing of S-alleles through identification, characterization and cdna cloning for S-RNAses in sweet cherry. J. Am. Soc. Hort. Sci. 124(3): Tao, R., H. Yamane, and H. Akira. 1999b. Cloning and genomic DNA sequences encoding S1-, S3-, S4-, and S6-RNases (Accessions Nos. AB031815, AB031816, AB031817, AB031818) from sweet cherry (Prunus avium L.). Plant Physiol. 121:1057. Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 25:

5 Ushijima K., Sassa H., Dandekar A.M., Gradziel, T.M. and Tao, R Structural and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond: Identification of a pollen-expressed F-box gene with haplotype-specific polymorphism. Plant Cell 15: Ushijima, K., Sassa, H., Tao, R., Yamane, H., Dandekar, A.M., Gradziel, T.M. and Hirano, H Cloning and characterization of cdnas encoding S-RNases from almond (Prunus dulcis): primary structural features and sequence diversity of the S- RNases in Rosaceae. Mol Gen Genet 260: Vilanova S, Romero C, Burgos L, Llácer G, Badenes ML Identification of Self- (in)compatibility Alleles in Apricot (Prunus armeniaca L.) by PCR and Sequence Analysis. J Am Soc Hort Sci 130(6): Vilanova, S., C. Romero, D. Abernathy, A.G. Abbott, L. Burgos, G. Llacer, and M.L. Badenes Construction and application of a bacterial artificial chromosome (BAC) library of Prunus armeniaca L. for the identification of clones linked to the self-incompatibility locus. Mol. Gen. Genomics. 269: Vilanova, S., M.L. Badenes, L. Burgos, Martinez-Calvo, J, G. Llacer, and C. Romero. Self-comaptibility of two apricot selections is associated with two pollen part mutations of different nature Plant Physiol. 142: SFB 1 // S 1 S 1 -RNasa Ret SFB 2 SFB 4 S 2 // S 4 S 2 -RNasa S 4 -RNasa ORFs Rep. directas Palindromes Rep. invertidas Microsatelites Retroelementos 0.5 Kb Fig.1. Estructura genómica del locus-s de Prunus armeniaca de los haplotipos S 1, S 2 y S 4. Las cajas grises representan las ORFs y la orientación de los genes S-RNasa y SFB. 1262

6 A B Fig. 2. Amplificación PCR de (Prunus armeniaca) con los cebadores consenso del primer intrón (A) y del segundo intrón (B) Las muestras son: (M) marcador de 100 bp, (1 a 16) accesiones de P. armeniaca Fig. 3. Análisis de segregación de los alelos-s de la progenie procedente del cruce Goldrich x Canino. A. Amplificación del primer intrón de las S-RNasas. B. Amplificación de la inserción del gen SFB c 1263