APLICACIÓN DE EXTRACTO DE Chrysanthemum morifolium AL CULTIVO in vitro DE Anthurium andreanum L. VARIEDAD Anthapck

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2 APLICACIÓN DE EXTRACTO DE Chrysanthemum morifolium AL CULTIVO in vitro DE Anthurium andreanum L. VARIEDAD Anthapck Guevara Valencia Marina, López Rivas Grisel, Ortega Jiménez Rosalba, Karla Díaz Castellanos, Pastelín Solano Miriam y Castañeda Castro Odón Laboratorio de Biotecnología y Criobiología vegetal, Facultad de Ciencias Químicas Universidad Veracruzana INTRODUCCIÓN El anturio (Anthurium andraeanum Linden) es la especie más importante desde el punto de vista económico que cuenta con la mayoría de las variedades comerciales. Se caracteriza por la belleza y durabilidad de sus flores, exótico follaje y espatas grandes. La producción y la calidad de esta especie se mejora ajustando las técnicas de cultivo in vitro y optimizando el proceso del cultivo (Murguía González, 1996). Mediante el empleo de los métodos de mejora de la especie Anthurium andreanum L., se han obtenido un sinnúmero de cultivares que han sido empleados como flor de corte o para maceta, las que se comercializan a través de mundo. La demanda de este material propagado y de los nuevos cultivares es muy amplia, alcanzando altas cotizaciones en el mercado internacional (Kuenhnle, A.R. 1991). La propagación tradicional de esta especie mediante hijuelos y segmentos nodales, suele ser lenta y poco rentable (Montes, S. 1999), por lo que las técnicas de reproducción in vitro han sido ampliamente utilizadas con vistas a incrementar las tasas de multiplicación en menor tiempo. Las alcamidas son metabolitos secundarios que comprenden un grupo de aproximadamente 200 compuestos distribuidos en las plantas. Se demostró que las alcamidas tienen un efecto favorable sobre el desarrollo de la raíz de plantas cultivadas in vitro y consecuentemente en el desarrollo posterior de las plantas, su importancia radica en la variedad de efectos, ya que su actividad depende de la estructura y el número de enlaces o ligaduras dobles que presenten. (Ramírez-Chávez, 2004). Un ejemplo de los usos de las alcamidas se observa en el control de los procesos de división y diferenciación celular, específicamente para inducir la formación de raíces y follaje en especies ornamentales. Esta es una función que podría llevarse a cabo mediante la aplicación de alcamidas, solas o en combinación con otras fitohormonas como las auxinas y las citocininas (López-Bucio, 2007; Campos Cuevas, 2008). En Chrysanthemum morifolium se han identificado isobutilamidas identificadas como la N- isobutil-2e,4e,10e,12z-tetradecatetraen-8-inamide, N-isobutil-2E,4E,12-tetradecatrien-10- diinamide y N-isobutil-2E,4E,12E-tetradecatrien-8,10-diinamide presentes en raíces y flores de color amarillo con insaturaciones conjugadas (Tsao, 2003). 2

3 El anturio tienen una alta demanda en el mercado nacional e internacional, alcanzando grandes cotizaciones en el mercado internacional que requiere proveer flores de calidad a un mercado cada vez más exigente. El desarrollo de esta especie suele ser lento y poco rentable por lo que las técnicas de reproducción in vitro han sido ampliamente utilizadas, con vistas a implementar las tasas de multiplicación en menor tiempo OBJETIVO Analizar la capacidad de crecimiento in vitro de anturio (Anthurium andreanum L.) variedad Anthapck empleando medio enriquecido con extracto de inflorescencias de crisantemo (Chrysanthemum morifolium). MATERIALES Y MÉTODOS Para la obtención del extracto, se emplearon crisantemos (Chrysanthemum morifolium) con flores de color amarillo. A partir de las plantas frescas se separaron 568 g de inflorescencias que se trituraron y maceraron en 2 L de diclorometano por 30 días, dejándose en reposo a 4º C. El volumen se redujo empleando un rotavapor (SEV serie A-402-2) hasta reducir el volumen a 10 ml, posteriormente se evaporó a sequedad para eliminar totalmente el diclorometano. De este extracto se pesó 0.1 g disolviéndose en 25 ml de etanol absoluto. En una campana de flujo laminar y bajo estrictas condiciones de esterilidad, se realizó la purificación del extracto anterior utilizando un filtro milipore con un poro de 0.20 µ, con el propósito de homogenizar el tamaño de partícula para facilitar el manejo del extracto. La identificación de alcamidas en el extracto de crisantemo se realizó por medio de cromatografía de capa fina (CCF), aplicando con una jeringa Hamilton 500 µl del extracto crudo en un cromatofolio, como fase móvil se utilizó hexano:acetato de etilo (2:1 v/v); como testigo se utilizó afinina (N isobutil 2E, 6Z, 8E decatrien amida); para el revelado se empleó una solución de primulina al 0.1% en solución acuosa y se observó bajo luz UV a una longitud de onda de 221 nm. Posteriormente el sílice donde están localizas las alcamidas se suspende en acetato de etilo, separando por centrifugación la sílica; el líquido se evapora para disolverse en un mililitro de acetona, de donde se inyectará 1 µl en cromatografía de gases acopada a masas (GC-MS) utilizando cromatógrafo de gases (Hewlett Packard 5890), en el que se instaló una columna capilar Ultra Z de 25 m por 0.2 mm Hewlett Packard por el sistema de inyección sin partición, la detección se realizó por ionización de flama, para la caracterización de las alcamidas presentes en los extractos. 3

4 Se empleo MS (Murashige y Skoog, 1962), como medio de cultivo, adicionando 0.25 mgl -1 de Na 2 MoO 4 2H 2 O, 2 mgl -1 de glicina, 0.5 mgl -1 piridoxina, 0.1 mgl -1 de tiamina, 0.5 mgl -1 de ácido nicotínico, 100 mgl -1 de inositol, 20 gl -1 de sacarosa y como medio gelificante 2 gl -1 de fitagel; el ph se ajustó a 5.7 utilizando un potenciómetro (Hanna Instruments 211) y se esterilizó a 122 ºC durante 15 minutos (equivalente a 1.5 Kg de presión). Después de esterilizar el medio y dentro de la campana de flujo laminar se adiciono el volumen de extracto de crisantemo para cada tratamiento, cuando el medio de cultivo aun permanecía sin solidificar. Una vez adicionados se mezclaron de manera circular para su homogenización y se distribuyeron en frascos previamente esterilizados y etiquetados. Los tratamientos ensayados fueron volúmenes de 100, 200, 300 µl de extracto por cada 50 ml de medio de cultivo mas un tratamiento testigo con ausencia de extracto. En campana de flujo laminar y empleando material de disección estéril, a partir de un cultivo de anturio (Anthurium andreanum L.) establecido, se seccionaron brotes de aproximadamente 10 mm de altura. Se realizaron diez repeticiones con cuatro explantes por cada uno de los tratamientos. Para valorar el crecimiento de las plantas, se efectuaron cinco evaluaciones semanales durante un mes. Para conocer el desarrollo de los explantes, se consideró la altura (mm), el vigor de la vitroplanta en base a la forma característica de la hoja, la coloración verde intensa, el tallo erecto y el número de brotes formado; estos parámetros permitirán comprobar el efecto estimulante del extracto crudo de Chrysanthemum morifolium sobre el desarrollo de plantas in vitro de Anthurium andreanum L. variedad Anthapck. La evaluación estadística se realizó empleando el programa estadístico MINITAB 15. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La valoración de CCF permitió identificar dos alcamidas observándose la presencia de bandas de color púrpura bajo luz UV, semejantes a la del testigo (afinina). Los resultados obtenidos con el GC-MS se compararon con la base de datos NIST08.L, permitiendo la caracterización de la N-isobutiltetradeca-2E,4E,10E,12Z-tetraenamida con ión molecular de 275 m/z, fm: C 18 H 29 NO y una abundancia relativa de 3% y los iones 166 (C 10 H 16 NO) 40%, 67 (C 5 H 7 ) 100% y la N-isobutil tetradeca-2e, 4E-dien-8-inamida con ión molecular de 275 m/z, fm: de C 18 H 29 NO y una abundancia relativa de 4% y los iones 166 (C 10 H 16 NO) 75% y 109 (C 8 H 13 ) 25%, correspondientes a la estructuras fragmentadas propuestas; 4

5 éstos resultados coinciden con los obtenidos por Tsao, 2003; al identificar dos alcamidas de catorce carbonos, la primera olefínica y la segunda acetilénica. El experimento de cultivo in vitro donde se adiciono 100 y 200 µl del extracto crudo de crisantemo, de manera general favoreció el desarrollo de los brotes de anturio, no así donde se aplicó 300 µl ya que estos explantes presentaron un desarrollo menor en relación a los cultivados donde el medio carecía del extracto. La diferencia en el crecimiento entre las vitroplantas tratadas se observó a partir de la tercera semana; esta respuesta puede atribuirse al hecho de que los explantes tienen una etapa de acondicionamiento a las condiciones de cultivo y la respuesta a los tratamientos ocurre posteriormente. Con respecto al crecimiento donde se aplicó 200 µl de extracto de crisantemo, los explantes de anturio desarrollaron una talla promedio de 9.8 mm, en el caso del cultivo donde se adicionó 100 µl, se alcanzó un promedio de 8.1 mm, éstos tratamientos superaron la altura desarrollada por los explantes cultivados en el tratamiento testigo (Figura 1). Altura (mm) µl 200 µl 300 µl Testigo Extracto de crisantemo Figura 1. Evaluación de altura de Anthurium andreanum L. variedad Anthapck cultivados con extracto de crisantemo. Para determinar el tratamiento que optimizaba la respuesta de crecimiento no solo se evaluó la altura, también se consideró la fortaleza que presentaban los explantes, es cierto que con la adición de 100 µl, se consiguió elevar el crecimiento, no obstante los explantes cultivados formaron hojas verdes pequeñas, afiladas, con tallos de apariencia frágil, atípicos de la planta madre de donde fueron subcultivados. Sin embargo los explantes cultivados con 200 µl del extracto de crisantemo, desarrollaron hojas de coloración verde intenso, acorazonadas, soportadas por un Figura 2. A. andreanum L. var. Anthapck cultivados con 200 µl del extracto de crisantemo. tallo fuerte y firme que le proporcionaba a las plantas un buen sostén (Figura 2). Con 5

6 respecto al desarrollo de brotes los tratamientos aplicados en este experimento no consiguieron esta respuesta. El análisis de Varianza (ANOVA), señala que la adición 200 µl del extracto de crisantemo, maximiza la variable de respuesta, ya que mostró mayor efectividad en el desarrollo de las vitroplantas a 30 días de cultivo. Este trabajo es la primera aportación que se realiza para conocer la capacidad estimulante de crecimiento, que presenta las alcamidas contenidas en el extracto de crisantemo como una alternativa para hacer mas eficiente las técnicas de cultivo in vitro de anturio. CONCLUSIONES El cultivo in vitro de Anthurium Andreanum L. variedad Anthapack muestra resultados positivos cuando se adicionó al medio 200 µl de extracto presentando el mejor desarrollo con altura promedio de 95 mm, con tallos firmes, con hojas bien definidas de buen tamaño y coloración verde intensa, después de 30 días de cultivo, por lo que se considera en este estudio el tratamiento con mayor efectividad. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Campos-Cuevas J., Pelagio-Flores R., Raya-González J., Méndez-BravoA., Ortiz-Castro R., López-Bucio J. (2008). Tissue culture of Arabidopsis thaliana explants reveals a stimulatory effect of alkamides on adventitious root formation and nitric oxide accumulation Plant Science 174 pp López-Bucio J., Alcamidas: hacia la nueva era agrícola. Ciencia y Desarrollo, Molina- Torres Jorge y García-Chávez Abraham, (2001). Alcamidas en plantas: distribución e importancia. Avance y perspectiva vol. 20: Montes, S., Morales, C. y Bell E. (2004). Regeneración de plantas de Anthurium andreanum Lind mediante el empleo de cultivo in vitro. Cultivos Tropicales Vol. 25 N 3 p Murashige T. & F. Skoog. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: Murguía González, J. (1996). El cultivo de anturios. Universidad Veracruzana. Boletín Agropecuario Cordoba de 4: Ramírez-Chávez E., López-Bucio J., Herrera-Estrella L., Molina-Torres J. (2004). Alkamides isolated from plants promote growth and alter root development in Arabidopsis. Plant Physiology. 134(3): Tsao, R.; Attygalle AB.; Schroeder FC.; Marvin CH.; McGarvey BD., Isobutylamides of Unsaturated Fatty Acids from Chrysanthemum morifolium. Associated with Host-Plant Resistance against the Western Flower Thrips. J. Nat. Prod. 2003, 66,

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