Terapia génica del síndrome de Wiscott-Aldrich: hacia la expresión fisiológica del gen terapéutico
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- María Antonia Tebar Redondo
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1 Terapia génica del síndrome de Wiscott-Aldrich: hacia la expresión fisiológica del gen terapéutico Dr. Francisco Martín Molina. Gene and Cell Therapy Group Centro Pfizer-Universidad de Granada-Consejería de Salud de Genómica e Investigación oncológica (GENYO) Parque Tecnológico Ciencias de la Salud (PTS)
2 Que es la terapia génica? DISCIPLINA CUYO OBJETIVO ES LA CURA O CONTROL DE ENFERMEDADES MEDIANTE MODIFICACIÓN GENÉTICA Vectores: herramientas utilizadas para introducir el material genético en las células deseadas. Virales (oncoretrovirus, lentivirus, adenovirus, adenoasociados, otros) No virales (ADN desnudo, Liposomas, etc) Células diana. Son las células a modificar por el vector Cáncer: Células tumorales o células del sistema inmune. Inmunodeficiencias: Células hemotopoieticas multipotenciales. Enfermedades autoinmunes: Células del sistema inmune.
3 LENTIVIRAL VECTORS: Efficacy and safety
4 LENTIVIRAL VECTORS: Efficacy and safety Genoma Viral
5 LENTIVIRAL VECTORS: Efficacy and safety Gen terapéutico
6 Nuestra experiencia: Terapia génica del síndrome de Wiskott-Aldrich - Inmunodeficiencia ligada al cromosoma X causada por mutaciones en el gen WASP, expresado únicamente en el sistema hematopoyético. - La proteína WASP hace de adaptador entre señales extracelulares y reorganización del citoesqueleto. WASP es importante: Señalización Migración Sinapsis inmunológica Pacientes con WAS Infecciones recurrentes Hemorragias Leucemias Tratamiento Trasplante de médula Eliminación del bazo Inmunoglobulinas
7 Antecedentes Terapia génica de WAS y otras inmunodeficiencias Primarias Células troncales hematopoyéticas de los pacientes (HSCs) Oncoretrovirus (RVs) cdna expresando la versión correcta del gen mutado en la inmunodeficiencia
8 Células troncales hematopoyéticas de los pacientes Células troncales (HSCs) hematopoyéticas Vectores retrovirales expresando la proteína que les falta a los pacientes
9 Ensayos clínicos de TG utilizando vectores g-retrovirales (RVs) - Inmunodeficiencias primarias: - SCID-X1 (Francia e Inglaterra) - SCID-ADA (Italia) - CGD (Alemania) - WAS (Alemania) 60 de unos 70 pacientes intervenidos han corregido sus defectos funcionales y pueden vivir vidas normales o casi normales Resultados globales de supervivencia y efectos secundarios en línea con trasplante de médula haploidentico Problemas? Genotoxicidad Eficiencia/estabilidad
10 RVs: Problemas I Pérdida de la expresión del gen terapéutico - SCID-X1 (Francia e Inglaterra) - SCID-ADA (Italia) - CGD (Alemania). Silenciamiento del promotor - WAS (Alemania)
11 RV: Problemas II Desarrollo de leucemias - SCID-X1 (Francia e Inglaterra) - SCID-ADA (Italia) - CGD (Alemania) - WAS (Alemania) Gen B RRE 400bp Gag (ATGD) Gene terapéutico Gen A Activación de oncogenes Alteración de la expresión del vector dependiente del sitio de integración
12 Mejoras en los vectores retrovirales: Bioseguridad y eficiencia Promotor viral muy fuerte: Enhancer capaz de activar genes lejanos Primera generación RRE Therapeutic gene g-retrovirales (RVs) 400bp Gag (ATGD) Tercera generación RRE 400bp Gag (ATGD) Therapeutic gene g-retrovirales (RVs) Lentivirus (LVs) Alfavirus
13 Ensayos clínicos fase I/II para TG WAS (Auiti, Science 2013 & Hacein-Bey Abina, JAMA 2015) Resultados obtenidos en 10 pacientes con WAS: No Leucemias Reducción del número de infecciones, sangrados, eczema y manifestaciones autoinmunes 50% de los pacientes no requieren administración de inmunoglobulinas La microtrombocitopenia se mantiene en varios pacientes Expresión de WASP en plaquetas y células B por debajo de lo normal
14 Mutaciones en el gen WASP Ausencia de proteína o de función = Inmunodeficiencia (WAS) Reducción en la actividad = Trompocitopenia (XLT) Forma hiperactiva de la proteína = Neutropenia (XLN). Es importante mantener los niveles fisiológicos de expresión 1- Solo se debe de expresar en las células que normalmente lo expresen 2- Debe de expresar niveles parecidos al sistema hematopoyético de individuos sanos
15 Terapia celular-génica del Síndrome de Wiskott y Aldrich (WAS) Objetivo 1 Desarrollar vectores lentivirales para TG de WAS con expresión lo mas fisiológica posible Objetivo 2 Desarrollar modelos celulares humanos donde poder estudiar las estrategias terapéuticas
16 Diseño de vectores mas seguros y eficientes para TG de WAS LVs c-ets-1, PU.1, crel 0.5WW Promotor proximal WASP WASP Similar al 1.6kb_WW c-ets-1, PU.1, crel AWW Promotor proximal y alternativo WASP WASP PU.1, c-ets-2, Sp1, c-myb, AP2, GCF, C/EBP
17 LENTIVIRAL VECTORS for WAS GT Promotor WAS WASP LVs expresando el gen WASP por diferentes fragmentos de su propio promotor
18 Es específico de células hematopoyéticas? Células TWAS Fibroblastos células endoteliales Células mesenquimales Martin et al. Gene Therapy 2005
19 Expresión fisiológica? Análisis en Células T de pacientes WAS Rescate funcional de células T de pacientes WAS - Normalización de la respuesta a αcd3 (proliferación) de células T de pacientes WAS Reconstitución morfológica de células T de pacientes WAS Martin et al. Gene Therapy 2005
20 0.5_WW AWW Qué vector consigue expresar WASP de forma mas fisiológica en los diferentes linajes hematopoyéticos? hhsc 0.5_WE AWE 2 Gry x77 HSC/ WE HSC/ AWE Newborn RAG 2 -/- ; gc -/- MICE CD34+ de sangre de cordón umbilical
21 Los vectores terapéuticos incorporando el promotor alternativo expresan mas fisiológicos que los que tienen solo el promotor proximal 0.5_WE AWE WASP WASP Frecha et al. Gene Therapy 2008
22 Terapia celular-génica del Síndrome de Wiskott y Aldrich (WAS) Objetivo 2: Desarrollar modelos celulares humanos donde poder estudiar las estrategias terapéuticas - Células inmortalizadas WASKO - Células embrionarias humanas (hescs) WASKO WASP WASP Determinar como y cuando se expresa WASP durante diferenciación hematopoyética y estudiar su función Estudiar que vectores mimetizan mejor este patrón de expresión Megacariopoyesis y trombopoyesis
23 Desarrollo de células embrionarias deficientes para WASp hescs-wasko: La patología en el laboratorio (Disease in a Dish)
24 Generación de líneas embrionarias humanas deficientes para WAS: Generación de plaquetas WASKO La ausencia de WASp incrementa la aparición de MKs y plaquetas derivadas de hescs
25 La ausencia de WASp afecta en mayor medida a los MKs que a las plaquetas derivadas de hescs Respuesta a trombina Ca++ Toscano et al. Molecular Therapy 2015 Hipótesis La reducción de plaquetas en sangre de pacientes con WAS es debido a alteraciones que ocurren en los megacariocitos Preguntas Cómo afecta a los megacariocitos la expresión reducida y/o elevada de WASP? Logran los vectores actuales niveles fisiológicos de WASP en megacariocitos?
26 On going Megacariopoyesis y trombopoyesis [WASP ]? [WASP ]? [WASP ]?
27 Modelos celulares: Células HSCs de pacientes WAS y células inmortalizadas editadas
28 Modelos celulares: Células HSCs de pacientes WAS y células inmortalizadas editadas HSCs WASKO K562_WASKO MEG-1_WASKO
29 AWW: LENTIVIRAL VECTORS for WAS GT? AWW WASP ORPHAN DRUG DESIGNATION CLINICAL TRIAL
30 AGRADECIMIENTOS GTCG Miguel G. Toscano Pilar Muñoz Marién Cobo Almudena Gilabert María Tristán Karim Benabdellah Alejandra Gutierrez Sabina Sánchez Per Anderson Ana Belén Carrillo INSERN (Université de Lyon) Sangamo Biosciences San Francisco. CA Michael Holmes Els Verhoyen Cecilia Frecha Institute of Child Health UCL. London Adrian Thrasher Pablo Menéndez Clara Bueno Pedro Real Verónica Ramos Ignacio Molina Zulema Romero
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