PRUEBAS DE SENSIBILIDAD Y RESISTENCIA ANTIMICROBIANA

Transcripción

1 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana PRUEBAS DE SENSIBILIDAD Y RESISTENCIA ANTIMICROBIANA Christian Trigoso Agudo Resumen: Las pruebas de susceptibilidad permiten determinar si un patógeno es susceptible o resistente frente a un grupo de antimicrobianos. Tal información es crítica para que el clínico pueda seleccionar el antimicrobiano más adecuado para el tratamiento de la infección que afecta al paciente. Para que dicha información sea válida es necesario que en el laboratorio observe estrictamente una serie de procedimientos estandarizados, de tal manera que dicha información sea reproducible. El presente estudio describe las pruebas de laboratorio utilizadas para determinar la sensibilidad y resistencia de patógenos intrahospitalarios. Palabras claves: Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana. Patógenos intrahospitalarios Correspondencia: Dr. Christian Trigoso Agudo christiantrigoso@yahoo.com 341

2 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud INTRODUCCION Definición Se puede estudiar en el laboratorio el comportamiento de los microorganismos en general, y particularmente las bacterias, frente a los antimicrobianos. Es obvio que la respuesta que exhiban las bacterias frente a los antimicrobianos nunca será similar a lo que ocurre en el organismo humano; sin embargo como fruto del análisis estadístico, de la información derivada de muchos estudios y a partir de la normalización de los procedimientos de laboratorio, es que los resultados obtenidos in vitro alcanzan un sólido valor de orientación para el médico tratante. Las bacterias pueden considerarse susceptibles o sensibles, intermediariamente susceptibles o resistentes a los antimicrobianos. La designación susceptible indica que el antimicrobiano producirá alteraciones reversibles o irreversibles en el crecimiento de una cepa bacteriana particular. Esto implica en un sentido mas general que el proceso infeccioso causado por dicha cepa bacteriana puede ser tratado apropiadamente con dosis convencionales del antimicrobiano estudiado, a menos que hubiera contraindicaciones. En algunos casos en el laboratorio se detectan cepas que presentan una respuesta de susceptibilidad intermedia lo que significa en clínica que las infecciones causadas por dichas cepas pueden ser inhibidas utilizando concentraciones mas elevadas del antimicrobiano. Esto implica que las dosis empleadas puedan ser aumentadas ó que el antimicrobiano posea características farmacocinéticas que le permitan ser concentrado fisiológicamente en el tejido infectado (por ejemplo, concentración de beta lactámicos en la orina o de fluoroquinolonas en el tejido pulmonar). Finalmente existen otros casos en los que las bacterias exhiben un comportamiento resistente, lo que significa que se estaría manifestando la capacidad potencial de mostrar un estado refractario a la acción de los antimicrobianos, causado por fenómenos genéticos ó no genéticos; siendo posible verificar en el laboratorio que esta cepas no son inhibidas por las concentraciones séricas normalmente alcanzadas a dosis habituales. Llegados a este punto en necesario también referirnos a los llamados puntos de corte (breakpoints), términos usados para explicar que los diámetros de los halos de inhibición, determinados por el método de difusión, correlacionan 342

3 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana inversamente con la CIM (Concentración Inhibitoria Mínima) de las pruebas por dilución. La correlación entre los puntos de corte de la CIM y los diámetros de los halos se determinó basándose en curvas de regresión entre estos dos aspectos, la distribución poblacional, el análisis farmacocinético y los estudios de eficacia clínica. REGLAS DE ORO Para desarrollar cualquier método que permita detectar la respuesta in vitro bacteriana frente a los antimicrobianos, se debe respetar un conjunto de reglas que imprescindiblemente se deben seguir, de manera que se asegure una correcta interpretación de los resultados obtenidos. Estas reglas han sido llamadas de oro por su carácter de obligatoriedad y aplicabilidad en beneficio de un trabajo idóneo: 1. Para llevar a cabo un antibiograma, siempre se debe trabajar con cepas puras (aisladas) e identificadas apropiadamente. 2. El antibiograma se debe ejecutar con cepas bacterianas que se hallen en la fase de crecimiento exponencial. 3. Las cepas bacterianas serán estudiadas por método de difusión (con discos) y deben corresponder a bacterias aeróbicas o anaeróbico facultativas. 4. Asimismo estas cepas debe ser de crecimiento rápido y aislamiento sencillo, salvo algunas excepciones. 5. En todos estos procedimientos se debe verificar un estricto control de calidad interno. CLASIFICACION DE LOS METODOS En el laboratorio, podemos utilizar dos grandes opciones para ejecutar pruebas que detecten la susceptibilidad y/o resistencia de las bacterias frente a los antimicrobianos: 1. Métodos de difusión - Método de Kirby-Bauer - Método del E Test (epsilón test) 2. Métodos de dilución - Método de la Macrodilución - Método de la Microdilución 343

4 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud Sin duda alguna el método de antibiograma mas utilizado y difundido en todo el mundo es el de Kirby y Bauer, estos autores junto a Sherris y Turck publicaron las directrices de este procedimiento (Antibiotic Susceptibility Testing by a Standardized Single Disk Method, Am J Clin Pathol. 1966; 45: ) y desde entonces se ha popularizado por el costo y la reproductibilidad de sus resultados, de hecho en nuestro país también se utiliza este método. NORMAS PARA LA EJECUCION DEL ANTIBIOGRAMA Para normalizar todos los procedimientos laboratoriales de susceptibilidad en general y el de Kirby-Bauer en particular, existen normas que rigen en determinadas regiones geográficas, por ejemplo la norma para Francia está dada por la Sociedad Francesa de Microbiología, en Inglaterra rige la norma de la Sociedad Británica de Antimicrobianos y en Suecia el grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos, en América y otras regiones del orbe rige la norma del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) a través de su Subcommittee of Antimicrobial Susceptibility Testing. Institución que publica cada año las normas actualizadas para ejecutar estos procedimientos. PROCEDIMIENTO DE KIRBY-BAUER Antes de iniciar el procedimiento es necesario comentar acerca de los medios de cultivo que se utilizan en este proceso. Dado que este método se halla estandarizado para bacterias no exigentes desde el punto de vista nutricional (salvo contadas excepciones) es que se utiliza el Medio de Mueller Hinton, debido a su baja cantidad de ácido p - amino benzoíco, residuos de timina timidina, cationes divalentes ajustados, transparencia para la correcta lectura de halos y buena reproductibilidad de lote a lote. En aquellos casos de bacterias nutricionalmente exigentes (aislamiento fastidioso) se utilizan: Agar HTM (Haemophilus Test Médium) enriquecido con hematina bovina y NAD para el desarrollo de Haemophilus influenzae, Agar GC enriquecido con suplemento de composición definida (cisteina, guanina, tiamina, PABA, vitamina B12, cocarboxilasa, NAD adenina, L glutamina y nitrato férrico) para el desarrollo de Neisseria gonorrhoeae, Agar Mueller Hinton Enriquecido con 5% de sangre desfibrinada de carnero para el desarrollo de Streptococcus pneumoniae y eventualmente otros estreptococos. Es importante apuntar que la profundidad de estos medios de cultivo ya dispensados en las cajas Petri de tamaño normal (100 mm de diámetro) debe ser igual a 4 mm (25 a 32 ml por cada caja). 344

5 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana Dentro de los programas de control de calidad interno en la preparación de estos medios se debe considerar: el ph (7,2 7,4). Humedad, efecto de residuos de timidina, y variación en la composición de cationes divalentes (Ca++ y Mg ++ principalmente). A. Procedimiento A partir del cultivo puro (aislado) e identificado, tómese con una asa bacteriológica 3 a 5 colonias dependiendo del tamaño de estas, suspenderlas en un tubo de ensayo que contenga 5 ml de suero fisiológico, caldo de Mueller Hinton o agua destilada. De acuerdo al microorganismo, en algunos casos se ajusta directamente la turbidez y en otros casos se incuba hasta alcanzar la turbidez necesaria. Esta turbidez debe ser igual a 0,5 de la escala de McFarland (1 a 2 x 10 8 UFC de enterobacterias/ ml), para lo cual se puede ajustar visualmente utilizando una tarjeta blanca en la que se hacen líneas negras de diferente grosor (tarjeta Vickerham) que luego permiten servir de contraste para la comparación simultanea del patrón de turbidez y el inoculo preparado. Este patrón de turbidez está compuesto por SULFATO DE BARIO (BaSO4) que se prepara mezclando 99.5 ml de H2SO4 y 0.5 ml de Cl2Ba, estos patrones deben ser renovados por lo menos cada seis meses. Para confirmar la densidad se puede utilizar un espectrofotómetro en el que la lectura de absorbancia con filtro de 625 nm debe ser igual a en la actualidad también se utiliza un colorímetro de fácil uso (VITEK) que permite ajuste rápidos a 0,5 de McFarland. Con un hisopo estéril, previamente humedecido con el inoculo y presionado el mismo contra las paredes del tubo para desechar el exceso de muestra, proceder a sembrar sobre toda la superficie del medio de cultivo barriendo en tres direcciones (siempre junto a la llama del mechero) e intentando no volver a pasar por donde ya se sembró (hacer rotar la caja 60º en cada siembra), dejar reposar 5 a 15 minutos las cajas a temperatura ambiente. Proceder a colocar los discos de antibiograma (discos de papel filtro impregnados con un antimicrobiano y a una concentración establecida), utilizando una pinza anatómica flameada levemente a la llama del mechero. En las cajas Petri con un diámetro de 100 mm se debe colocar como máximo hasta 5 discos, y en las cajas Petri con diámetro de 150 mm se puede colocar hasta 12 discos. También es necesario considerar que entre disco y disco debe existir una distancia mínima de 2.5 cm. 345

6 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud Para facilitar esta disposición se puede marcar con un lápiz graso en la parte externa de las cajas Petri (contratapa los puntos en los cuales luego se colocarán los discos. Existen también despachadores automáticos que presentan cartuchos con los discos que se pueden utilizar, de manera que simplemente se coloca este aparato sobre las cajas ya sembradas y se procede a presionar el control de despacho, con lo cual caerán los discos sobre la caja. IMPORTANTE: Guardar los discos a 4ºC y extraerlos por lo menos a 2 horas antes de utilizarlos para que se atemperen. - Incubar las cajas Petri invertidas a 35ºC dentro de los 15 minutos posteriores a la colocación de los discos. Solo en el caso de Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus pneumoniae se debe incrementar con un 5% de CO2 la incubación. Lectura e interpretación - Después de 18 horas de incubación a 35ºC se procede a medir los halos que se hubieran presentado para lo cual se utiliza una regla o calibro. En el caso de que el microorganismo estudiado sea un estafilococo o un enterococo incubar hasta las 24 horas para leer la respuesta a la oxacilina y la vancomicina respectivamente. A veces es posible observar en cepas de Proteus spp. un velo del swarming en el interior de los halos, este debe ser ignorado. - La interpretación se realiza con tablas provistas por el CLSI, de manera que en estos documentos se puede encontrar todos los puntos de corte, lectura de halos, su correlación con los valores de CIM, y la interpretación (susceptible, intermedio o resistente) para cada grupo bacteriano. Es importante también establecer que todo el procedimiento, así como las lecturas se deben realizar con el correspondiente control de calidad interno. BREVE COMENTARIO SOBRE LOS METODOS QUE UTILIZAN LA DILUCION - Estos procedimientos se basan en lograr diluciones seriadas de un antimicrobiano en un medio de cultivo líquido idóneo para este tipo de trabajos, desde ya todos estos métodos están regidos por el CLSI y deben ser sometidos a estrictos controles de calidad tanto internos como externos. La Macrodilucion utiliza tubos de ensayo 346

7 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana y la Microdilución utiliza microplacas con pocillos para colocar allí tanto la dilución del antimicrobiano como la alícuota bacteriana correspondiente. - Sin duda alguna este es un método ideal para realizar antibiogramas, dado que nos permite conocer la mínima concentración del antimicrobiano con la cual se inhibió el bacteria en cuestión, sin embargo advertirá el amable lector que este es un procedimiento muy costoso y que por lo general solo se debe aplicar cuando se desea confirmar un estado de resistencia además de cuantificarlo, en otras palabras es una excelente herramienta para estudios de corte epidemiológico (vigilancia epidemiológica de la resistencia bacteriana en un ámbito geográfico definido). FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO - PH del medio - Composición del medio - Temperatura de incubación - Tamaño del inoculo - Duración de la incubación Metabolismo bacteriano - Aireación 347

8 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud GUIA DE LABORATORIO PARA REALIZACIÓN DE ANTIBIOGRAMA, COLOCACIÓN DE DISCOS, INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS, Y REPORTE FINAL 1.- Enterobacterias.- 1ra. LINEA.- PLACA 1: AMC CTX CAZ CTN AMP CTX AMC CTN CAZ AMP PLACA 2: CXT NAL GEN CXT NAL GEN 2da. LINEA.- CHL AMK IMP CAZ (1) IMP AMK CAZ CHL (1) Colocar el disco de CAZ al lado del de IMP (2 cm) para detectar otras BLEEs 348

9 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana Interpretación.- AMPc: RESISTENCIA a todos los beta lactámicos ((AMPICILINA, AMOXICILINA, CEFALOSPORINAS DE 1ra. GENERACIÓN, 2da. GENERACIÓN, 3ra. GENERACIÓN, y MONOBACTAMAS), manteniendo SENSIBILIDAD a los CARBAPENEMAS y CEFALOSPORINAS DE 4ta. GENERACIÓN. BLEA: RESISTENCIA generalmente expresada a AMPICILINA, AMOXICILINA y probablemente a CEFALOSPORINAS DE 1ra. GENERACIÓN. SENSIBILIDAD a las CEFALOSPORINAS de 2da. GENERACIÓN, 3ra. GENERACIÓN y 4ta. GENERACIÓN, MONOBACTAMAS Y CARBAPENEMAS. Eventualmente debieran ser también SENSIBLES a INHIBIDORES DE BETA LACTAMASA ASOCIADOS A BETA LACTÁMICOS. BLEE: RESISTENCIA a todos los beta lactámicos (AMPICILINA, AMOXICILINA, CEFALOSPORINAS DE 1ra. GENERACIÓN, 2da. GENERACIÓN, 3ra. GENERACIÓN, 4ta. GENERACIÓN y MONOBACTAMAS), manteniendo SENSIBILIDAD sólo a los CARBAPENEMAS. Eventualmente debieran ser también SENSIBLES a INHIBIDORES DE BETA LACTAMASA ASOCIADOS A BETA LACTÁMICOS. REPORTAR: AMP (1), NAL (2),, CTN,, CXT, GEN, C2G (3), C3G (4), IBLABL (5) (1) NO reportar en Klebsiella spp. y Enterobacter spp. pues exhiben RESISTENCIA de base. (2) Si mostrara RESISTENCIA al ÁCIDO NALIDIXICO se debe informar SENSIBILIDAD DISMINUÍDA a la ROFLOXACINA (sin importar el diámetro del halo). (3) CEFALOSPORINAS DE 3ra. GENERACIÓN (4) CEFALOSPORINAS DE 4ta. GENERACIÓN (5) INHIBIDORES DE BETA LACTAMASA ASOCIADOS A BETA LACTÁMICOS. 349

10 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud INFECCIONES DE TRACTO URINARIO NO COMPLICADAS.- 1ra. LINEA.- PLACA 1: AMP CXM CTN (1) SAM AMP CXM CTN SAM PLACA 2: NIT (2) NAL GEN NIT NAL GEN (1) Si NO presentara halo de inhibición frente a la CEFALOTINA, buscar RESISTENCIA tipo BLEE, procediendo a repetir el antibiograma con el modelo de la PLACA 1 correspondiente a Enterobacterias. (2) Si exhibiera SENSIBILIDAD a la NITROFURANTOINA, entonces NO es Proteus. spp., Morganella morganii, Providencia spp., Serratia spp REPORTAR (ITU): AMP, NAL, NIT,, CTN, /NOR, GEN, C2G, IBLABL Salmonella / Shigella.- (Sólo para Diarreas) 1ra. LINEA.- PLACAS : AMP AMP AMP NAL CHL (1) CPD CHL NAL NIT NIT (2) NAL CPD CPD (3) (1) Solo para Salmonella (2) Solo para Shigella 350

11 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana (3) CEFPODOXIMA. Si los halos de inhibición frente a CPD fueran a 17 mm, proceder a ensayar discos de CTX, CAZ y AMC para detectar BLEEs. Usar los puntos de corte especiales recomendados por CLSI para E. coli, Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca (Tabla 2A (Continued), página 57, M100-S15,CLSI) REPORTAR: Para Salmonella: AMP, NAL,,, CHL Para Shigella: AMP, NAL,,, NIT Salmonella.- (Infecciones Sistémicas) 1ra. LINEA.- PLACA 1: AMC CTX CAZ AMP CRO AMC CTX CAZ AMP CRO PLACA 2: CHL NAL (1) GEN (2) CHL NAL GEN (1) Si mostrara RESISTENCIA al ÁCIDO NALIDIXICO se debe informar SENSIBILIDAD DISMINUÍDA a la ROFLOXACINA (sin importar el diámetro del halo). NO reportar este disco. (2) NO reportar, solo sirve para estudios epidemiológicos de evolución de la resistencia. REPORTAR: AMP, CTX, CAZ, CRO,,, CHL 351

12 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud 2.- Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp. (Diferenciar correctamente cepas comunitarias de intrahospitalarias) 1ra. LINEA.- P. aeruginosa PLACA 1: FEP MER CAZ IMP EDTA FEP MER CAZ EDTA IMP PLACA 2: AMK AZT GEN AMX GEN AZT 1ra. LINEA.- Acinotebacter spp. PLACA 1: FEP MER CAZ IMP SAM CAZ FEP IMP MER SAM PLACA 2: AMK GEN MIN REPORTAR: Para P. aeruginosa: GEN, CAZ, FEP, AZT, IMP, MER,, AMK Para Acinetobacter spp.: GEN, CAZ, FEP, IMP, MER, AMK,, SAM, MIN, 352

13 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana Stenotrophomonas maltophilia.- Solo se debe probar: MINOCICLINA, LEVOFLOXACINO y COTRIMOXAZOL Debiendo reportarse también solo estos antimicrobianos. Burkholderia cepacia.- Solo se debe probar: MINOCICLINA, CEFTAZIDIMA y MEROPENEM Debiendo reportarse también solo estos antimicrobianos. 3.- Estafilococos.- (Diferenciar correctamente cepas comunitarias de intrahospitalarias) 1ra. LINEA.- PLACA 1: OXA OXA ERY MIN CLI (1) CLI MIN (2) ERY PLACA 2: PEN GEN CXT CHL El comportamiento frente a la METICILINO RESISTENCIA se establece usando los discos de OXA y /o CXT. Advertir que los puntos de corte son diferentes en S. aureus y Estafilococos Coagulasa Negativa frente a la OXA. (1) Colocar el disco de ERY a 15 mm (de borde a borde) del de CLI para detectar el mecanismo resistencia MLSB, además que se puede extrapolar la lectura de ERY para todos los macrólidos (AZI, ROX, CLA) y CLI para la LIN. (2) La lectura de TET se puede extrapolar para todo el grupo de las tetraciclinas, aunque en algunas circunstancias MIN puede ser más efectiva. (*) La CLSI 2009 recomienda probar Vancomicina sola por CIM 353

14 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud INFECCIONES DE TRACTO URINARIO NO COMPLICADAS.- En S. saprophyticus (Infección de Tracto Urinario) solo probar CXT y no OXA, además de los otros antimicrobianos 1ra. LINEA.- PLACA 1: CXT (3) NIT GEN CXT GEN NIT (3) CXT permite leer la probabilidad de meticilino Resistencia. REPORTAR (ITU): METICILINA (CXT),, NIT, GEN REPORTAR (En todos los demás casos): OXA, SAM (4), AMC (4), CTN (4), VAN, ERY (5), CLI / LIN (5),, GEN,, CHL, MIN / TET (4) Seguir la siguiente interpretación: PEN SENSIBLE Y OXA / CXT SENSIBLE : Demuestra SENSIBILIDAD conservada a todos los beta lactámicos. PEN RESISTENTE Y OXA / CXT SENSIBLE: Demuestra SENSIBILIDAD conservada a inhibidores de beta lactamasa asociados a beta lactámicos, penicilinas penicilinasa resistentes, carbapenemes y cefalosporinas. PEN RESISTENTE Y OXA /CTX RESISTENTE: Demuestra RESISTENCIA a todos los beta lactámicos desarrollados hasta la fecha. SENSIBILIDAD sólo frente a la VANCOMICINA 354

15 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana 5) Seguir la siguiente interpretación: CLI Fenotipos ERY Mecanismo de Resistencia Informe S c/a (*) R Metilasa inducible R CLI/LIN R R Metilasa constitutiva R CLI/LIN S s/a (**) S Eflujo S CLI/LIN R ERY S S Ausente S CLI/LIN, ERY (*) Con achatamiento del halo de CLI (**) Sin achatamiento del halo de CLI 4.- Enterococos.- (Diferenciar correctamente cepas comunitarias de intrahospitalarias) 1ra. LINEA.- PLACA 1: AMP TEI VAN GENac (1) SAM (2) TEI GEN ac AMP VAN SAM (1) GEN debe ser de ALTA CARGA (120 µg): - Resistencia de Bajo Nivel (RBN) Si los halos de inhibición son iguales o mayores a 10 mm de diámetro. Predice SINERGIA con ß lactámicos y Glicopéptidos. 355

16 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud - Resistencia de Alto Nivel (RAN) Si los halos de inhibición son iguales o menores a 6 mm de diámetro. Predice AUSENCIA de sinergia con ß lactámicos y Glicopéptidos. (2) Si fuera necesario, detectar la producción de beta lactamasa por el método de NITROCEFÍN (sobre todo si se trata de infecciones sistémicas y con RESISTENCIA DE ALTO NIVEL frente a la GEN) NOTA.- NO olvidar que para enterococos NO se debe probar: OXA, CLI, LIN,, ni CEFALOSPORINAS. E. faecium tiene RESISTENCIA de base a PEN, AMP, AMC, IMP REPORTAR: AMP, GEN (*), TEI, VAN, SAM, AMC (*) Reportar: BNR ó ANR y aclarar al pie del antibiograma cual es la interpretación de estas siglas y su significado clínico. ENTEROCOCOS VANCOMICINO RESISTENTES.- Si se presentara el caso de Enterococos Vancomicino Resistentes (EVR), ampliar el antibiograma con un segundo panel de antimicrobianos: 2da. LINEA.- PLACA 2: TET CHL MIN RIF (*) CHL TET RIF MIN (*) Utilizada solo en casos MUY NECESARIOS y sobre la base de evidencia laboratorial contundente de vancomicino resistencia. REPORTAR: TET, MIN, CHL, RIF 356

17 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana INFECCIONES DE TRACTO URINARIO NO COMPLICADAS.- Para Enterococus spp. en Infección de Tracto Urinario probar los siguientes antimicrobianos: 1ra. LINEA.- REPORTAR (ITU): PLACA 3: AMP TEI VAN NIT AMP VAN TEI NIT AMP, TEI, VAN, /NOR, NIT 5.- Streptococcus pneumoniae.- El antibiograma debe ser desarrollado en Medio Mueller Hinton con sangre desfibrinada de cordero al 5% y con 5% de CO2 1ra. LINEA.- PLACA 1: OXA (1) TET ERY CLI LEV (2) ERY TET OXA LEV CLI (1) El Tamizaje de Oxacilina puede leerse e interpretarse de la siguiente manera: Sensibilidad Disminuída a la Penicilina (SDP): Halo de inhibición 19 mm Sensibilidad a la Penicilina (SP): Halo de inhibición 20 mm Las cepas SP son también sensibles a AMP, AMX, SAM, AMC, CTN, CFR, CEX, CTX, CRO, IMP, MER NO se puede reportar RESISTENCIA solo con la lectura del disco de OXA, en todo caso el informe será hecho con la sigla SDP y la cepa deberá ser enviada inmediatamente al INLASA para realizar el estudio de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) frente a PEN y CTX 357

18 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud Solamente si se detectara una cepa RESISTENTE a Cefalosporinas de 3ra. Generación, se procedería a realizar un nuevo antibiograma incorporando el disco de VANCOMICINA. (2) Para incorporar el disco de se debe controlar rigurosamente el medio de cultivo, sobre todo el enriquecimiento con la sangre apropiada. REPORTAR: PEN (1), ERY (2), CLI, TET, LEV, (1) Pese a utilizar el disco de OXA, se debe reportar PEN pero con las siglas SDP ó SP, de acuerdo al comportamiento observado en el antibiograma. (2) Colocar el disco de ERY a 15 mm (de borde a borde) del de CLI para detectar el mecanismo resistencia MLSB, además que se puede extrapolar la lectura de ERY para todos los macrólidos (AZI, ROX, CLA) y CLI para la LIN. (3) La lectura de TET se puede extrapolar para todo el grupo de las tetraciclinas, aunque en algunas circunstancias MIN puede ser más efectiva. 6.- Otros Estreptococos.- No es necesario hacer antibiograma para estreptococos ß hemolíticos, dada la SENSIBILIDAD uniforme que exhiben frente a los beta lactámicos en general y a la PENICILINA en particular. Si fuera imprescindible realizar este procedimiento, solo se evaluarán los siguientes discos: 1ra. LINEA.- PLACA 1: PEN (1) ERY (2) CLI CLI PEN ERY (1) Los estreptococos sensibles a la PENICILINA pueden ser considerados sensibles a la AMPICILINA, AMOXICILINA, AMOXICILINA/CLAVULANATO, AMPICILINA/ SULBACTAM, CEFACLOR, CEFAZOLINA, CEFEPIME, 358

19 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana CEFOTAXIMA, CEFTRIAXONA, CEFUROXIMA, CEFALOTINA, CEFAPIRINA, CEFRADINA, IMIPENEM, MEROPENEM y CEFTIBUTEN (solo los estreptococos del Grupo A) (2) Colocar el disco de ERY a 15 mm (de borde a borde) del de CLI para detectar el mecanismo resistencia MLSB, además que se puede extrapolar la lectura de ERY para todos los macrólidos (AZI, ROX, CLA) y CLI para la LIN. REPORTAR: PEN, ERY, CLI 7.- Haemophilus spp..- El laboratorio clínico solo debería realizar pruebas de DETECCIÓN DE BETA LACTAMASA y CLORANFENICOL ACETIL TRANSFERASA, dado que es imprescindible utilizar el medio HTM suplementado para el método de difusión de discos y este medio de cultivo es costoso y no disponible en todo el país. Si fuera necesario desarrollar el antibiograma para estas bacterias, se debe utilizar los siguientes discos: 1ra. LINEA.- PLACA 1: AMP CHL CXM AMP CHL CXM REPORTAR: AMP, CHL,,, CXM 359

20 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud 8.- Neisseria gonorrhoeae.- El laboratorio clínico solo debería realizar pruebas de DETECCIÓN DE BETA LACTAMASA, dado que es imprescindible utilizar el medio GC suplementado para el método de difusión de discos y este medio de cultivo es costoso y no disponible en todo el país (INLASA realiza este procedimiento como parte de los métodos confirmatorios, a partir de las cepas que provienen de la Red Nacional de Bacteriología Clínica Bolivia). Si fuera necesario desarrollar el antibiograma para estas bacterias, se debe utilizar los siguientes discos: 1ra. LINEA.- PLACA 1: PEN CRO TET SPE PEN CRO TET SPE REPORTAR: PEN, CRO, TET / DOX, SPE, 9.- Neisseria meningitidis.- A partir del año 2006 se han publicado puntos de corte en CLSI para este microorganismo, pudiendo demás observarse que existen listados tanto para antimicrobianos utilizados terapéuticamente como aquellos utilizados de manera profiláctica. En este manual incluiremos los que se usan en el tratamiento para infecciones, fundamentalmente las del sistema nervioso. El antibiograma se debe realizar en Agar Mueller Hinton con sangre de cordero al 5% y la incubación debe extenderse de 20 a 24 horas debiendo adicionarse 5% de CO2 a las condiciones de incubación. Es imprescindible poseer un nivel de bioseguridad 2 para llevar a cabo estos procedimientos (peligro de aerosoles contaminantes). 360

21 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana 1ra. LINEA (TERAPEÚTICA).- PLACA 1: CTX MER CRO CHL CRO CHL CTX MER REPORTAR: CRO, CTX, MER, CHL APUNTES NECESARIOS.- * Lamentablemente el método de difusión por discos no es idóneo para identificar la sensibilidad o la resistencia por parte de este microorganismo frente a la PENICILINA y/o AMPICILINA, en todo caso se debe practicar pruebas de concentración inhibitoria mínima para determinar estas respuestas. * La profilaxis incluye la utilización de los siguientes antimicrobianos: AZITROMICINA, MINOCICLINA, ROFLOXACINO, SULFONA- MIDAS, RIFAMPICINA Anaerobios.- No realizar antibiograma por el método de difusión de discos (Bauer Kirby), se debe desarrollar procedimientos de Concentración Bactericida Mínima (CIM) muy bien normalizados y solo disponibles para algunas especies. La experiencia terapeútica, el manejo clínico quirúrgico, la epidemiología local en cuanto a bacterias aisladas y su respuesta clínica a los tratamientos instaurados, además de la disponibilidad de Antimicrobianos permitirán la elección adecuada del fármaco Limitaciones del Antibiograma.- NO se puede realizar el método de difusión de discos (Bauer Kirby) debido a las características particulares fisiológicas microbianas, ausencia de soportes de desarrollo apropiado, tiempos de fisión binaria alargados y ausencia de puntos de corte para la lectura e interpretación, a los siguientes microorganismos: Actinomyces, Listeria, Erysipelothrix, Corynebacterium, Bacillus, Moraxella, Borrelia, Leptospira, Treponema, Bordetella, Brucella, Bartonella, Legionella, Mycoplasma, Ureaplasma, Ehrlichia, Rickettsia, Chlamydia, Coxiella. En todo 361

22 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud caso es posible ampliar el estudio de sensibilidad y/o resistencia de algunos de estos microorganismos incorporando procedimientos que permitan establecer la Concentración Inhibitoria Mínima, pero siempre bajo estrictos controles de calidad interno, así como basando la lectura e interpretación en las tablas aportadas por CLSI. CONCLUSIÓN Está definitivamente establecido que realizar un antibiograma en la actualidad se ha convertido en un fascinante desafío para el bacteriólogo, ya que no sólo supone una excelente preparación en las destrezas de laboratorio, sino también y fundamentalmente una sólida formación académica que le permita conocer profundamente los mecanismos de acción de los antimicrobianos, así como los mecanismos de resistencia que eventualmente pueden exhibir fenotípicamente y finalmente una actitud crítica y muy racional para interpretar la riquísima información que se obtiene de las cajas Petri, siempre a favor de alcanzar el uso racional y reflexivo de los antimicrobianos, a través de la opinión plasmada en el reporte de laboratorio, precioso documento que reúne todo el esfuerzo desplegado en pro del paciente y en apoyo del clínico. * Conflictos de Interés: CTA ninguno. BIBLIOGRAFIA 1. COYLE, B. Marie. Manual of antimicrobial suceptibility testing. Ed. American Society for Microbiology TRIGOSO,C.; DAMIANI, E.; JAUREGUI, L. Infecciones nosocomiales causadas por bacilos gram negativos: el impacto de la resistencia antimicrobiana en Bolivia Ed. 1. LNRBC, La Paz, DAMIANI, E.; JAUREGUI, L.; Panoso M., A.. Manual de procedimientos para la detección de Infecciones Intrahospitalarias. ed. 1. LNRBC, La Paz, TORRICO, Elizabeth; TRIGOSO, Christian. Manualde procedimientos y control de calidad interno: Método BAUER KIRBY. Ed 1. LNRBC, La Paz, TRIGOSO, Christian; TORRICO, Elizabeth; RIERA, Esteban; AGUILAR, Sandra. Manual de procedimientos en sensibilidad y resistencia antimicrobiana Ed 1. LNRBC, La Paz, ROSALES, Patricia; RUIZ, Erika y col. Manual de procedimientos bacteriológicos para S. pneumoniae, H. influenza y N. meningitídes. Ed 1. Ministerio de salud y Deportes. La Paz, CLSI. Clinical and laboratory standards institute, M *Performance Standards for Antimicrobial susceptibility testing. Vol TRIGOSO, Christian; DAMIANI, Esther. Guía de Laboratorio para la realización de antibiograma, colocación de discos, interpretación de resultados y reporte final. Ed 1. Ministerio de salud y Deportes. La Paz,

23 Pruebas de sensibilidad y resistencia antimicrobiana PANEL DE DISCOS DE ANTIMICROBIANOS PARA LA REALIZACIÓN DEL MÉTODO DE DIFUSIÓN KIRBY-BAUER (ANTIBIOGRAMA) ANTIMICROBIANO ABREVIATURA CARGA µg AMIKACINA AMK 30 AMOXICILINA/CLAVULANICO AMC 20/10 AMPICILINA AMP 10 AMPICILINA/SULBACTAM SAM 10/10 AZTREONAM AZT 30 CEFEPIME FEP 30 CEFOTAXIMA CTX 30 CEFOXITINA CXT 30 CEFPODOXIMA CPD 10 CEFTAZIDIMA CAZ 30 CEFTRIAXONA CRO 30 CEFUROXIMA CXM 30 CEFALOTINA CTN 30 CLORANFENICOL CHL 30 ROFLOXACINO 5 CLINDAMICINA CLI 2 ERITROMICINA ERY 15 ESPECTINOMICINA SPE 100 GENTAMICINA GEN 10 GENTAMICINA ALTA CARGA GENac 120 IMIPENEM IMP 10 LEVOFLOXACINO LEV 5 MEROPENEM MER 10 MINOCICLINA MIN 30 NALIDIXICO ACIDO NAL 30 NITROFURANTOINA NIT 300 NORFLOXACINO NOR 10 OXACILINA OXA 1 PENICILINA PEN 10 U.I. RIFAMPICINA RIF 5 TEICOPLANINA TEI 30 TETRACICLINA TET 30 TRIMETOPRIMA/SULFAMETOXAZOL 1.25/23.75 VANCOMICINA VAN

24 364 Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud