PRACTICA 3. DETERMINACIÓN DE ENZIMAS RELACIONADAS CON LA MADURACIÓN DE PRODUCTOS VEGETALES

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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO TALLER MULTIDISCIPLINARIO DE PROCESOS TECNOLÓGICOS DE FRUTOS Y HORTALIZAS PRACTICA 3. DETERMINACIÓN DE ENZIMAS RELACIONADAS CON LA MADURACIÓN DE PRODUCTOS VEGETALES Dra. Ma. Andrea Trejo Márquez I.A. Selene Pascual Bustamante En esta práctica se desarrollan los métodos para la determinación de enzimas causantes del pardeamiento como son PDO y PPO. El alumno desarrollará el conocimiento sobre estas enzimas, así como en el uso de equipos y material de laboratorio.

2 OBJETIVO Determinar la actividad de polifenoloxidasa y peroxidasa en diversos productos hortofrutícolas en diferentes estadios de maduración para asociarla la actividad de estas enzimas al tipo de manejo postcosecha del producto. 1. Polifenoloxidasa (PPO) ANTECEDENTES 1.1. Función de PPO en frutas y hortalizas. La polifenoloxidasa, conocida como catecol oxidasa, fenolasa, o o-difenol oxigeno oxireductasa (E.C ), cataliza la oxidación difenoles en presencia de oxigeno molécular. Se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza generalmente en plantas. La localización de la enzima en las células de las plantas depende de la especie y estado de madurez. La distribución de PPO en diferentes partes de frutas y vegetales puede ser diferente ya que la proporción de enzimas solubles varía con la madurez. Dentro de su papel en la naturaleza, la PPO es participe en la cadena de respiración de plantas como una de las oxidasas terminales, sin embargo esto ha sido cuestionado. Mucho más importante es el papel que juega en la resistencia a infecciones microbiológicas o virales en las plantas en un clima adverso. Participa indirectamente en la biosíntesis de auxinas. Por lo que jugar un papel importante en la regulación del crecimiento de las plantas junto con la enzima degradante de la auxina (POD). También participan en el fenómeno denominado pardeamiento enzimático, el cual es consecuencia indirecta del la acción de la PPO en alimentos procesados. 1.2 Bioquímica y mecanismos de reacción Es una enzima que contiene cobre y que cataliza dos diferentes reacciones: (a) la hidroxidación de monofenoles a o- difenoles y (b) la oxidación de o- dihidroxifenoles a o- quinonas, para llevar a cabo estas reacciones se requiere oxígeno molecular. Los extractos enzimáticos de diferentes fuentes poseen estas dos actividades en diferentes proporciones, se ha reportado que en preparaciones de papas, manzanas, champiñones posee ambas actividades y las de tabaco, mango, plátano y pera, se presenta solamente una actividad. El mecanismo que describe la reacción catalizada por PPO es el siguiente: - 2 -

3 1.3. Sustratos Las frutas y hortalizas poseen una amplia variedad de compuestos fenólicos, de los cuales sólo una pequeña parte de estos son sustrato para la PPO. Los más importantes son catequinas ( 3-hidroxiflavanes), ésteres de ácido cinámico ácido clorágenico ( 3- O-cafeoyl-D-ácido quinico) el cual, es el sustrato más encontrado en la naturaleza, el 3,4-dihidroxipenilalanina (L-DOPA) que es el producto de la hidroxilación de tirosina; y la Tirosina la cual siendo un fenol y al mismo tiempo un aminoácido constituyente de proteínas, se encuentra en cada tejido de las plantas ph y temperatura óptima de actividad El valor de ph óptimo de actividad de PPO varía dependiendo la fuente de la enzima, así como también el sustrato en un intervalo relativamente amplio, en la mayoría de los casos va desde ph 4.0 a 7.0. Muchas preparaciones muestran un sólo ph óptimo de actividad y en algunos casos se presenta un segundo ph óptimo que puede ser atribuido a una insuficiente purificación. En cuanto la temperatura óptima de actividad que ha sido mucho menos investigada que el ph óptimo, los datos disponibles indican que la temperatura óptima depende de los mismos factores que depende el ph óptimo. La actividad en melocotones se incrementa de 3 C- 37 C y decrece arriba de 45 C. 1.5 Inhibidores Debido a que la PPO es una metaloproteína con cobre puede ser inhibida por agentes metalo quelantes tales como cianuro, monóxido de carbón, dietil- ditiocarbamato de sodio( DIECA), mercaptobenztiazol, dimercaptopropanol, azide o xanato metilpotasio. Algunos de estos reaccionan también con las quinonas formadas. 1.6 Extracción y purificación Existen tres problemas para extracción de PPO (1) latencia, (2) solubilización de la actividad límite de la célula, y (3) prevención de la oxidación inducida de la enzima y la subsecuente polimerización y precipitación en la proteína enzimática, o fenoles - 3 -

4 endógenos. Para prevenir la oxidación de fenoles durante la extracción enzimática se remueven los sustratos por medio de ligamiento de estos a un polímero insoluble, de los cuales el más utilizado es el Polyvinylpyrrolidone (PVP), es un fuerte receptor de protones y es neutral a ph ácidos en los cuales los fenoles no se encuentran ionizados. Para la purificación de los extractos crudos se utiliza la precipitación con sulfato de amonio a diferentes saturaciones, o por cromatografía en gel en Sephandex G 100 o G 200 y cromatografía de intercambio iónico o diálisis. 1.7 Determinación de actividad enzimática Esta puede ser determinada midiendo (a) la velocidad de desaparición de sustrato o (b) la velocidad de formación de producto. Para determinar la desaparición de sustrato generalmente se mide la absorción de O 2 manométricamente en Wasburg respirómetro, o polarográficamente con un electrodo de oxígeno. La velocidad de formación de producto puede ser determinado espectrofotométricamente mediante la medida de la densidad óptica de compuestos coloreados formados por las quinonas. Este método es muy simple y se presta para análisis de rutina. La linealidad es mantenida por relativamente largos periodos similar al método polarográfico. 2. Peroxidasa (POD) 2.1Función en fruta y hortalizas La peroxidasa (EC ; Donador; Peróxido de hidrógeno oxirreductasa, POD) es similar a la PPO, ya que pertenecen al grupo de oxidoreductasas. Las cuales descomponen peróxido de hidrógeno en presencia de un donador de hidrógeno es una de las enzimas que controlan el crecimiento fisiológico de las plantas, su diferenciación y desarrollo. Es bien conocido, que esta enzima participa en la construcción y lignificación de la pared celular, la biosíntesis de etileno a partir del ácido 1- aminociclopropanocarboxílico y peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ), la regulación de niveles de auxina, la protección contra el deterioro de tejidos e infección por microorganismos patógenos, la oxidación de ácido indolacético, etc.. Por otro lado, hoy día existe un gran interés por la POD debido a sus múltiples aplicaciones prácticas (industria maderera, industria de alimentos, bioquímica clínica, etc.). Se encuentra presente en animales, plantas y microorganismos. En las plantas localizada en la célula parcialmente en forma soluble y en el citoplasma de manera insoluble. La fracción de POD soluble, puede ser extraída de tejidos homogenizados con un buffer de - 4 -

5 fuerza iónica baja La POD se encuentra ampliamente distribuida en las plantas, sin embargo, en la actualidad, la POD de la raíz de rábano silvestre (Armoracia lapothifolia) es la única que tiene aplicación práctica debido a que es la fuente que posee la mayor actividad de esta enzima. 2.2 Bioquímica y mecanismo de reacción La peroxidasa cataliza cuatro tipos de reacción: (a) Peroxidativas (b) Oxidativas (c) Cataliticas y (d) de hidroxilación. La ecuación global del mecanismo de reacción es el siguiente: ROOH Donde: AH 2 POD H 2 O ROH A R = H +, CH 3, C 2 H 5 AH 2 = Donador de hidrógeno en forma reducida A = Donador de hidrógeno en forma oxidada Una gran variedad de compuestos pueden actuar como donadores de hidrógeno, incluyendo fenoles (p-cresol, guayacol, resorcinol) aminas aromáticas (anilina, bencidina, o-fenildiamina, o-dianisedina) nicotinamida-adenina dinucleotida reducida y nicotinamidaadenina dinucleotida fosfato reducida. La reacción oxidativa de POD puede tener lugar en ausencia de peróxido de hidrógeno. Se requiere de O 2 y cofactores como Mn 2+ y un fenol. 2.3 Sustratos Peróxido POD es altamente específica al peróxido, por lo tanto su principal sustrato es H 2 O 2, sin embargo la enzima es inactivada por altas concentraciones de peróxido. Sustrato donador La POD tiene una baja especificidad por los sustratos donadores de hidrógeno: esto es interpretado como resultado de las diferentes especificidades de las isoenzimas de POD presentes en las plantas. Alguno de estos sustratos son: guayacol, o-dianisedina, o- fenildiamina, o-tolidina,3-amino-9-etil-carbazol, 3, 3 -diaminobencidina tetraclorada(dab) p-fenildiamina y o-toludina

6 La afinidad de la POD por el sustrato donador depende de la fuente de la enzima y del grado de pureza de ésta. 2.4 ph y temperatura óptima de actividad El ph óptimo de actividad de la POD varía dependiendo de la fuente de la enzima, la composición de isoenzimas, el sustrato donador y el buffer aplicado. La pérdida de actividad observada en acidificación es atribuida al cambio en la proteína de estado nativo a un estado reversible de desnaturalización. Los cambios de actividad que ocurren con los cambios de ph están relacionados a los cambios estructurales en la molécula de la enzima. 2.5 Inhibidores Similarmente a la PPO, la inactivación de la POD pude ser por químicos que actúan con la enzima misma, o con uno de los sustratos o productos de reacción, tales como cianuro, sulfuro, óxido nítrico, hidroxilamina, DIECA, metabisulfito de sodio. Los inhibidores más utilizados en la práctica industrial son SO 2 y sulfitos, los cuales previenen la pérdida de sabor, pero solo reducen parcialmente la regeneración de la enzima. 2.6 Extracción y purificación Como en muchas frutas y vegetales la enzima está presente en forma soluble. Esta fracción soluble puede ser extraída con agua o con buffer de fuerza iónica baja. 2.7 Determinación de actividad enzimática Puede ser determinada por los métodos espectrofotométricos basados en la formación de compuestos coloreados que ocurre durante la reacción con el hidrógeno y el sustrato donador. También puede ser estimada por el método de densitometria visual, o por la actividad residual después de un tratamiento por calentamiento, así como por la composición de las isoenzimas. EQUIPO: Espectrofotómetro Centrifuga Agitador Vortex Balanza analítica - 6 -

7 MATERIAL: 2 Espátulas 12 Tubos de Microcentrífuga de 1.5 ml 1 Micropipeta 1000 l 1 Micropipeta de 200 l 1 Micropipeta de 100 l Puntas de micropipeta. 1 Cronómetro 4 Celdas para espectrofotómetro. Hielo 10 Tubos de ensaye 20ml Gradilla 1 Guantes Parafilm MUESTRAS Y REACTIVOS: Una o dos especies del producto hortofrutícola en tres estadios de madurez por equipo. Buffer fosfatos 0.2 M, ph 7 Buffer fosfatos 10mM, ph 7.5 Buffer fosfatos 0.05M, ph 5 Dopamina hidroclorada 0.07M Peróxido de hidrogeno (15ml/l) p-fenilendiamina (10mg/ml) Albúmina sérica bovina (1mg/ml) Na 2 CO 3 al 2% en NaOH 0.1M CuSO 4.5H 2 O al 1% - 7 -

8 Tartrato de Na y K al 2% Reactivo de Folin-Ciocalteu Reactivo A Reactivo B PROCEDIMIENTO: Preparación de los extractos crudos. 1. Pesar 200 mg del tejido 2. Triturar en manualmente en mortero utilizando nitrógeno líquido 3. Colocar en tubo de micro centrifuga y agregar 1 ml de buffer fosfatos 0.2M. 4. Agitarlo en el vortex durante 1 minuto 5. Centrifugar en micro centrifuga a rpm durante 15 minutos. 6. Extraer el sobrenadante, colocándolo en otro tubo de micro centrifuga y descartar el pellet. 7. Colocarlo en hielo hasta su determinación. Determinación de la actividad de polifenoloxidasa. La actividad de la polifenol oxidasa se determinara espectrofotométricamente por lo que es importante mencionar algunas consideraciones para el uso del espectrofotómetro. Se debe encender 30 minutos antes de su uso. Ser cuidadosos de no derramar ningún reactivo dentro de este al colocar la celda ya que esto pudiera dañarlo. Ajustar la longitud de onda para cada determinación. 1. En una celda limpia agregar 1.45 ml de buffer fosfatos 10mM con 0.07M de dopamina hidroclorada. 2. Agregar 100 l del extracto crudo 3. Inmediatamente mezclarlo con ayuda de parafilm 4. Rápidamente colocarla en el espectro y medir el aumento en la absorbancia a 420 nm por 4 minutos. 5. Calcular la actividad de la polifenol oxidasa con base en la pendiente de la proporción lineal de la curva 420 nm contra el tiempo. Cálculo: Absorbancia / mg proteína*min*ml. Determinación de la actividad de peroxidasa

9 1. En una celda limpia agregar 1.35 ml de buffer fosfatos 0.05 M con 50 l de Peróxido de hidrogeno y 100 l de p-fenilendiamina (10mg/ml) 2. Agregar 100 l del extracto crudo 3. Inmediatamente mezclarlo con ayuda de parafilm 4. Rápidamente colocarla en le espectro y medir el aumento en la absorbancia a 485 nm por 4 minutos. 5. Calcular la actividad de la peroxidasa con base en la pendiente de la proporción lineal de la curva 485 nm contra el tiempo. Cálculo: Absorbancia / mg proteína*min*ml. Determinación de Proteína. La cantidad de proteína de los extractos se determinará utilizando el método de Lowry. Preparación del reactivo A y reactivo B. Para el reactivo A: se prepara mezclando 100 partes de Na 2 CO 3 (2%) en NaOH 0.1M, una parte de CuSO 4.5H 2 O (1%) y una parte de Tartrato de Na y K (2%). Para el reactivo B: Esta solución se prepara al momento de utilizarla. Reactivo de Folin-Ciocalteu al 40% (v/v), se mantiene en agitación hasta el momento de su uso. 1. Construir la curva patrón utilizando como estándar albúmina sérica bovina (ASB). Para lo cual en tubos de ensaye se van colocar las cantidades de la solución de ASB y agua destilada que se muestran en la tabla Agregar 1 ml del reactivo A, agitar en el vortex y dejar a temperatura ambiente durante 10 min. 3. Posteriormente agregar 10 l del reactivo B, agitar en vortex y dejar a temperatura ambiente 1 hora. 4. Realizar la lectura en espectro a 750 nm. 5. Registrar los resultados para cálculos posteriores. Tabla 1. Preparación de tubos para la construcción de la curva patrón de proteína Muestra Solución de ASB ( l) Agua destilada ( l) Blanco Muestra PROBLEMA Alícuota 20 l

10 Calculo de proteína. Los valores de concentración de proteína se determinarán por interpolación gráfica en la curva patrón obtenida. Partiendo de la ecuación de la recta Proteína (mg/ml) = (Absorbancia b) / pendiente * el factor de dilución. Factor de dilución= V final / V inicial Diagrama: Muestras problema Muestras almacenadas Muestras congeladas Hacer observaciones, Apariencia (peso, color). Tomar muestras Pesar muestras Preparación de los extractos crudos Determinar proteína Determinación actividad de Polifenoloxidasa Determinación actividad de Peroxidasa Realizar cálculos

11 Abs 420 /mg.prot.*min. Abs 420 /mg.prot.*min. Procesos Tecnológicos de Frutos y Vegetales Hoja de resultados. Tabla de resultados de muestras almacenadas (Apariencia). Condición de almacenamiento Peso (g) Color Defectos Observaciones Tabla de peso de muestras para enzimas y proteína. Num. De Muestra Peso (g) Gráfico de Curva patrón. Tabla de resultados de actividad de Polifenol oxidasa y Peroxidasa. Num. Muestra Actividad Polifenol oxidasa Actividad de Peroxidasa Proteína Gráfico de actividad de polifenol oxidasa preclimaterio inicio climaterio máximo climaterio 0 S/envase Bolsa Caja PET Estadios Condiciones de Almacenamiento

12 Gráfico de actividad de peroxidasa. CUESTIONARIO: 1) Cómo actúan las polifenoloxidasa en los frutos y vegetales? 2) Qué función fisiológica tienen estas enzimas en los productos vegetales? 3) En qué productos vegetales se encuentran presentes estas enzimas más frecuentemente? 4) La actividad de estas enzimas cambia con la maduración? Por qué? 5) Qué sustratos para estas enzimas se encuentran presentes en su producto? 6) La actividad de estas enzimas cambia con las condiciones de almacenamiento? Por qué razón? Explique. 7) Qué importancia tiene el conocer la actividad de polifenoloxidasa y peroxidasa bajo diferentes condiciones de almacenamiento? 8) Sería benéfico o contraproducente la inhibición de estas enzimas durante el proceso de los productos vegetales? 9) En qué casos es deseable la acción de estas enzimas y en que casos no lo es? 10) Qué métodos crees que inhiben la acción de estas enzimas? Proponga una metodología para inhibirlo para el caso de su producto. 11) Por qué es importante la inhibición de estas enzimas en los procesos industriales? 12) Qué otras enzimas sería importante determinar en productos vegetales? por qué razón? 13) Qué métodos para la determinación de actividad enzimática existen? Descríbalos. 14) Qué otros métodos para la determinación de proteína en productos vegetales conoce? Qué ventajas y desventajas tiene el método de Lowry contra otros métodos utilizados para determinar proteína? 15) Explique el principio del funcionamiento del espectrofotómetro? 16) A qué se debe el aumento en la absorbancia durante la determinación de la actividad de estas enzimas? 17) Investigue que tipo de compuestos se determinan en el intervalo del espectro de 420, 485 y 750 nm y si corresponde al intervalo utilizado para la determinación en la práctica. REPORTE POR EQUIPO: Antecedentes: Breve Información relativa al producto con el cual se trabajo, fundamentos de las técnicas utilizadas. Resultados: Tablas que contengan los resultados obtenidos en cada determinación, CÁLCULOS, análisis de estos y discusión con respecto a lo que se encuentra reportado en la bibliografía. Cuestionario. Bibliografía consultada

13 REFERENCIAS Cano, MP0; Marín, MA & Fúster, C (1997) Differences among Spanish and Latín-American banana cultivars: morphological, chemical and sensory characteristics. Food Chemistry, 59: Lowry, O. H., Rosebrough, N.J., Farr, A. L., & Randall, R.J. (1951) Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: Park K. Y., Sato H.H., Almeida D. T. & Moretti H. R. (1984) Polyphenol oxidase of mango (Mangifera indica var. Haden) J. Food Science, 45: Robinson, P. S; Loveys, BR. & Chacko E K. (1993) Polyphenol Oxidase Enzymes in the Sap and Skin of Mango Fruit Australian J. Plant Physiology, 20: Sakharov Y. I., Bautista A. G., Sakharova V. I., Rojas A. & Pletjuschkina Y. O.(1999) Peroxidasa de plantas tropicales Revista colombiana de química. 28, 1 : Sharma R.,R., Goswami M.A, Singh N.C., Chhonkar P.O. & Singh Gyanendra (2001) Catecholase and cresolase activities and phenolic content in mango (Mangifera indica L.) at panicle initiation. Scientia Horticulturae, 87: Sharma R.,R., Sharma, H.C; Goswami M.A (1994) Polyphenol oxidase activity and phenolic content pattern during shoot development of grape in different growing seasons. J. Plant Biochem. Biothechnol, 3 (2): Selvara Y. & Kumar R. (1989) Studies on fruit softening enzymes and polyphenol oxidase activity in ripening Mango (Mangifera indica L) fruit, J. Food Science and Technology, 26(4): Vamos-Vigyazo,L.(1981). Polyphenol oxidase and peroxidase in fruits and vegetables. CRC Critical Review of Food Nutrition, 15: Vaughn C.,K & Duke O., S (1984). Function of polyphenol oxidase in higher plants. Physiology Plant, 60: Vela G; León M. D; García S. H; & De la Cruz J. (2003) Polyphenoloxidase activity during ripening and chilling stress in Manila mangoes, Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 78,1:

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