Porque es un microorganismo nuevo no caracterizado. Porque tienen

Transcripción

1 Trabajo Practico N 3 Cultivo de microorganismos en el laboratorio

2 Para qué cultivar microorganismos? Para estudiarlos Por qué? Porque es un microorganismo nuevo no caracterizado. Porque tienen importancia i ecológica, industrial i (alimentos: lácteos, cerveza, etc.), biotecnológica (producción de compuestos, obtención de genes de interés) y porque causan enfermedades. Cómo? Imitando en el laboratorio las condiciones del ambiente natural del microorganismo, utilizando medios de cultivos y condiciones que sustenten el crecimiento.

3 Qué factores influencian el crecimiento bacteriano en la naturaleza? Factores nutricionales Factores ambientales (físicos) Factores nutricionales: Carbono: CO 2, compuestos orgánicos. Nitrógeno: NH 3, NO 3-, N 2, compuestos orgánicos nitrogenados (aminoacidos, bases nitrogenadas) Fósforo: PO 3 - Azufre: H 2 S, SO 4-, compuestos orgánicos azufrados. Potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro. Elementos traza: Cu, Mo, Mn, Ni, Zn, etc Factores de crecimiento: vitaminas, aminoacidos, purinas y pirimidinas

4 Qué factores influencian el crecimiento bacteriano en la naturaleza? Factores ambientales Temperatura Termófilos: C Mesófilos: C Psicrófilos: C Disponibilidad de agua (osmolaridad) Halófilos discretos 1-6 % NaCl Halófilos moderados 6-15 % NaCl Halófilos extremos % NaCl Halotolerantes Oxígeno Aerobios estrictos ph Anaerobios facultativos ti Acidófilos Microaerófilos Anaerobios aerotolrenates Anaerobios estrictos Neutrófilos Alcalófilos

5 Varias preguntas al cultivar un microorganismo: Es aerobio, anaerobio facultativo, microaerófilo, anaerobio? Qué sustratos puede utilizar como fuente de carbono y energía? Qué formas de nitrógeno puede utilizar? Requiere suplementos nutricionales? Requiere luz como fuente de energía? Puede crecer sobre un sustrato inorgánico? Cuál es su temperatura óptima de crecimiento? Tolera concentraciones altas de sal?

6 Cómo sustentamos el crecimiento en el laboratorio? Medios de cultivos Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que en concentraciones adecuadas y con condiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento de los microorganismos. Fuente de carbono y energía (glucosa o cualquier otro compuesto carbonado) Fuente de nitrógeno, azufre, fósforo NaCl Buffer Agua Según la consistencia Líquidos (caldos) Sólidos (agar 1,5 %) Semisólidos (agar 0,6 %)

7 Obtención de cultivos puros Breve historia 1876 Koch Cultivo de MO en medio solido (gelatina y rodajas de papa) para asegurar cultivos puros. Postulados de Koch: 1. El microorganismo debe estar presente en todos los individuos con la misma enfermedad. 2. El microorganismo debe ser recuperado del individuo enfermo y poder ser aislado en medio de cultivo. 3. El microorganismo proveniente de ese cultivo debe causar la misma enfermedad cuando se lo inocula a otro huésped. 4. El individuo experimentalmente infectado debe contener el micoorganismo. Robert Koch 1882 Walter Hesse remplaza la gelatina por Agar-Agar, lo que permitió el cultivo de microorganismo aislados a mayores temperaturas Julius Richard Petri uno de los ayudantes de Koch ideo una caja o capsula de vidrio para el cutivo de los microorganismo.

8 Obtención de cultivos puros

9 Medio Sólido: permite el crecimiento en superficie de los microorganismos como poblaciones discretas COLONIAS Cultivos puros Medio líquido: Permite la obtención de gran masa celular. Posibilidad de utilizar grandes volúmenes (estudios bioquímicos, i fermentaciones). Medio semisólido: Se utiliza para estudios de movilidad, fermentación.

10 Tipos de Medios de cultivos Medio definido o sintético: son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio de requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles. Medio complejo: medios que contienen nutrientes de composición química variable o no establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de nutrientes. Contienen extractos animales, vegetales e hidrolizados de proteínas. Se utilizan cuando se necesita obtener una amplia gama de microorganismos

11 Medios complejos Extracto de carne: Se obtiene a partir de la proteólisis de carne magra sin tendones. Es de alto valor nutritivo. Fuente de carbono Et Extracto t de levadura: Se obtiene de la extracción acuosa de levadura de cerveza. Es rico en vitaminas. Extracto de malta: Se obtiene a partir de la cebada de malta. Rica en carbohidratos y maltosa. Fuente de nitrógeno Peptona de carne: Digestión de carne bovina con tripsina o pepsina Peptona de caseína (tripteína): Tratamiento de caseína con tripsina. Altos contenidos en triptofano. Peptona de soja: Digestión de soja con papaína. Medio definido Glucosa, sacarosa o cualquier otro compuesto carbonado NH 4 Cl, (NH 4 ) 2 SO 4, aa, bases nitrogenadas

12 Medio mínimo definido para Bacillus megaterium Medio definido para Medio definido para Thiobacillus thiooxidans, un quimiolitoautótrofo del azufre

13 Medio definido para un quimilitoautotrofo que oxida amonio (Nitrosomas) Medio definido para un quimiorganoheterótrofo Medio complejo para p j p quimiorganoheterótrofo (agar nutritivo)

14 Medio definido para el crecimiento de bacterias quimioorganoheterótrofas fastidiosas como Neisseria gonorreae

15 Medio complejo para bacterias fastidiosas Medio complejo para halófilos extremos

16 Efecto del oxígeno sobre el crecimiento

17 Atmósferas de incubación Crecimiento en anaerobiosis Etf Estufas y jarras de anaerobiosis (generadores de gases) Creciemiento en aerobiosis i Medios líquidos: Agitación. Sólidos: en atmósfera normal (78 % N 2, 21 % O 2, 0,03 % CO 2 ) Temperatura de incubación

18 Otros medios de cultivo Medios enriquecidos: medio que tiene un gran exceso de nutrientes y se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. Medios diferenciales: medio que permite revelar características fisiológicas de los microorganismos. Medios selectivos: medio que sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Medios de enriquecimiento: Es un medio que permite el desarrollo de un grupo de microorganismos a partir de una muestra que contiene una gran variedad de microorganismos. Se utiliza un medio selectivo líquido y se incuba bajo determinadas condiciones.

19 Agar columbia CNA Medio muy nutritivo Contiene peptonas, extractos de levadura y corazón, almidón. Medio selectivo colistin y ácido nalidíxico Inhiben G - S. epidermidis en agar Columbia CNA Agar MRS (Man, Rogosa y sharpe) Medio enriquecido para Lactobacillus. Contiene Extratos, peptonas, glucosa, factores de crecimiento (tween 80, Mn, Mg), citrato (inhibición G -) Poca selectividad Lactobacillus lacticus en MRS agar

20 Levine EMB Agar Medio para enterobacterias diferencial y selectivo Contiene: Peptona Lactosa Eosina Azul de metileno Permite diferenciar entre los microorganismo capaces de fermentar la lactosa de los que no. No fermentador de lactosa Fermentador de lactosa Fermentador de lactosa, con brillo verde brillante (E. coli )

21 Mac Conkey Agar Medio para diferenciar enterobacterias Selectivo y diferencial Contiene: Peptonas Lactosa Sales Biliares y cristal violeta E. coli Purpura de bromocresol Lactosa (+) colonias Amarillas Lactosa ( - ) colonias transparentes o blancas E. coli Proteus

22 Agar sangre Medio enriquecido y diferencial Se adiciona al medio sangre. Permite el crecimiento de bacterias con requerimientos nutricionales exigentes. Permite distinguir tres patrones de hemólisis: αβγ Agar chocolate Medio enriquecido Haemophilus influenzae Agar con el agregado de sangre, calentado suave. Suministra factores de crecimiento para bacterias exigentes. (Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrheae)

23 Agar manitol salado Medio para aislar Staphylococcus Contiene: Peptonas Manitol Cloruro de sodio 75%( 7,5 (vs 05%) 0,5 Rojo fenol Selectivo y diferencial Fermentación manitol acidez Colonias amarillas No fermentación manitol Colonias rosadas S.aureus S epidermidis

24 Baird-Parker Medio para distinguir Staphyloccocus aureus. Selectivo y diferencial Contiene: Peptonas Extractos Cloruro de litio Glicina Piruvato de sodio Se suplementa con yema de huevo emulsionada con telurito de potasio Glicina + piruvato promueven el crecimiento de Staphyloccocus S. aureus S. aureus reducción telurito a telurio, lecitinasa (-) S. Epidermidis reducción de telurito, lecitinasa (+) Colonias negro-grisáceo rodeada por zona clara Colonias negro-grisáceas, sin zona clara

25 Agar cetrimida Medio para Pseudomonas Selectivo, parcialmente diferenciali Contiene: Peptona Cloruro de magnesio Sulfato de potasio Cetrimida (detergente catiónico, bromuro de cetiltrimetil amonio) Adición de ácido nalidíxico P. aeruginosa en agar cetrimida Producción de pigmentos pioverdina Colonias amarillo verdosas piocianina, piorrubina pioverdina

26 Agar Mossel Medio para aislar Bacillus cereus selectivo y diferencial Contiene: Peptonas Extractos tactos Manitol Rojo fenol Adición de yema de huevo y polimixina B Bacillus cereus: no es capaz de utilizar el manitol (M -), produce la exoenzima lecitinasa (L+) Saphilococcus aureus: es capas de utilizar manitol (M +), no produce la exoenzima lecitinasa i (L-) Colonias rosadas con precipitado blanco Colonias amarillas con precipitado p blanco

27 Salmonella y Shigella Agar Medio selectivo y diferenciali para Salmonellas ll y Shigellas Contiene Peptonas Extractos Lactosa Sales biliares y verde brillante Citrato férrico Tiolsulfato sódico Rojo neutro Salmonella, producción de ác. sulfìdrico, lactosa (-) Salmonella typhimurium Shigella flexneri Colonias transparentes con centro negro Shigella, lactosa (-) Colonias transparentest E. coli, lactosa (+) Colonias rosadas a rojas

28 Indicadores de ph ROJO NEUTRO Rango de ph: (rojo a amarillo) AZUL DE BROMOTIMOL Rango de ph: (amarillo a azul). ROJO DE FENOL Rango de ph: (amarillo a rojo) AZUL DE TIMOL Rango de ph: ( (rojo a amarillo) y : (amarillo a azul). PURPURA DE BROMOCRESOL Rango de ph: (amarillo a púrpura) ROJO DE CRESOL Rango de ph: (amarillo a rojo).

29 Técnicas básicas de microbiología

30 Siembra en placa: Agotamiento por estría Obtención de colonias aisladas

31 Siembra en agar g inclinado

32 Inoculaciones en medio solido en tubos

33 Pasaje de cultivos líquidos

34 Siembra por extensión y por vertido de placa

35 Siembra por extensión con espátula de Drigalsky

36 Medida del crecimiento Por masa celular 1) Determinación del peso seco /húmedo 2) Determinación del N total : proteico o no proteico 3) Determinación de componentes celulares: ADN, ARN, proteínas 4) Métodos turbidimétricos (densidad óptica)

37 Medición de la turbidez: métodos espectofotométricos

38 Curva de calibración λ = 600 nm

39 Medida del crecimiento Por medida del número de individuos 1) Recuento directo Cámara de Petroff-Hauser (para bacterias) Cámara de Thomas (para levaduras) 2) Contadores electrónicos de partículas (Contador Coulter) 3) Recuento de viables en placa 4) Recuento de viables sobre filtro en placa

40 Recuento directo de microorganismos al microscopio Cámara de Petroff-Hausser muestra Área total: 1 mm 2 Altura: 0,02 mm Volumen: 0,02 mm 3 = 0,00002 cm 3 Nº cél/ml = promedio cél x 25 x

41 Recuento de células viables: método de recuento en placa UFC/ml= N/ (vol x dil)

42 Problemas de Diluciones DO 600 = 0,35 0,1 DO = 5x10 8 bact/ml V final de cada dilución será de 0,1 ml Un cultivo de E. coli creceenfaselogarítmica y tiene una DO de 0,6 unidades. Se sabe que cuando el cultivo tiene una DO de 0,4 unidades, la concentración bacteriana es de 1x10 8 bacterias/ml. Qué dilución haría y qué volumen sembraría para realizar el recuento de viables cuando la DO es 0.6 U?.

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44 Conservación de cultivos puros (axénicos) Preservar la viabilidad y estabilidad genética. Evitar la contaminación En estría sobre agar inclinado en heladera (5ºC) Solo unos meses Congelados a -20 ºC, 70 ºC ó ºC en caldo con 20 % glicerol u otro crio persevante (por ejemplo leche) De meses a años Liofilizados Tiempos largos Los repiques sucesivos NO son un método de conservación Los repiques sucesivos NO son un método de conservación de microorganismos