INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN Identificación de Microdeleciones de las Regiones AZF (Yq) en una Muestra de Pacientes del Instituto Nacional de Perinatología con Azoospermia no Obstructiva y/o con Oligoospermia Moderada o Severa: Relación Fenotipo-Genotipo. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA SALUD PRESENTA: MAURICIO DOMÍNGUEZ CASTRO Director de Tesis DR. JAVIER MANCILLA RAMÍREZ M. EN C. MÓNICA AGUINAGA RÍOS Octubre de 2010

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4 Este trabajo fue realizado en el Instituto Nacional de Perinatología Isidro Espinosa de los Reyes SSA Montes Urales # 800 Col. Lomas Virreyes Delegación Miguel Hidalgo C. P México D. F. y en la Sección de Estudios de Posgrado e Investigación de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional bajo la Dirección del Dr. Javier Mancilla Ramírez y la Dirección de la M. en C. Mónica Aguinaga Ríos. IV

5 INDICE: Glosario..II Relación de figuras..iv Relación de tablas.vi Resumen.....VII Abstract....IX 1. Introducción Antecedentes Fisiología testicular Embriogénesis de la gonada Causas frecuentes de infertilidad masculina Etiología de la esterilidad atribuible al factor masculino.. 6 A) Endocrinológicas..7 B) Anormalidades cromosómicas.. 8 C)Microdeleción del cromosoma Y El cromosoma Y: la esencia genética de la infertilidad masculina La región AZFa La región AZFb La región AZFc La región AZFd... 18

6 2.6. Génes controladores de la espermatogénesis (pasar antes) Métodos utilizados para la evaluación del cromosoma Y abajo Cariotipo Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Sitios de secuencias marcadoras (STS) en Y Implicaciones del dna mitocondrial..22 en la infertilidad masculina 3. Justificación Hipótesis Objetivos Objetivo General Objetivos Particulares Material y Métodos Tipo de estudios Ubicación Temporal y Espacial Criterios de selección de muestra Variables Tamaño de muestra Metodología..29 A) extracción de DNA.30 B) PCR múltiple..31 VI

7 6.7. Análisis estadístico Resultados Discusión Conclusiones Perspectivas Bibliografía Anexos Anexo no Anexo no Anexo no RELACIÓN DE FIGURAS. Figura 1. Clasificación y morfología de los espermatozoides 6 VII

8 Figura 2. Gráfica circular en donde muestra los trastornos de infertilidad masculina más comunes...7 Figura 3. Cromosoma Y región SRY...13 Figura 4. Cromosoma X y cromosoma Y con sus regiones homólogas para la recombinanción durante la meiosis.13 Figura 5. Cromosoma Y con sus 7 regiones y sus divisiones en subintervalos..14 Figura 6. Intervalos de las regiones de AZF con sus sitios de reconocimiento y sus locus específicos 14 Figura 7. Región AZFa en Yq Figura 8. Región AZFb con los genes más representativosde este intervalo.17 Figura 9. Figura 9. De la región AZFcmostrándo los genes DAZ 19 Figura 10.Cariotipo de un varon formula cromosómica 46,XY normal; con una resolucíon de 550 bandas..22 Figura 11. Espermatozoides analizando los defectos en las mitocondrias y en la cola...25 Figura 12. Análisis de flagelo espermático 26 Figura 13. Reacción A PCR Múltiple pacientes con deleción 40 Figura 14. Reacción B PCR Múltiple pacientes con deleción 41 VIII

9 Figura 15. Reacción C PCR Múltiple pacientes con deleción 41 Figura 16. Reacción D PCR Múltiple pacientes con deleción 42 Figura 17. Reacción E PCR Múltiple pacientes con deleción 42 Figura 18. Reacción F PCR Múltiple pacientes con deleción.43 IX

10 Relación de tablas. Tabla I. Parámetros seminales normales según la OMS Tabla II. Genes involucrados con la infertilidad...20 masculinas de las diferentes regiones de AZF en el cromosoma Y. Tabla III. Regiones STS agrupadas para PCR múltiple...35 Tabla IV.Secuencias de los primers indicadores...36 Para la amplificación X número de STS usadas Para la detección de microdeleciones del cromosoma Y de el locus Yq11 y del gen SRY. Se indica el Tamaño del amplicón. Tabla V. Pacientes con infertilidad utilizados.38 como control. > 5,000,000 /ml. Tabla VI. Pacientes con infertilidad utilizados...39 Como casos < 5,000,000 /ml. Tabla VII. Tabla de pacientes con infertilidad...39 primaria <5,000,000/ml vs>5,000,000/ml. Tabla VIII. Tabla de pacientes con infertilidad..40 primaria <5,000,000/ml vs 0/ml. Tabla IX. Tabla de pacientes con infertilidad...40 primaria <5,000,000/ml vs > 5,000,000/ml. Tabla X. Tabla de pacientes con infertilidad. 40 primaria o/ml vs > 5,000,000/ml. X

11 GLOSARIO ABP. Proteína de unión a andrógenos. AZF. Factor de azoospermia. AZOOSPERMIA. Se define como la ausencia de espermatozoides en el líquido eyaculado. CFTR. Gen regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quística DAZ. Gen deletado en azoospermia. DISGENESIA GONADAL MIXTA. Padecimiento que se caracteriza por la presencia de testículo de un lado y estría fibrosa del lado opuesto. DNA.Acido desoxirribonucleico. ESPERMATOBIOSCOPIA. Es el estudio en el cual se realiza una evaluación macroscópica y microscópica del semen, el cual está formado por una mezcla de espermatozoides suspendidos en el plasma seminal. FSH.Hormona folículo estimulante. ICSI. Inyección intracitoplasmática de espermatozoide. HIPERPROLACTINEMIA. El aumento en los niveles de prolactina que ocasionan disminución en los niveles de testosterona y de gonadotropinas. HIPOTIROIDISMO. Es una afección en la cual la glándula tiroides no logra producir suficiente hormona tiroidea. INFERTILIDAD. Infertilidad se define como la incapacidad para concebir después de 12 meses de relaciones sexuales de regular frecuencia y sin protección anticonceptiva. LH. Hormona luteinizante. Mb. Megabases. XI

12 MICRODELECIONES. Las microdeleciones consisten en la pérdida de material cromosómico, que comprende, en la mayoría de los casos entre 1 a 3 Mb de DNA, las cuales no pueden ser detectadas por análisis cromosómico de citogenética convencional. PCR. Reacción en cadena de la polimerasa. OLIGOSPERMIA IDIOPATICA. El término de oligospermia idiopática se utiliza para describir el subconjunto de pacientes con infertilidad de causa no determinada que tienen un número de espermatozoides por debajo de 10 millones/ml en el estudio de espermatobioscopía, independientemente de su asociación con la existencia de anormalidades en otros parámetros seminales. De acuerdo al número de espermatozoides se clasifica en: leve: millones/ml, moderada de 5-10 millones/ml y severa <5 millones/ml. RNAm.Acido desoxirribonucléico mensajero. SINDROME DE CÉLULAS DE SERTOLI. Síndrome diagnosticado por biopsia testicular en el que únicamente se observan células de Sertoli y no se observan espermatozoides. SINDROME DE KLINEFELTER. Este síndrome es la anormalidad cromosómica más frecuentemente encontrada en varones con azoospermia, el cariotipo es 47,XXY. SÍNDROME DE KALLMAN. Pacientes que presentan un hipogonadismo hipogonadotrópico y pueden tener otras características clínicas como anosmia, asimetría facial, paladar hendido, daltonismo, sordera, criptoquídia y anormalidades renales. SRY. (Del inglés Sex-determiningRegionY) gen que determina la diferenciación de la gónada en testículo a las 7 semanas de gestación aproximadamente. Se localiza en el brazo corto del cromosoma Y en la región STS. Sitios marcadores de secuencias. TRASLOCACIÓN. Reorganización estructural cromosómica entre dos o más cromosomas. XII

13 RESUMEN. Infertilidad se define como la incapacidad para concebir después de 12 meses de relaciones sexuales de regular frecuencia y sin protección anticonceptiva [Seshagiri, 2001; Huynh, 2002]. El factor masculino como causa de infertilidad se encuentra en aproximadamente el 50% de las parejas, constituyendo el 15% de todas las parejas en edad reproductiva. Los investigadores han demostrado gran interés en la correcta estimación del potencial de fertilidad de un hombre. El término "La infertilidad masculina" no constituye un síndrome clínico definido, pero más bien, un conjunto de diferentes condiciones exhibiendo una variedad de etiologías y diagnósticos. Las causas más frecuentes de infertilidad masculina son: a). Endocrinológicas. b). Anormalidades cromosómicas. c). Causas monogénicas. d). Microdeleciones de la región eucromática de Yq. Se entiende por deleción cromosómica a la falta de un segmento (3-5 Mb) de un determinado cromosoma la cual se identifica por citogenética convencional (resolución de bandas 550), cuando ésta no se identifica por citogenética convencional, se le conoce como microdeleción. La base genética de algunos casos de infertilidad masculina fue demostrada por primera vez en 1976 con los estudios de Tiepolo y Zuffardi a través de deleciones microscópicamente visibles del cromosoma Y de hombres infértiles y con azoospermia; con estos datos se postuló la hipótesis que los factores controladores de la espermatogénesis humana se localizan en la porción distal eucromática de Yq11. Briton- Jones y col (2000) nombraron a esta área la región del factor de azoospermia (AZF). Actualmente, las microdeleciones de Yq se identifican a través de la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplifica entre 15 y 30 secuencias marcadoras tipo STS de Yq11. Objetivo principal.determinar la frecuencia de microdeleciones en una muestra de pacientes con azoospermia no obstructiva, con oligospermia moderada y/o severa de etiología no determinada en el Instituto Nacional de Perinatología IER, S.S. Material y Metodos. Se incluyeron en el estudio pacientes masculinos mayores de 18 años (previo consentimiento informado firmado), con diagnóstico de azoospermia u oligoospermia severa en por lo menos dos estudios de espermatobioscopía, con cariotipo normal en 15 células de sangre periférica (46,XY) y con XIII

14 niveles hormonales con parámetros normales. En esta tesis se pretende presentar una breve descripción de la complejidad genética del ser humano y cromosómica en algunos factores como las microdeleciones en el cromosoma Y de la región Yq11 para brindar un mejor consejo genético en el contexto de la infertilidad masculina humana por PCR Múltiple utilizando 21 regiones de AZF ubicadas en el cromosoma Y utilizadas por Hellani y col (2005). En el DNA extraído de sangre periférica. Resultados.Durante el periodo de estudio, se realizó el estudio de microdeleciones del cromosoma Y por PCR múltiple en 64 pacientes: 17 con azoospermia, 15 con oligoospermia severa, 19 con oligoospermia moderada y 13 oligoospermia leve. Se encontraron 4 pacientes con microdeleciones del cromosoma Y en la región AZFc de las siguientes regiones marcadoras STS s (SY148, SY153, SY154, SY157, SY158, SY254, SY277, SY279), de los cuales 2/17 (11.7 %) fueron diagnosticados con azoospermia y 2/15 (13.3 %) oligospermia severa y los 4 mostraron la deleción de AZFc. Conclusiones.La infertilidad masculina es probable se deba a un resultado de la supresión y/o mutaciones en uno o más de los miles de genes necesarios para la espermatogénesis. En particular, se sigue sin poder establecer la correlación precisa entre genotipo-fenotipo especifico, las deleciones del cromosoma Y; y los diversos patrones histológicos testiculares que se han observado en los hombres infértiles. No se puede elucidar una relación contrastante fenotipo-genotipo debido que a pesar de que diferentes pacientes presenten la misma deleción presentan diferente diagnostico oligoospermia o azoospermia y como consecuencia diferente patrón de reproducción, donde pueden estar involucrados otros factores como los ambientales. Concluyendo de esta manera que para el diagnóstico de microdeleciones en hombres infértiles los que presentan mayor y mejor detección son los que tienen una cuanta espermática menor de 5,000,000 de espermatozoides/ml, con cariotipo normal y patrones hormonales en parámetros normales. XIV

15 Infertility is defined as the inability to conceive after 12 months of regular sex frequently and without contraceptive protection [Seshagiri, 2001; Huynh, 2002]. The cause of male factor infertility is found in approximately 50% of couples, representing 15% of all couples aged reproductive. The researchers have shown great interest the correct estimation of potential fertility of a man. The term "male infertility" is not a defined clinical syndrome, but rather a set of different conditions exhibiting a variety of etiologies and diagnoses. The most common causes of infertility men are: a). Endocrinologist. b). Abnormalities chromosome. c). Monogenic causes. d). Microdeletions euchromatic region of Yq. Means deletion chromosome to the lack of a segment (3-5 Mb) of a specific chromosome which is identified by cytogenetics conventional (550 bands resolution) when it is not identified by conventional cytogenetics, is known as microdeletion. The genetic basis for some cases of male infertility was first demonstrated in 1976 with the studies of Tiepolo and Zuffardi through deletions microscopically visible Y chromosome of men infertile, with azoospermia, with this data is postulated hypothesis that factors drivers human spermatogenesis are located in the distal euchromatic of Yq11. Briton-Jones et al (2000) named this area the region of the azoospermia factor (AZF). Currently, Yq microdeletions are identified through the use of chain reaction polymerase (PCR) to amplify sequences between 15 and 30 marker type Yq11 STS. Main objective. To determine the frequency of microdeletions in a sample of patients with azoospermia not obstructive, with moderate oligospermia and / or severe etiology not determined at the National Institute of Perinatology IER, S.S. Material and Methods. Were included in the study male patients over 18 years (previous consent signed informed), diagnosed with azoospermia or oligoospermia severe in at least two studies espermatobioscopía with normal karyotype in 15 cells peripheral blood (46, XY) and hormonal levels normal parameters. This thesis aims to present a brief description of the genetic complexity of humans and factors such as chromosome microdeletions in Y chromosome Yq11 the region to provide better advice gene in the context of human male infertility Multiple PCR using 21 regions located in the AZF Y chromosome used by Hellani et al (2005). In DNA extracted from peripheral blood. Results. During the period of study, the study of microdeletions Y XV

16 chromosome by multiplex PCR in 64 patients: 17 with azoospermia, 15 with severe oligoospermia, 19 with oligoospermia oligoospermia moderate and 13 mild. There were 4 patients with Y chromosome microdeletions in the AZFc region of the STS marker's following regions (SY148, SY153, SY154, SY157, SY158, SY254, SY277, SY279), of which 2/17 (11.7 %) Were diagnosed with azoospermia and 2/15 (13.3%) severe oligospermia and 4 revealed that the deletion of AZFc. Conclusions. Male infertility is likely due to a result of the removal and / or mutations in one or more of thousands of genes necessary for spermatogenesis. In particular, it does not establish the correlation accurate genotypespecific phenotype, the deletions Y chromosome, and the different testicular histologic patterns have been observed in infertile men. Can not elucidate a relationship because of contrasting phenotype-genotype that despite the fact that different patients will have the same oligoospermia deletion or present different diagnosis azoospermia and following different pattern reproduction, where other factors may be involved as environmental. Thus conclude that for diagnosis of microdeletions in infertile men who have more and better detection are those with a much less than 5,000,000 sperm sperm / ml, with normal karyotype and hormonal patterns in parameters normal. XVI

17 1. INTRODUCCION. El factor masculino como causa de infertilidad se encuentra en aproximadamente el 50% de las parejas, constituyendo el 15% de todas las parejas en edad reproductiva. Los investigadores han demostrado gran interés en la correcta estimación del potencial de fertilidad de un hombre. El término "La infertilidad masculina" no constituye un síndrome clínico definido, pero más bien, un conjunto de diferentes condiciones exhibiendo una variedad de etiologías y diagnósticos. Infertilidad se define como la incapacidad para concebir después de 12 meses de relaciones sexuales de regular frecuencia y sin protección anticonceptiva [Seshagiri, 2001; Huynh, 2002]. Globalmente la incidencia de infertilidad se estima en un %. Dentro de las causas de infertilidad en varones, el 10% tendrán defectos severos en la producción de espermatozoides. En consecuencia, casi 1% de los hombres en edad fértil tendrán alteraciones graves en los parámetros de espermatobioscopía. La función reproductiva masculina depende de múltiples factores, que incluyen una normalidad en la función de la espermatogénesis, del tracto genital, la erección y la eyaculación. Las principales causas de infertilidad, en los hombres son oligoospermia, astenozoospermia, teratozoospermia y azoospermia queen conjuntorepresentan del 20% al 25% de los casos. Las técnicas modernas de reproducción asistida como la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) pueden ayudar a estas parejas a superar sus problemas de infertilidad, aunque es imprescindible analizar las subyacentes causas genéticas de la infertilidad masculina. En esta tesis sepretende presentar una breve descripción de la complejidad genética del ser humano y cromosómica en algunos factores como lasmicrodeleciones en el cromosoma Y de la región Yq11 para brindar un mejor consejo genético en el contexto de la infertilidad masculina humana por PCR Múltiple utilizando 21 regiones de AZF ubicadas en el cromosoma Y utilizadas por Hellani y col (2005) tabla III. La incidencia y prevalencia de la infertilidad masculina se estima a nivel mundial, entre millones de parejas que sufren de infertilidad cada año. La magnitud del problema exige una 1

18 urgente de acción, especialmente cuando la infertilidad es evitable en la mayoría de los casos [Poongothai y col 2009]. 2. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS. 2. EMBRIOGÉNESIS DE LA GONADA. En la tercera semana de desarrollo se originan las células germinativas primordiales, a partir del endodermo del saco vitelino. Después de migrar durante la cuarta y quinta semanas a través del mesenterio dorsal, llegan a las gónadas primitivas, abultamientos localizados en las crestas urogenitales. El desarrollo de las crestas obedece a la acción de un grupo de genes como WT1, SF1, DAX1, Lim1, EMX2, LHX9, situados en cromosomas autosómicos. Las gónadas indiferenciadas primitivas se originan a partir del reborde epitelial celómico de la cresta urogenital y del mesodermo intermedio, ventral al mesonefros. Los cordones sexuales primarios crecen a partir del epitelio celómico y se dirigen en dirección dorsal, para penetrar en la gónada primitiva. La llegada de las células germinativas a la gónada indiferenciada durante la quinta semana de desarrollo favorece su desarrollo y diferenciación. Por tanto, en su ausencia, desaparece el efecto inductor sobre las gónadas y se produce agenesia gonadal [Rojas et al 2005]. Por otra parte, la determinación del sexo gonadal ocurre en las semanas 6 a 9 de desarrollo. La importancia del cromosoma Y en el desarrollo testicular fue establecida durante la década de 1950, mientras que la del antígeno H-Y, presente en el brazo largo del cromosoma Y, fue dilucidada una década más tarde. Mediante el análisis de las alteraciones estructurales del cromosoma Y fue posible, en la década de 1980, identificar al gen responsable de la diferenciación testicular. Fue así como se postuló que correspondía al gen ZFY (Zinc Finger Chromosome Y), codificante de una proteína reguladora de transcripción y localizado en el brazo corto del cromosoma Y. Sin embargo, el locus del verdadero gen responsable de la diferenciación testicular, sólo se identificó a finales del siglo XX, después de estudios complejos basados en análisis genéticos moleculares de secuencias de traslocación y deleción, en pacientes 46,XX y 46,XY con inversión sexual. El 2

19 locus propuesto se encuentra en Yp11.3, inmediatamente proximal a la región pseudoautosómica del brazo corto del cromosoma Y. Al gen se le denominó SRY (Región Determinante del Sexo en el Cromosoma Y) [Rojas et al 2005]. Mediante la transcripción del gen SOX9 tanto en los pliegues gonadales vecinos del conducto de Müller como en los conductos metanéfricos, se ha logrado activar al gen SRY presente en las células del epitelio celómico, precursoras de las células de Sertoli. Por su parte, el desarrollo de las células de Leydig está en apariencia determinado por la expresión de WNT4 [Rojas et al 2005]. En la figura 1 se muestra algunos genes necesarios para la diferenciación sexual en su etapa embrionaria. Figura 1. Genes involucrados en la diferenciación sexual en la etapa fetal. La ausencia de SRY y la doble dosis de los genes del cromosoma X aseguran el desarrollo y la permanencia ovárica. Hacia la semana 12 de la gestación, tanto genitales internos como externos han concluido su proceso de diferenciación y forman en conjunto lo que se denomina sexo genital. En la diferenciación de los genitales internos toman parte, tanto los conductos mesonéfricos o de Wolff, como los paramesonéfricos o de Müller. Ambos tipos de conductos requieren de la estimulación de las hormonas gonadales para su diferenciación [Rojas et al 2005]. Cuando hay desarrollo testicular, las células de Leidyg inician la producción de testosterona 3

20 hacia la semana 9, bajo la influencia de la gonadotropina coriónica. Por su parte, las células de Sertoli comienzan a secretar la hormona antimülleriana. La secreción paracrina de testosterona actúa sobre los conductos de Wolff, de modo que estos dan origen a los conductillos eferentes, al epidídimo, al conducto deferente y a las vesículas seminales. La regresión de los conductos de Müller, provocada a su vez por la hormona antimülleriana, deja como remanentes al utrículo prostático y al apéndice del testículo [Rojas et al 2005]. En la mujer, la ausencia de testosterona determina la regresión de los conductos mesonéfricos o de Wolff. Debido a la ausencia de la hormona antimülleriana se desarrollan los conductos de Müller. Estos crecen en dirección caudal y se fusionan en la línea media para dar origen a las trompas de Falopio, al útero y a la parte superior de la vagina figura 2 diferenciación sexual se lleva a cabo de un origen común. [Rojas et al 2005]. Figura 2. Figura 3 los genitales externos se originan a partir de un esbozo común, de acuerdo con la disponibilidad de dihidrotestosterona. Cuando hay tejido testicular, la testosterona secretada es transformada en dihidrotestosterona, gracias a la acción de la enzima 5 alfa- reductasa. Como resultado de su acción hay crecimiento del tubérculo genital y fusión de los pliegues del seno urogenital para dar origen al pene y a la uretra peneana. Los pliegues labioescrotales migran hacia la línea media donde se fusionan para formar el escroto. Debido a la ausencia de dihidrotestosterona en la mujer, los pliegues del seno urogenital 4

21 quedan abiertos, de modo que se forman los labios menores. Los labios mayores a su vez derivan de los pliegues labioescrotales, mientras que el clítoris aparece a consecuencia del pobre crecimiento del tubérculo genital [Rojas et al 2005]. Figura 3. Difernciación sexual entre el feto masculino y femenino. En humanos, la expresión del RNAm de SRY define la diferenciación testicular. La cresta genital se forma alrededor de los 33 días de gestación, y SRYse detecta a los 41 días en los embriones XY. Los niveles de SRY alcanzan su pico a los 44 días, cuando se hacen visibles por primera vez los cordones testiculares. A los 52 días de gestación, las células germinales se encuentran rodeadas por células de Sertoli, las cuales continúan la expresión de SRY a un nivel más bajo, sugiriendo otros papeles de SRY, posiblemente en la espermatogénesis. El marco de lectura de SRY está contenido dentro de un solo exón y codifica una proteína de 204 aminoácidos. La proteína se divide en tres regiones, la región central de 79 aminoácidos (dominio HMG) que funciona como dominio de unión al DNA y como dominio de inclinación del DNA, la región N-terminal y la región C-terminal. El dominio HMG se une al surco menor del DNA al reconocer el motivo A/TAACAAT/A y provoca una inclinación aguda en éste, figura 4 se observa la estructura de gen SRY [Harley 2002]. 5

22 Figura 4. Gen SRY. Así mismo, SRY inicia múltiples señalizaciones que incluyen a aquellas que dirigen la proliferación, migración y organización celular, así como patrón vascular. Se han diferenciado tres tipos de células que migran desde el mesonefros hasta la gónada: células endoteliales, células mioepiteliales o pericitos y células adyacentes a las células de Sertoli. Las células que emigran pueden introducir a la gónada algún componente esencial de la lámina basal que rodea al cordón testicular y/o una señal que dispara la diferenciación de la población celular ya existente en la gónada hacia células de Leydig o de Sertoli [Brennan 1998]. Se han propuesto varios modelos para describir las peculiaridades del cromosoma Y, y se pueden clasificar en tres tipos. El primero: el concepto de una entidad dominante, actuando para determinar el sexo masculino, independientemente de que otros cromosomas estén presentes. Un segundo modelo alternativo es que el cromosoma Y es una entidad egoísta, el cual de alguna manera acumula genes que son útiles en el hombre y/o dañinos en una mujer. El tercer tipo sostiene que el cromosoma Y es un cromosoma débil, proveniente de un cromosoma antecesor. Los genes que contiene son sólo reliquias de genes que estuvieron originalmente en un autosoma. La razón de esta entidad poderosa es el papel dominante que juega en la determinación sexual masculinael cromosoma Y [Kirsch 2000]. 6

23 2.1.FISIOLOGÍA TESTICULAR. A partir de la 8ª. semana, las células de Leydig producen andrógenos, responsables de la estabilización de los conductos de Wolff y de su diferenciación en epidídimo, conducto deferente y vesículas seminales, así como de la masculinización del seno urogenital y de los genitales externos los cuales se muestran en la figura 5. Los andrógenos son hormonas esteroideas sintetizadas a partir del colesterol a través de una larga cadena de reacciones enzimáticas. La diferenciación de las células de Leydig, su proliferación y su actividad esteroidogénica dependen del estímulo gonadotrófico proporcionado por la gonadotrofina coriónica humana (hcg) en los primeros seis meses de vida intrauterina y de la hormona luteinizante (LH) hipofisaria en el último trimestre. Tanto la hcg como la LH se unen a un mismo receptor de membrana presente en las células de Leydig, responsable de transducir la señal [Rey 2001]. Los conductos de Wolff expresan el receptor de los andrógenos, receptor nuclear con actividad de factor transcripcional. Al unirse la testosterona a su receptor, se induce la diferenciación del gonaducto en sentido masculino. En el seno urogenital y los esbozos de los genitales externos, la testosterona es transformada en dihidrotestosterona (DHT) por la enzima 5- -reductasa (Fig. 5). La DHT tiene una afinidad 20 veces mayor que la testosterona por el receptor de andrógenos, por lo cual su efecto masculinizante es mucho más potente. En el sexo femenino, la falta de andrógenos resulta en una regresión de los conductos de Wolff y en una feminización de los genitales externos figura 6. Sin embargo, un exceso anormal de andrógenos durante la vida fetal puede provocar una virilización de fetos XX, tal como ocurre en la hiperplasia suprarrenal congénita, la causa más frecuente de anomalías del desarrollo sexual fetal. La acción estrogénica no juega ningún rol en la morfogénesis temprana de los genitales en el sexo femenino, tal como lo demuestran mutaciones en los receptores de estrógenos. En cambio, los estrógenos son indispensables hormonas tróficas en el desarrollo del útero durante la pubertad [Rey 2001]. 7

24 Los testículos tienen dos componentes distintos, los túbulos seminíferos (sitio de la espermatogénesis) y las células de Leydig (fuente de testosterona). La función de estos dos componentes requiere de ambas gonadotropinas pituitarias, la hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH). El efecto primario de la LH es estimular la síntesis y secreción de testosterona por las células de Leydig, efecto potenciado por la FSH, la cual también se une a las células de Leydig y aumenta el número de receptores de LH en las células. La FSH en conjunto con la testosterona actúa sobre los túbulos seminíferos para estimular la espermatogénesis. Este efecto puede estar mediado por activación de las células de Sertoli, la cual es controlada por la FSH y la testosterona. La FSH se une a las células de Sertoli y estimula la producción de varias proteínas, principalmente la proteína de unión a los andrógenos (ABP). La ABP se secreta hacia el lumen del túbulo y se une a la testosterona y a la dihidrotestosterona, concentrando estos andrógenos en el epitelio seminífero para la espermatogénesis y en el epidídimo para la maduración espermática. La inhibina B se sintetiza en las células de Sertoli en respuesta a la FSH y específicamente inhibe la secreción de la FSH en la hipófisis. Los espermatozoides en desarrollo son envueltos por las células de Sertoli que influencian el proceso secuencial de la espermatogénesis. Las espermatogonias sufren una división mitótica para formar los espermatocitos primarios, que a su vez forman los espermatocitos secundarios haploides mediante la división meiótica. Los espermatocitos secundarios proceden a una fase de maduración hacia el estadío de espermátides para finalmente convertirse en espermatozoides. Se necesitan aproximadamente 74 días para producir espermatozoides, de los cuales 50 días transcurren dentro del túbulo. Después de abandonar los testículos, tardan 12 a 21 días para transportarse hacia el epidídimo y aparecer en el eyaculado [Huynh 2002]. 8

25 Figura 5. Regulación hormonal de la diferenciación sexual fetal. El testículo fetal posee dos poblaciones celulares con función endocrina: las células de Leydig y las células de Sertoli. Las células de Leydig producen testosterona, que viriliza los conductos de Wolff al unirse a su receptor nuclear ; también masculiniza el seno urogenital y los genitales externos, luego de ser transformada por la 5- -reductasa en dihidrotestosterona (DHT), que se une al mismo receptor, pero con más afinidad. Por su parte, las células de Sertoli secretan hormona anti-mülleriana (AMH) que provoca la regresión de los conductos de Müller, esbozos del útero, tubas uterinas y porción superior de la vagina, al unirse a su receptor de membrana. 9

26 Figura 6.Hipótesis sobre los mecanismos moleculares involucrados en la determinación testicular.1. En el feto XX normal y en el feto XY con una mutación o deleción de SRY, los factores anti-testiculares (quizás DAX1) inhiben el desarrollo testicular. 2. En el feto XY normal, SRY contrarresta la acción de los factores anti-testiculares, permitiendo que las gónadas se desarrollen en sentido testicular y expresen genes como SOX9 y AMH, específicos de la gónada masculina. 3. En fetos XY con una doble dosis de DAX1, una sola dosis de SRY no puede contrarrestar el efecto antitesticular de dos dosis de DAX1. 4. En el feto XX con una alteración en los genes antitesticulares, las gónadas se desarrollan en sentido testicular aún en ausencia de SRY: sería el caso de los varones XX sin SRY, aunque esta hipótesis necesita ser confirmada CAUSAS MÁS FRECUENTES DE INFERTILIDAD MASCULINA. El examen más importante para la valoración del varón infértil es el estudio de espermatobioscopia, que sirve para hacer el diagnóstico de azoospermia, oligoospermia y/o teratoospermia. Se recomienda realizarse a todos los hombres que no han podido tener hijos, para conocer si el problema para concebir es atribuible al factor masculino. Los valores normales en la espermatobioscopíase presentan en la tabla 1. 10

27 PARAMETRO Volumen VALOR >2mL ph Concentración Cuenta total Motilidad Morfología >20 x 10 6 espermatozoides/ml >40 x 10 6 espermatozoides/eyaculado >50% con progresión anterógrada o >25% con progresión rápida 60 min después del eyaculado >30% con forma normal Tabla 1. Parámetros seminales normales según la OMS Se define como azoospermia a la ausencia de espermatozoides en el líquido eyaculado. El diagnóstico de azoospermia se basa en al menos dos espermatobioscopías realizadas en las condiciones adecuadas. La muestra debe ser centrifugada antes de definir la completa ausencia de espermatozoides. Es fundamental diferenciar entre azoospermia obstructiva y secretora. Las numerosas etiologías de la azoospermia pueden dividirse en tres categorías: a) La pretesticular es la que presenta alteraciones endocrinas que afectan a la espermatogénesis; b) La testicular incluye alteraciones en la esteroidogénesis o en la espermatogénesis y c) Las causas postesticulares comprenden alteraciones en la eyaculación o procesos obstructivos en el tramo final. La oligospermia es la disminución en el número de espermatozoides y puede ser de tres tipos: a) Severa: menos de 5 millones de espermatozoides/ml, b) Moderada: de 5 a 10 millones de espermatozoides/ml y c) Leve: de 10 a 20 millones de espermatozoides/ml, y refleja una producción inadecuada de espermatozoides por el epitelio germinal. Puede ser secundaria a un inadecuado estímulo hormonal, a daño directo del testículo o rara vez a obstrucción parcial de los ductos eyaculadores. El diagnóstico se realiza a través de un examen clínico en la consulta, que incluye estudios endocrinológicos y parámetros seminales figura 7. 11

28 Figura 7. Clasificación y morfología de los espermatozoides. 2.4 ETIOLOGIA DE LA ESTERILIDAD ATRIBUIBLE AL FACTOR MASCULINO. La fertilidad también depende de tránsito de los espermatozoides hacia la porción ampular del oviducto, capacitación, penetración al óvulo, fertilización y desarrollo embrionario temprano. Cualquier alteración genética puede afectar cualquiera de estos componentes y llevar a varios grados de infertilidad/subfertilidad masculina. La infertilidad puede ser primaria cuando nunca ha ocurrido un embarazo, o secundaria, cuando ya ha ocurrido un embarazo sin importar el resultado final, siendo de aproximadamente 67 al 71% para el primer grupo y 29 al 33% para el segundo [Seshagiri, 2001]. Aproximadamente una de cada diez parejas son infértiles por varias razones posibles, el factor masculino se da en un 50% de los casos. Este grupo es normalmente dividido en 30% con factores estrictamente masculinos, y el 20% de los factores femeninos. Sin embargo, en aproximadamente el 30% de estos casos, los orígenes de la infertilidad masculina son desconocidos. La infertilidad masculina es un síndrome multifactorial que abarca una amplia variedad de trastornos. En más de la mitad de hombres infériles, la causa de su infertilidad es desconocida (idiopática) y podría ser congénita o adquirida. Hasta el 10% de la infertilidad no se puede explicar médicamente; algunos de los trastornos de infertilidad masculina se resumen en la figura 8. 12

29 Figura 8. Gráfica circular en donde muestra los trastornos de infertilidad masculina más comunes. Las causas conocidas de infertilidad en el hombre son muy numerosas, pero se pueden agrupar en varias categorías importantes. La infertilidad masculina ha sido asociada con varios trastornos genéticos y no genéticos. Los factores genéticos involucrados en el hombre con infertilidad se manifiestan como trastornos cromosómicos, mutaciones en el ADN mitocondrial (ADNmt), alteraciones monogénicas, enfermedades multifactoriales y trastornos endocrinos de origen genético [Poongothai y col 2009]. Causas No Genéticas. a) Endocrinológicas. - Falla Testicular Primaria. Se encuentra aproximadamente en el 10% de los hombres con infertilidad. La testosterona e inhibina se encuentran disminuidas y la FSH elevada (hipogonadismo hipergonadotrópico). La elevación de LH es variable, debido a que las células de Leydig son más resistentes al daño que las células germinales. Usualmente los testículos son pequeños y suaves. El 90% de los hombres con aplasia de células germinales tendrán elevación de la FSH. Todos los hombres con incremento de tres veces más la FSH tendrán algún anormalidad significativa en la biopsia testicular. - Hipotiroidismo. Tanto los niveles elevados como bajos de la hormona tiroidea alteran la espermatogénesis. La disfunción tiroidea como causa de infertilidad es de aproximadamente el 0.5% y es tratable. Usualmente los síntomas y signos clínicos son 13

30 evidentes. Por lo tanto, la evaluación hormonal tiroidea de rutina no está recomendada inicialmente en pacientes con infertilidad. - Hiperplasia Adrenal Congénita. Lo más común es la deficiencia de la enzima 21 hidroxilasa, lo que lleva a un defecto en la producción de cortisol. Los testículos fallan en su maduración debido a los bajos niveles de gonadotropinas por el exceso de andrógenos suprarenales. El diagnóstico es raro y clásicamente los pacientes presentan pubertad precoz; se requiere una cuidadosa evaluación y estudios de laboratorio. La condición y la infertilidad asociada son tratadas con corticosteroides. Causas Genéticas. b) Anormalidades cromosómicas. Las anormalidades cromosómicas son más comunes en hombres infértiles afectando a un 3 a 13% (ref Gardner) comparadas con la población general normal presentes en un 0.5% [Brugh 2003]. Las anormalidades en cromosomas sexuales son más comunes que las autosómicas, presentes en un 4.2% y 1.5% respectivamente [Hargreave 2002; Foresca 2001]. Los rearreglos cromosómicos se observan en algunos pacientes con azoospermia y oligospermia severa e involucran a los autosomas, cromosomas sexuales, o ambos. Aproximadamente 10-15% de hombres infértiles presentan cambios estructurales del cromosoma Y. Una serie de datos obtenidos de 11 publicaciones que reportaron un total de 9766 hombres infértiles encontró una incidencia de anormalidades cromosómicas del 5.8%, de las cuales las anormalidades de los cromosomas sexuales representaban un 4.2% y las anormalidades autosómicas 1.5%. Es mucho más frecuente ver pacientes con alteraciones numéricas de cromosomas sexuales en la práctica clínica de la infertilidad masculina [Brugh 2003], las más frecuentes son: - Síndrome de Klinefelter (47,XXY) lo padecen aproximadamente el % de los hombres con azoospermia. Un 90% de estos pacientes presentan el cariotipo 47,XXY y un 10% son mosaico 47,XXY/46,XY [Turek y col 2002]. Este síndrome es la anormalidad cromosómica más frecuente, ya que se ve 30 veces más frecuente en hombres infértiles que 14

31 acuden a una clínica de infertilidad que en la población general. Se ha encontrado que la prevalencia de este síndrome en pacientes azoospérmicos es de 10-14% en países occidentales [Brugh y col 2003,Harvreage y col 2006]. Los pacientes adultos presentan testículos pequeños y firmes usualmente libres de células germinales. Las biopsias testiculares muestran esclerosis y hialinización [Turek y col 2002;Harvreage y col 2006]. - Síndrome 47,XYY: es una aneuploidía de los cromosomas sexuales en el que un varón humano recibe un cromosoma Y extra. Esta anomalía cromosómica se presenta en 1/1,000 varones nacidos vivos en la población en general, pero más frecuente en la población infértil. En la mayoría de los casos las características fenotípicas son normales, lo que dificulta su manejo ulterior basado en los requisitos específicos asociados a un determinado etiología. Las anormalidades citogenéticas han sido conocidos por ser importantes causas de la infertilidad masculina durante décadas y las alteraciones cromosómicas son más frecuentes en la población de azoospérmicos y/o oligospérmicos en los hombres de la población general. Los hombres con un cariotipo 47,XYY generalmente son fértiles y no hay evidencia de transmisión del cromosoma Y a sus descendientes porque el cromosoma supernumerario se elimina durante la meiosis, y algunas células germinales XYY puede completar la meiosis y producir espermatozoides aneuploides maduros. Sin embargo, se les ve con más frecuencia en las poblaciones infértiles. En este estudio todos los pacientes con cariotipo 47,XYY son infértiles. Sin embargo, las generalizaciones no se puede hacer con respecto a la correlación entre el cariotipo y fenotipo por infertilidad. Este hallazgo puede ser casual. No hay estudios sistemáticos para estos pacientes. Se han publicado que el síndrome 47,XYY está asociado con una mayor frecuencia con infertilidad. [El-Dahtory,2009]. b) Los portadores de alguna anormalidad cromosómica estructural presentan fertilidad disminuida, así como un mayor riesgo de abortos y de hijos con retraso mental y defectos al nacimiento. Además, las inversiones en los autosomas, son ocho veces más propensas de 15

32 ocurrir en hombres infértiles que en los fértiles. Las translocaciones Robertsonianas y recíprocas son 8.5 veces más frecuentes en varones infértiles que en varones recién nacidos seleccionados al azar. La mayoría de los pacientes con translocaciones Robertsonianas muestran parámetros seminales anormales que pueden ir desde una oligospermia hasta una azoospermia, dependiendo del grado de arresto meiótico inducido por la reorganización cromosómica [Brugh 2003]. En las translocaciones Robertsonianas y recíprocas, que involucran al menos un cromosoma acrocéntrico, las regiones autosómicas no apareadas de los cromosomas con el rearreglo y las regiones no apareadas de los cromosomas X y Y han demostrado establecer contacto durante la profase meiótica. Este mecanismo fue propuesto inicialmente por Forejten 1995, y posteriormente ampliado por Chandley en 1986 para explicar el daño espermatogénico causado por la interferencia autosómica sobre los cromosomas sexuales o por la influencia de éstos sobre la actividad de los autosomas. La ausencia de sinapsis extensa puede ser también la responsable de la falla en la espermatogénesis, aún en ausencia de la asociación con el bivalente XY. La asinapsis y sinapsis no homóloga se observan principalmente en la proximidad de los puntos de ruptura [Kirsch 2000; Jaafar 1989]. Así mismo, es frecuente observar un efecto intercromosómico cuando el cromosoma translocado tiene un efecto sobre la segregación de otros cromosomas que no están involucrados en la translocación, por ejemplo, una frecuencia aumentada de trisomía 21 asociada a una t(13q:14q) [Shi 2001]. 2.5 MICRODELECIÓN DEL CROMOSOMA Y. Uno de los defectos más importantes asociados con infertilidad masculina es la presencia de microdeleciones en el brazo largo del cromosoma Y (Yq), las cuales se presentan en 13% de los pacientes con azoospermia y entre el 1-7% con oligospermia severa. Las deleciones de novo en Yq son una de las causas más frecuentes de anormalidades 16

33 cromosómicas en los hombres y se cree que proceden de los eventos de recombinación desigual entre secuencias de ADN altamente repetitivas durante la meiosis o durante el desarrollo temprano (pre-implantación). En consecuencia, las microdeleciones del cromosoma Y contribuyen en una pequeña proporción a la totalidad de infertilidad masculina humana, pero cuando está presente, la introducción de alguna técnica de reproducción asistida puede permitir la transmisión de dichas deleciones a la siguiente generación si el producto es varón [Poongothai y col 2009]. MASCULINA EL CROMOSOMA Y: LA ESENCIA GENÉTICA DE LA INFERTILIDAD El cromosoma Y es el cromosoma más pequeño, con aproximadamente 60 millones de pares de bases y cerca de 50 genes funcionales, de los cuales aproximadamente la mitad se especializan en la diferenciación sexual y espermatogénesis. La información genética dentro del cromosoma Y se requiere para los eventos iniciales de diferenciación sexual y para la espermatogénesis normal. El evento que marca la determinación sexual masculina en los humanos es la diferenciación testicular, que inicia aproximadamente en la quinta semana de gestación. El acontecimiento genético fundamental es el cambio de la gónada indiferenciada (cresta genital) hacia la diferenciación testicular mediante la acción del gen llamado factor determinante de testículo (TDF), codificado por SRYcomo se mencionó anteriormente figura 9 [Marshal y col 2001]. Además se requieren genes localizados en los autosomas y en el cromosoma X, como aquellos que codifican para proteínas necesarias para la biosíntesis, metabolismo y acción de los andrógenos. Así mismo, existen loci en el cromosoma Y que contienen una amplia gama de genes que codifican para la estatura, tamaño de dientes y otros [Pagani y col 2002]. 17

34 Figura 9. Ubicación de la región SRYen el cromosoma Y. Las regiones homólogas de X-Y se localizan en ambos extremos de estos cromosomas, éstas se aparean y recombinan durante la meiosis masculina. Estas regiones no tienen relación con el sexo, y se denominan regiones pseudoautosómicas (PAR). Las PAR contienen varios genes que son activos en el cromosoma Y, y no están sujetos a la inactivación del X en mujeres. Los loci compartidos entre el X y el Y son probablemente genes cuyas copias en el Y no han degenerado figura 10. Figura 10. Cromosoma X y cromosoma Y con sus regiónes homólogas para la recombinanción durante la meiosis. En los humanos cerca del 95% del cromosoma Y forma la región no recombinante (NRY). Se pensó durante mucho tiempo que esta región era un área de desperdicio funcional, pero reportes en 1959 acerca de mujeres 45,X y hombres 47,XXY establecieron la existencia de un gen determinante del sexo en el cromosoma Y, y en 1976 se localizó un factor requerido para la espermatogénesis dentro del cromosoma Y humano [Bachtrog y col 2003]. Para seguir definiendo las regiones funcionales y la posición de los genes en el cromosoma Y se han creado diferentes tipos de mapas. Uno se basa en el patrón de bandeo observado en 18

35 el cromosoma con tinciones citogenéticas específicas. Otro, el mapa de Vernaugnd, identifica deleciones que ocurren naturalmente y divide al cromosoma en 7 intervalos (Yp se subdivide en 4 intervalos y la región eucromática de Yq se dividen en intervalos 5 y 6). Este mapa posteriormente subdivide estos 7 intervalos en 43 subintervalos figura 11 [Pagani y col 2002]. Un segmento variable del cromosoma Y está compuesto de DNA satélite repetitivo, localizado en el bloque de heterocromatina dentro del brazo largo y consiste principalmente de las familias repetitivas DYZ1 de 3.4 kilobases y DYZ2 de 2.5 kilobases, que juntas representan alrededor de 50-70% del contenido de DNA en el cromosoma Y [Bachtrog y col 2001]. Figura 11. Cromosoma Y con sus 7 regiones y sus divisiones en subintervalos. Tiopolo y Zuffardien 1976 postularon que los factores controladores de la espermatogénesis humana se localizan en la porción distal eucromática de Yq11. Nombraron a esta área la región del factor de azoospermia (AZF). Casi veinte años después, el primer gen candidato para la espermatogénesis se identificó en esta región del Y. Utilizando sitios de secuencias marcadoras (STS) ligados al Y, y clonación de los puntos de ruptura, exones y mapeo óptico, se han podido definir deleciones específicas del brazo largo del cromosoma Y en esta región. Cuatro distintos intervalos dentro de la región AZF se correlacionan con distintos grados de daño en la espermatogénesis (de Yq proximal a distal: AZFa, AZFb, y AZFc; se ha propuesto una cuarta región entre AZFb y AZFc, denominada AZFd) En la figura 12se muestra la localización y los marcadores en estas regiones [Pagani y col 2002]. 19

36 Figura 12. Intervalos de las regiones de AZF con sus sitios de reconocimiento y sus locus específicos. Foresta y cols. reportaron (Vazquez y col 2007) que la prevalencia relativa de deleciones en la región AZF es para AZFa =4,9%, AZFb = 15,8%, AZFc = 59,6%, AZF a+b =1,5%, AZF b+c = 8,3% y AZF a+b+c = 3,8% LA REGIÓN AZFa. Se localiza en el intervalo 5 de Yq figura 13 [Pagani y col 2002]. Esta región difiere de AZFb y AZFc en su estructura no repetitiva y su baja frecuencia de deleciones, ya que se han descrito pocos pacientes con ellas. Se extiende hasta 800 kilobases [Silber y col 2002]. La mitad proximal de AZFa contiene secuencias de pseudogenes y genes homólogosdel brazo corto del cromosoma X (Xp22). La mitad distal contiene los siguientes genes: AZFaT1. DBY. UTY (gen de repetición del tetracopéptido regularmente transcrito), y una isoforma TBY4. 20

37 USP9Y (proteasa de ubiquitinización específica 9), que se expresa ampliamente en el humano con transcritos identificados en muchos tejidos adultos y embrionarios, incluyendo el testículo. DBY y UTY son expresados ubicuamente y no se duplican, ambos genes tienen homólogos en el cromosoma X. DBY puede ser un gen importante de la espermatogénesis y sufre más frecuentemente deleciones que el USP9Y. La pérdida de DBY se asocia con agenesia de células de Sertoli y se presenta en el 4.9 % de las deleciones en esta regíon (Kent-First, 1999). Los pacientes con deleción de USP9Y y DBY son azoospérmicos con patología testicular de Síndrome de Células de Sertoli. La pérdida de USP9Y o AZFaT1 juntos o por separado resulta en infertilidad masculina. La pérdida adicional de DBY puede empeorar el fenotipo espermatogénico [Pagani y col 2002]. Figura 13 región AZFa en Yq LA REGIÓN AZFb. Contiene los siguientes genes: RBMY (motivo de unión al RNA) es un gen candidato de la espermatogénesis localizado en la región AZFb, inmediatamente proximal a la región AZFc. Presenta múltiples copias (por lo menos 30) localizadas tanto en los brazos largos como en los brazos cortos del cromosoma Y. Existen posiblemente seis subclases de RBM (RBMY1-RBMY6). 21